我国山西老陈醋酿造历史悠久，其以高粱为原料，大曲为糖化剂，经“蒸、酵、熏、淋、陈”等工序酿造而成[1]，色泽红棕、有光泽，独具“酸、绵、甜、香、鲜”的特色，含有丰富的氨基酸[2]、有机酸[3]、糖类[4]、维生素、川芎嗪、总黄酮以及多种挥发性风味物质[5]等营养成分。
黄酮类物质具有高效的抗氧化、清除自由基的能力[6]，具有防止衰老、抗菌、抗肿瘤、保护心血管和肝脏等多种保健和药用功能[7-9]。单宁类物质具有较好的抗氧化活性[10]，可预防衰老、保护心血管、抗炎、抗自由基、抗病毒[11-13]等。山西老陈醋中少量单宁可强化酸味，但过多的单宁会带来苦涩味，且与醋中铁离子及蛋白质等物质形成沉淀[14]，增加山西老陈醋浊度，进而影响山西老陈醋品质。
传统山西老陈醋酿造工艺存在机械化程度低、劳动强度大、生产效率低、能耗大、污染环境、实现标准化困难等缺陷。因此，在保证山西老陈醋优良品质的前提下，山西紫林醋业股份有限公司深入研究山西老陈醋的发酵技术，率先开发应用于全套机械化生产的设备，包括不锈钢糖化罐（替代传统甑式蒸粮）、信息化温控型酒精发酵罐（替代传统瓷缸发酵）、机械化翻倒醅设备（替代传统手工翻醅倒醅）、旋转式蒸汽熏醅罐（替代传统瓮缸地炕煤烟火熏醅）、不锈钢淋醋池和储罐（替代地池淋醋储存）。结合传统发酵过程控制经验，利用现代食品生产管理方式和自动化控制理论方法，建立山西老陈醋从原料、生产到产品的机械化生产工艺[15-16]。本研究对传统、机械化两种工艺酿造山西老陈醋过程中总黄酮及单宁含量的动态变化进行跟踪检测，以了解不同工艺酿造山西老陈醋过程中总黄酮及单宁含量的变化，为实现酿醋技术和设备的改良及应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；芦丁标准品（纯度为98%）：南京森贝伽生物科技有限公司；单宁酸（纯度为98%）：德国默克公司；二甲基甲酰胺、柠檬酸铁铵（均为分析纯）：天津市光复精细化工研究所。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
TARTER3100CpH计：上海奥豪斯仪器有限公司；T3202分光光度计：太原市瑞佳科学器材有限公司；78-1型磁力加热搅拌器：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；AR124CN电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；AXTGL16M台式高速冷冻离心机：山西鑫莱达科学器材有限责任公司。
1.3 方法
1.3.1 山西老陈醋酿造工艺及操作点
操作要点[17]：将高粱粉碎为粗粉，加入80%～120%水（以高粱质量计，下同），润料8～14 h，使高粱充分吸收水分，入缸（机械化工艺入灌）进行酒精发酵。酒精发酵前2 d为敞口发酵，随后封缸（封灌）进入养醪期。酒精发酵结束后，加入100%麸皮、100%谷糠及40%稻壳进行拌醅，随后入缸（入池）进行堆积，将发酵至第2天的醋醅作为火醅接入新醅中进行醋酸发酵，每天定时进行倒缸翻醅，使醋醅松散，为醋醅中好氧微生物醋酸菌的生长繁殖提供充足氧气，待醋醅酒精度下降至0.2%vol时开始熏蒸，传统工艺采用地炕加热的方式熏烤，温度80～90 ℃，每天依次倒缸，4～5 d后醅子变为黑紫色。机械化工艺将醋醅倒入熏醅罐中利用天然气进行加热，温度可达95 ℃以上，12 h后醅子变为黑紫色。采用套淋的方式进行淋醋，所得淋醋即为新醋。
1.3.2 取样
两种发酵工艺均跟踪三批，每批取样方式如下：
酒精发酵阶段：传统发酵工艺中，酒精发酵周期为15 d，分别在第0、2、6、10、15天选取3个发酵缸取样，混匀；机械化发酵工艺中，酒精发酵周期为8 d，分别在第0、2、4、6、8天在2个发酵罐中分别取样，混匀。
醋酸发酵阶段：传统发酵工艺中，醋酸发酵周期为10 d，分别在第0、2、4、6、8、10天在30个发酵缸中分别取样，混匀；机械化发酵工艺中，醋酸发酵周期为14 d，分别在第0、2、4、6、8、10、12、14天在发酵池中分三个点定点取样，最后一天的醋醅即为成醅。
熏醅阶段：传统工艺熏蒸4 d，每天倒缸混匀后取样；机械化工艺熏蒸12 h，熏蒸结束，倒入淋醋池，淋醋前取样，即为熏醅。
