百香果（Passiflora edulis Sims）是西番莲科西番莲属的草质藤本植物，又称为鸡蛋果、西番莲、巴西果、情人果等[1]，在我国广泛种植于云南、广西、海南等地。近年来国内外研究发现，百香果中含有大量生物活性成分，如黄酮类、生物碱类[2]等，具有抗炎[3]、抗氧化[4]、降糖[5]、抗焦虑[6]和抗衰老[7]等功效。百香果汁颜色为金黄色，香味浓郁，含有17种氨基酸、维生素、微量元素等160多种有益成分[8-12]。国内对百香果果酒研究较多，有直接发酵酿造的百香果果酒[13-15]，有百香果和其他果蔬复配酿造的果酒[16-19]，有百香果和辣木提取物[20-21]、荞麦[22]、灵芝[23]酿造的果酒，但通过百香果和葡萄混酿的果酒鲜有报道。
葡萄为葡萄科葡萄属木质藤本植物，富含蛋白质、糖、有机酸、维生素及矿物质等多种营养成分，成熟后的葡萄糖酸比平均在40左右，具有高糖低酸的特性[24]，特别适合加工果酒，葡萄酒工艺成熟具有极高的生物价值，深受国内外的喜爱和熟知，是热销的产品。
百香果果汁含有丰富的营养物质，且清香味浓郁，但酸度较高，影响了百香果酒的开发。将葡萄加以混酿，中和口感，缓解百香果汁的酸味，使营养物质得到充分利用，解决了人为添加甜味剂造成的感官品质下降，同时形成了独特的果香味葡萄酒。百香果作为云南省部分地区的重点扶贫项目，产量、产值逐年扩大，开发葡萄百香果酒产品对拉动云南省经济增长、提高百香果利用价值、减少鲜果积压浪费具有重要意义。本研究立足云南葡萄和百香果的产量、质量优势，通过复合菌种发酵，开发出一款具有葡萄、百香果果味、酸甜适中、口感清爽的风味果酒，为生产高品质的果酒提供一定的理论基础，同时对云南水果产业的健康发展具有一定的推动作用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
百香果、葡萄：市售；混合菌种（葡萄酒活性干酵母∶耐高温活性干酵母=1∶1）：安琪酵母有限责任公司；纤维素酶（50 U/mg）、果胶酶（500 U/mg）：湖南新鸿鹰生物工程有限公司；碳酸钙（食品级）：河南万邦实业有限公司。
1.2 仪器与设备
WZB数显折光仪：上海仪电物理光学仪器有限公司；PHS-3CW数显pH计：杭州德为仪器有限公司；M277465酒精测量仪：河北青县仪器有限公司；SC-60分光光度计：广东冰天制冷设备有限公司；HH-2恒温水浴锅：常州亿通分析仪器有限公司；HPX-9272ME恒温培养箱：上海博讯实业有限公司；WT20002电子天平：杭州万特衡器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 葡萄百香果酒发酵工艺流程及操作要点
原料处理：将成熟百香果和葡萄清洗，葡萄榨汁100目纱布过滤，百香果去皮取果肉与水按质量比1∶1混合打浆。
酶解：添加0.1%的果胶酶和纤维素酶，45 ℃酶解2 h。
过滤：100目纱布过滤后与葡萄汁混合均匀。
加料：添加蔗糖调整混合汁初始糖度，碳酸钙调节适合酵母发酵的酸度，pH值至3.5左右为宜。
杀菌：调整混合汁基质中SO2含量至50 mg/kg。
活化酵母：混合菌种于10倍温水中，35 ℃水浴锅活化0.5 h后添加0.4%至果汁混合液中。
发酵：在一定温度条件下的恒温培养箱发酵一定时间。
离心、陈酿：发酵后的果酒4 000 r/min离心15 min，在15 ℃条件下陈酿10 d。
1.3.2 葡萄百香果酒酿造工艺优化
通过单因素试验研究果汁比例（葡萄汁与百香果汁体积比）（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5）、初始糖度（21°Bx、22°Bx、23°Bx、24°Bx、25°Bx）、发酵温度（21 ℃、22 ℃、23 ℃、24 ℃、25 ℃）、发酵时间（5 d、6 d、7 d、8 d、9 d）对葡萄百香果酒感官评分和酒精度的影响，在单因素试验的基础上，结合二次通用旋转组合试验对葡萄百香果酒工艺进行优化，确定最佳工艺及配方。二次通用旋转组合分析因素和水平见表1。
表1 葡萄百香果酒酿造工艺优化二次通用旋转组合试验的因素与水平
Table1 Factors and levels of second universal rotating combination experiments for grape-passion fruit wine brewing process optimization
1.3.3 测定方法
葡萄百香果酒感官评定：邀请10名专业人士从外观、滋味、香气、典型性四个方面参照GB/T 15037—2006《葡萄酒》的要求，建立百香果葡萄复合果酒感官评分标准，满分100分，感官评分标准见表2。
表2 葡萄百香果酒感官评分标准