淋醋阶段：待淋醋结束后，搅拌均匀取样，即为新醋。
1.3.3 分析检测
总黄酮含量的测定[18]：参照GB/T 19777—2013《地理标志产品山西老陈醋》方法进行测定。以吸光度值（y）为纵坐标，芦丁标准品溶液的质量浓度为横坐标（x），绘制芦丁标准工作曲线，经线性拟合得回归方程y=0.444 9x-0.000 2，相关系数R2=0.999 9。依据标准曲线回归方程计算样品中总黄酮含量，结果以mg/100 mg计。
单宁含量的测定[19]：参照GB/T 15686—2008《高粱单宁含量的测定》方法进行测定。以吸光度值（y）为纵坐标，单宁酸标准品溶液的质量浓度为横坐标（x），绘制单宁酸标准工作曲线，经线性拟合得回归方程y=1.308 9x+0.181 6，相关系数R2=0.999 2。依据标准曲线回归方程计算样品中单宁含量，结果以mg/100 mg计。
2 结果与分析
2.1 酒精发酵阶段中总黄酮及单宁含量的变化
由图1可知，传统工艺酿造山西老陈醋的酒精发酵时间为15 d，机械化工艺酿造山西老陈醋的酒精发酵时间为8 d。两种工艺酿造山西老陈醋酒精发酵前2d，总黄酮含量增长较快，在第2天时，其含量均达到最高点，分别为39.51 mg/100 g、38.17 mg/100 g。而随着发酵时间的继续延长，总黄酮含量基本趋于稳定状态。分析原因可能是，前2 d均为敞口发酵，此时酵母菌等微生物处于快速生长繁殖阶段[20]。第2天进行封缸酒精发酵，微生物进入旺盛时期，此阶段总黄酮可能来源于高粱等原料，也可能来源于醋酸菌等微生物的代谢产物[20]。在酒精发酵第2天，原料中黄酮类物质已基本溶出，致使后期总黄酮含量变化基本趋于稳定状态，发酵结束后两种工艺的总黄酮含量均为为37.08 mg/100 g，与第2天总黄酮含量无明显差异（P＞0.05）。
图1 传统（A）及机械化（B）工艺酿造山西老陈醋酒精发酵阶段总黄酮及单宁含量的变化
Fig.1 Changes of total flavone and tannin contents in Shanxi aged vinegar brewed by traditional (A) and mechanized (B)process during alcohol fermentation
不同小写字母表示发酵过程中差异显著（P＜0.05）。下同。
由图1亦可知，两种工艺酿造山西老陈醋酒精发酵阶段，单宁含量均呈现先上升后下降的趋势，分别在发酵10 d、4 d时，单宁含量最高，分别为41.13 mg/100 g、43.67 mg/100 g。分析原因可能是，高粱中富含丰富的单宁，随着酒精发酵时间的延长，可溶性单宁逐渐释放[21]。后期单宁含量下降一方面可能因为随着发酵时间继续延长，可溶性单宁经过缩合、凝聚转变为不溶性单宁，致使单宁溶解度下降，酒醪中单宁含量下降。另一方面也可能是因为后期酵母菌大量繁殖，开始分解糖类，致使单宁含量下降[21]。
2.2 醋酸发酵阶段总黄酮及单宁含量的变化
由图2可知，传统工艺酿造山西老陈醋的醋酸发酵时间为10 d，机械化工艺酿造山西老陈醋的醋酸发酵时间为14 d。两种工艺酿造山西老陈醋醋酸发酵过程中总黄酮含量变化趋势一致，均呈先升高后趋于稳定的趋势，分别在发酵4 d、2 d时，总黄酮含量最高，分别为84.38 mg/100 g、74.02 mg/100 g。这是由于在醋酸发酵阶段拌入麸皮、稻壳等辅料，这些原辅料中也含有总黄酮物质；且此阶段醋酸菌等微生物开始迅速生长繁殖，所以此阶段总黄酮可能来源于麸皮等原料，也可能来源于醋酸菌等微生物的代谢产物或其代谢产物促使其他多酚类物质转化为黄酮类物质[22]。在醋酸发酵阶段，传统工艺酿造山西老陈醋的总黄酮含量高于机械化工艺，可能是因为传统酿造工艺在发酵过程中采用手工翻醅的方式，这可使物料更好地实现翻醅，有利于醋醅中各种微生物的繁殖。
由图2亦可知，随着发酵时间的延长，单宁含量整体呈现上升趋势。在醋酸发酵过程中受外界环境的影响，酚类前体物质不断氧化、络合形成单宁，同时醋酸菌等微生物快速生长繁殖，加速醋酸反应速率进而使得单宁含量增加[23]。传统发酵条件下单宁含量持续上升且上升明显。而在机械工艺发酵条件下，发酵后期单宁含量变化趋势较为缓慢。可能是因为传统工艺采用手工翻醅的方式，利于空气中氧的进入，从而更加利于醋酸菌等好氧微生物生长繁殖，致使单宁含量上升速率较快。