Table 2 Sensory scoring standards of grape-passion fruit wine
酒精度：按照GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》方法测定；总酸：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定；糖度：手持糖度仪测定；总糖含量：按照二硝基水杨酸法（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）测定；pH值：使用pH计测定；细菌菌落数：按照平板计数法测定；大肠菌群：按照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》中MPN计数法执行；沙门氏菌：按照GB 4789.4—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》方法测定；金黄色葡萄球菌：按照GB 4789.10—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》方法测定。
1.3.4 数据处理
采用Excel 2.16对试验验数据进行整理，Origin 8.5绘图，SPSS 20.0软件进行数据统计分析，结果用“平均值±标准差”表示，DPS 7.05软件对数据进行二次通用旋转设计与分析。
2 结果与分析
2.1 葡萄百香果酒酿造工艺优化单因素试验
2.1.1 果汁配比对葡萄百香果酒酒精度和感官评分的影响
由图1可知，随着百香果汁比例的增加，葡萄百香果酒的感官评分呈现先升高后降低的趋势，在葡萄汁∶百香果汁配比为1∶3（V/V）达到最高，感官评分为（92.6±1.6）分。此时，产品百香果味浓郁、葡萄的后甘味纯正，感官品质最佳，随着百香果汁添加比例的增加，百香果的味道掩盖了葡萄风味，果酒偏酸，后味寡淡。不同果汁配比条件下，酒精度呈现逐步增加的趋势，且后期趋于平稳，可能是因为加入百香果汁中含有氨基酸、维生素、微量元素给酵母增加了营养物质，从而导致酒精度升高。综合比较分析最终选择葡萄汁与百香果汁配比为1∶3（V/V）。
图1 果汁配比对葡萄百香果酒的酒精度和感官评分的影响
Fig.1 Effect of juice ratio on alcohol content and sensory evaluation of grape-passion fruit wine
2.1.2 不同初始糖度对葡萄百香果酒酒精度及感官评分的影响
由图2可知，随着初始糖度的升高，葡萄百香果酒的感官评分呈现先升高后降低的趋势，在初始糖度为23°Bx时，葡萄百香果酒感官评分最高为91分。随着初始糖度的继续升高，感官评分降低，这是由于初始糖度的升高，导致发酵体系的渗透压增加，一定程度抑制了酵母发酵能力，造成其发酵变慢，产品甜度过高，果酒口味寡淡，这与曹丽娟等[25]的研究结果一致。葡萄百香果酒酒精度随初始糖度的升高的变化趋势与感官评分类似，初始糖度为24°Bx时，酒精度最高为12.5%vol，初始糖度为23°Bx时，酒精度为12.3%vol，与初始糖度为24°Bx时相差不大。因此综合考虑感官评分和酒精度，确定最佳的初始糖度为23°Bx。
图2 不同初始糖度对葡萄百香果酒的酒精度和感官评分的影响
Fig.2 Effect of different initial sugar contents on alcohol content and sensory evaluation of grape-passion fruit wine
2.1.3 不同发酵温度对葡萄百香果酒酒精度及感官评分的影响
由图3可知，随着发酵温度的升高，葡萄百香果酒感官评分呈现先升高后降低的趋势，发酵温度23 ℃时感官评分达到最高为（93.2±1.4）分，此温度条件下葡萄百香果酒符合果酒标准，口感柔顺，具备独特的果酒风味。酒精度随发酵温度变化，也呈现先升高后降低的趋势，在发酵温度24 ℃时，酒精度达最高为12.3%vol，可能是由于随着温度的升高达到酵母的最适发酵温度，乙醇产量增加。趋势下降可能是由于温度继续升高，酵母生长旺盛，营养物质用于自身生长分化，乙醇产量减少[26]。所以综合考虑感官评分和酒精度，最终选择发酵温度为23 ℃。
图3 不同发酵温度对葡萄百香果酒的酒精度和感官评分的影响
Fig.3 Effect of different fermentation temperature on alcohol content and sensory evaluation of grape-passion fruit wine
2.1.4 不同发酵时间对葡萄百香果酒酒精度及感官评分的影响
由图4可知，感官评分随发酵时间的延长，呈现出先升高后降低的趋势，第7天时达到最高为（89.4±1.5）分，上升趋势是由于酵母菌逐渐发酵达到最适时间，形成最佳的果酒风味，下降趋势可能是由于发酵时间过长代谢产物CO2增多，溶于果酒导致偏酸，感官评分下降，这与王登宇等[27]研究结果一致。酒精度随时间的延长，呈现出先上升后基本不变的趋势，第7天酒精度为12.3%vol，上升趋势可能由于酵母菌繁殖旺盛，发酵速率较快，酒精度不断增加。稳定趋势可能是由于发酵时间长，酵母菌生长达到稳定期，产酒能力达到最大值，酒精度不再增加，与菌种先增长后趋于稳定的生长曲线的趋势相呼应[28]，这与程宏桢等[26]的研究结果类似。所以综合果酒的感官评分和酒精度，选择发酵时间为7 d。
图4 不同发酵时间对葡萄百香果酒的酒精度和感官评分的影响
Fig.4 Effect of different fermentation time on alcohol content and sensory evaluation of grape-passion fruit wine
2.2 葡萄百香果酒酿造工艺优化二次通用旋转组合试验
2.2.1 二次通用旋转回归组合试验
通过DPS7.05软件对表3试验结果进行分析，并得到以感官评分为目标的二次回归模型方程：
表3 葡萄百香果酒酿造工艺优化二次通用旋转试验结果与分析
Table3 Results and analysis of second universal rotating combination experiments for grape-passion fruit wine brewing process optimization
2.2.2 模型建立与显著性检验
由表4可知，F1=2.088 96＜F0.05（5，5）=5.05，失拟项差异不显著，未知因素对试验结果影响较小。对回归模型进行拟合检验F2=7.724 72＞F0.05（9，10）=3.13，达到极显著水平，说明方程与实际情况拟合良好，预测值跟实际值吻合相当好，能反映感官评分与果汁比例、发酵温度、初始糖度的关系。对回归系数显著性检验表明，一次项X2，交互项X1X2、X1X3、X2X3均未达到显著水平，但二次项系数具有相关性，因此在这些微弱的交互项原则上不能删除。在a=0.10显著水平剔除不显著项简化后的回归方程：
表4 二次通用旋转试验结果方差分析
Table4 Analysis of variance of second universal rotating combination experiment results
注：P＜0.05表示对结果影响差异显著；P＜0.01表示对结果影响差异极显著。
通过二次通用旋转组合试验建立的回归方程的偏回归系数的绝对值大小可以判断出各个因素对感官评分的影响大小顺序：初始糖度（X3）＞果汁比例（X1）＞发酵温度（X2），且均为正效应。
2.3 验证试验
以零水平的平均值84.25为临界值，获得大于临界值的28个方案，各变量取值的频率分布见表5。
由表5可以看出，在95%的置信区间感官评分大于84.25的优化方案为：果汁比例1∶3.543～1∶4.109、发酵温度22.703～23.297 ℃、初始糖度23.646～24.149°Bx。为了满足实际化工业生产可将优化方案设为果汁比例1∶4（V/V）、发酵温度23 ℃、初始糖度24°Bx。对于此方案验证得到感官评分为84.35分，酒精度为12.3%vol，与优化方案的理论值接近，进一步证实了方案的可靠性。
表5 各变量取值的频率分布
Table5 Frequency distribution of values of each variable
2.4 产品质量
对最佳发酵工艺条件下的葡萄百香果酒进行卫生指标检测和感官评价，成品葡萄百香果酒具有浓郁百香果味及色泽金黄、透明澄清，富有光泽，无杂质酸甜适中、口感清爽。糖含量（3.08±0.38）g/L，总酸含量为（6.65±0.29）g/L，菌落总数≤30 CFU/mL，大肠菌群≤3 MPN/mL，致病菌未检出等卫生指标符合标准要求，即开发的葡萄百香果酒的符合产品要求、品质较佳。
3 结论
本试验对葡萄百香果酒的最佳发酵工艺参数进行了优化，结果表明，葡萄百香果酒的最佳发酵工艺参数为酵母添加量（葡萄酒活性干酵母∶耐高温活性干酵母=1∶1）为0.4%、葡萄汁∶百香果汁1∶4（V/V），初始糖度24°Bx、发酵温度23 ℃、发酵时间7 d，在此条件下，得到的葡萄百香果酒果味浓郁、色泽金黄、酸甜适中、口感清爽，感官评分为84.35分，其酒精度为（12.3±1.3）%vol，糖含量（3.08±0.38）g/L，总酸含量为（6.65±0.29）g/L，符合国家标准要求，是一款品质较佳的风味果酒。
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