图2 传统（A）及机械化（B）工艺酿造山西老陈醋醋酸发酵阶段总黄酮及单宁含量的变化
Fig.2 Changes of total flavone and tannin contents in Shanxi aged vinegar brewed by traditional (A) and mechanized (B)process during acetic fermentation
2.3 成醅、熏醅与新醋总黄酮及单宁含量的变化
由图3可知，与醋酸发酵结束后成醅中总黄酮含量相比，经过熏蒸后，总黄酮含量呈现突变型增长（P＜0.05）。分析原因可能是在加热过程中醋醅中的糖类物质与氨基化合物（氨基酸、蛋白质等）发生美拉德反应，生成酮等还原性中间产物[24]；由于持续加热，微生物死亡并发生溶菌，胞内物质的释放[24]。与熏醅相比，经过酿造后所得新醋中总黄酮含量均有所下降（P＜0.05），分析原因可能是熏醅中有部分黄酮类物质难溶于水。对比两种不同工艺，醋酸发酵结束后，传统工艺成醅中总黄酮含量（85.57 mg/100 g）大于机械化工艺成醅（72.67 mg/100 g）。但经过熏蒸后，机械化工艺熏醅中总黄酮含量（131.01 mg/100 g）大于传统工艺熏醅（115.66 mg/100 g），这可能是因为机械化熏蒸方式温度及压力高，可促使成醅中黄酮类物质释放，同时促进其他多酚类物质转化为黄酮类物质[25]。经过套淋后，机械化工艺酿造新醋中总黄酮含量（108.52 mg/100 g）大于传统工艺酿造新醋（96.17 mg/100 g）。
由图3亦可知，不同工艺成醅经过熏蒸后，单宁含量均明显下降（P＜0.05），可能是因为高温高压促使可溶性单宁缩合、凝聚，使部分可溶性单宁转化为不可溶性单宁物质，也可能是因为部分单宁与蛋白质、大分子多糖物质结合形成复合物。对比两种工艺，机械化工艺熏醅后单宁含量为63.26 mg/100 g，较成醅中单宁含量（82.37 mg/100 g）下降幅度较大，说明高温高压方式更利于单宁类物质减少。同时，两种工艺所酿造山西老陈醋中单宁含量分别为86.11 mg/100 g、51.06 mg/100 g，较熏醅下降，分析原因可能是此过程中单宁类物质可能发生水解，生成多元醇等物质或发生聚缩，生成不溶于水的沉淀[25]。两种工艺所酿造新醋中单宁含量下降程度无明显差异。
图3 传统（A）及机械化（B）工艺酿造山西老陈醋成醅、熏醅及新醋总黄酮及单宁含量的变化
Fig.3 Changes of total flavone and tannin contents in fermented grains,fumigation fermented grains and fresh vinegar of Shanxi aged vinegar brewed by traditional (A) and mechanized (B) process
3 结论
本研究对传统、机械化工艺酿造山西老陈醋过程中总黄酮及单宁含量变化情况进行跟踪检测。结果表明，总黄酮含量在酒精发酵、醋酸发酵及熏醅阶段总黄酮含量持续上升，新醋略有所下降。与传统工艺相比，机械化工艺可在熏醅阶段迅速增加总黄酮含量；传统工艺成醅经过熏醅阶段后，黄酮含量仅提高30.09 mg/100 g，而采用机械化工艺黄酮含量可提高58.34 mg/100 g。单宁含量在酒精发酵阶段呈现先上升后下降趋势，在醋酸发酵阶段持续上升，但在熏醅及新醋中显著下降。与传统工艺相比，机械化工艺醋酸发酵过程中单宁含量上升速度较慢，成醅中单宁含量较传统工艺成醅中含量低34.16 mg/100 g，且经过熏醅阶段单宁含量进一步下降。因此，采用机械化工艺且高温、高压熏蒸方式有利于黄酮类物质积累同时可降低单宁含量，减少影响山西老陈醋浊度因素。本研究为提高山西老陈醋功效成分及降低山西老陈醋浊度，提高品质提供参考方向。
[1]杨常伟，杨小明.山西传统酿醋工艺的传承与发展[J].广西民族大学学报（自然科学版），2018，24（1）：37-42.
[2]沈志远，孙乐六，夏蓉，等.功能性镇江香醋的研究与产业化探讨[J].中国调味品，2012，37（9）：5-7.
[3]BUDAK N H,AYKIN E,SEYDIM A C,et al.Functional properties of vinegar[J].J Food Sci,2014,79(5):757-764.
[4]陈树俊，张君梅，李佳益，等.杂粮功能醋粉体内降血脂，辅助降血糖和抗氧化作用[J].食品科学，2019，40（13）：155-160.
[5]程程.山西老陈醋风味分析及品质改良[D].天津：天津科技大学，2018.
[6]陈怡，范茹茹，吴凯，等.不同酿造醋的抗氧化性能的对比研究[J].激光生物学报，2020，29（3）：281-289.
[7]冯涵，李娜，王华林，等.藤茶中黄酮类成分的功效研究进展[J].公共卫生与预防医学，2018，29（1）：82-86.
[8]叶巧旦，薛亚倩，谢蔚鹏.黄酮类物质对心血管系统的作用研究综述[J].中国乡村医药，2014，21（21）：81-82.
[9]CHUN O K,CHUNG S J,CLAYCOMBE K J,et al.Serum C-reactive protein concentrations are inversely associated with dietary flavonoid intake in U.S.adults[J]. J Nutr,2008,138(4):753-760.
[10]李蕊蕊.葡萄酒酿造过程中单宁的变化规律[D].济南：齐鲁工业大学，2016.
[11]李蕊蕊，赵新节，孙玉霞.葡萄和葡萄酒中单宁的研究进展[J].食品与发酵工业，2016，42（4）：260-265.
[12]卢鑫，李晓乐.柿叶中化学成分及其药理作用研究[J].化学教育，2016，37（24）：5-9.
[13]YANG L,WANG X,YANG X.Possible antioxidant mechanism of melanoidins extract from Shanxi aged vinegar in mitophagy-dependent and mitophagy-independentpathways[J].J Agric Food Chem,2014,62(34):8616-8622.
[14]郎繁繁，杨文飞，闫裕峰，等.基于HACCP 的山西老陈醋机械化酿造工艺标准化研究[J].中国酿造，2019，38（7）：161-167.
[15]张文斌，曹逸群，张萌萌，等.单宁的理化性质及其应用研究[J].西部皮革，2014，34（14）：24-29.
[16]郎繁繁，田莉，梁楷，等.老陈醋机械化固态醋酸发酵生产工艺：CN106635735A[P].2020-05-12.
[17]周景丽，郝静凤，赵彦淳，等.醋糟续米查回活醋酸发酵生产陈醋工艺的研究[J].中国酿造，2018，37（5）：114-119.
[18]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 19777—2013 地理标志产品山西老陈醋[S].北京：中国标准出版社，2013.
[19]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 15686—2008 高粱单宁含量的测定[S].北京：中国标准出版社，2008.
[20]陈树俊，苏静，刘诚，等.老陈醋生产过程中总多酚，总黄酮含量及清除DPPH 自由基能力的分析[J].食品科学，2009，30（17）：158-162.
[21]郭敏.酚类物质在柿醋发酵过程中变化规律研究[D].西安：陕西师范大学，2011.
[22]JIANG Y,ZHANG H,QI X,et al.Structural characterization and antioxidant activity of condensed tannins fractionated from sorghum grain[J].J Cereal Sci,2020,92:102918.
[23]李特，宋见喜，张卓睿，等.缩合单宁降解方法研究进展[J].林产化学与工业，2020，40（5）：10-16.
[24] XIE X,ZHENG Y,LIU X,et al.Antioxidant activity of Chinese Shanxi aged vinegar and its correlation with polyphenols and flavonoids during the brewing process[J].J Food Sci,2017,82(10-12):2479.
[25]郭李云.山西老陈醋熏醅抗氧化和抑菌活性研究[D].太原：山西大学，2016.