目前我国约有70%的人群正处于“亚健康”状态，表现出睡眠紊乱、焦虑、记忆力下降、食欲不振等症状，多由神经紧张或精神压力过大，体内缺乏γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）所导致[1-2]。研究表明，GABA是动物体中枢神经系统中主要的抑制性神经递质，具有镇静安神、调节血压、改善睡眠、治疗糖尿病及改善肝、肾脏功能[3]等多种生理功效，人体每天摄入30～100 mg纯天然的GABA就能起到一定保健作用[4-5]。GABA在食品工业中的应用始于1986年，以日本茶饮料“Gabaron”为代表。随着近年来GABA的多种生理功能陆续被揭开，富含GABA食品的开发已成为国内外研究热点。目前，市场中常见产品有美国G'NITE公司的GABA睡眠软糖、澳洲Swisse公司的GABA胶原蛋白液等。相比之下，我国有关GABA食品研发起步较晚，国家卫生部并于2009年将GABA列入新资源食品原料目录[6]，因此，加快研发富含GABA相关食品和饮品，具有重要的研究和应用前景。
乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是食品安全级微生物（generally recognized as safe，GRAS）[7]，具有维持肠道平衡、改善乳糖不耐症及提高机体免疫力等特性[8]，常用于酸奶、奶酪等乳制品的生产加工[9]。其中，部分乳酸菌具有谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）活性，能够产生GABA，将二者结合可生产出富含GABA的乳制品[10]。如谢芳等[11]利用乳酸乳球菌研发出了具有镇静安神作用的GABA水牛乳酸奶；HAGI T等[12]利用乳酸乳球菌乳亚种01-7制备出降血压的GABA发酵乳。目前，富含GABA的乳酸菌饮料多以鲜乳[13-14]、麦胚[15]、南瓜[16]、香蕉[17]、苹果[18]、藜麦[19]、白刺果[20]、椰果[21]等为发酵基质，经产GABA乳酸菌发酵研制而成的发酵乳饮料中GABA含量约为0.1～1.2 g/L，普遍较低。
本研究利用分离自吉尔吉斯斯坦地区特色乳制品中的乳酸菌株戊糖乳杆菌（Lactiplantibacillus pentosus）Z6，通过一步发酵工艺得到富含GABA和丰富营养物的乳酸菌发酵饮料，通过与蜂蜜、碳酸钙和阿斯巴甜等配方的调配，结合模糊数学模型对其感官品质进行评定，对其口感、品质和稳定性进行了综合性评价，为富含GABA的功能性乳酸菌饮品的研发及产业化生产奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
戊糖乳杆菌（Lactiplantibacillus pentosus）Z6，分离筛选自吉尔吉斯斯坦地区特色乳制品，由新疆微生物资源保藏管理中心提供。
1.1.2 化学试剂
琼脂、羧甲基纤维素钠（carboxy methyl cellulose-Na，CMC-Na）、黄原胶、碳酸钙、阿斯巴甜（均为食品级）：上海源叶生物科技有限公司；蜂蜜：市售；蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、磷酸氢二钾、乙酸钠、柠檬酸氢二胺、硫酸锰、硫酸镁、盐酸（均为分析纯或生化试剂）：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
1.1.3 培养基
MRS肉汤、MRS琼脂培养基：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
发酵培养基：蛋白胨10 g，酵母粉10 g，葡萄糖20 g，磷酸氢二钾2 g，乙酸钠5 g，柠檬酸氢二铵2 g，硫酸锰0.04 g，硫酸镁0.2 g，纯净水1 000 mL，0.1 mol/L盐酸调节至pH值5.7左右。121 ℃灭菌15 min。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-1F超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；HVE-50自动高压灭菌锅：日本HIRAYAMA公司；UVZ2550紫外分光光度计：日本岛津仪器公司；PLCD高速冷冻离心机：德国Sigma公司；PHSJ-3F pH计：上海仪电科学仪器有限公司；AR224CN电子天平：上海奥豪斯仪器有限公司；HYW-2112全温度恒温调速摇床：上海智城分析仪器制造有限公司。
1.3 方法
1.3.1 功能性乳酸菌饮品的加工工艺流程及操作要点
菌种活化→种子培养液制备→发酵饮料制备→调配→灌装、封口→功能性乳酸菌饮品
操作要点：
菌种活化：将4 ℃斜面保藏的菌株Z6划线于MRS琼脂培养基上37 ℃培养1～2 d，得到活化的菌株Z6。
种子培养液制备：取上述活化菌株Z6转接至MRS肉汤培养基中，装液量为100 mL/200 mL，于37 ℃、160 r/min振荡培养24 h，得到菌株Z6种子培养液。
发酵饮料制备：将上述种子培养液转接至发酵培养基中，接种量4%（V/V），装液量为200 mL/500 mL，于37 ℃、160 r/min振荡培养，以发酵液中的GABA含量、乳酸菌活菌数及pH值趋于稳定为发酵终点，得到乳酸菌发酵饮料。
饮品调配：将蜂蜜、碳酸钙、阿斯巴甜按照一定配比添加到乳酸菌发酵饮料中，辅以琼脂、黄原胶、CMC-Na复合稳定剂进行均匀调配。
灌装、封口：将调配好的饮品灌装于经60Co-γ于30 kGy条件下辐射灭菌24 h后的瓶中并封口，得到功能性乳酸菌饮品。
1.3.2 功能性乳酸菌饮品配方优化
（1）单因素试验
固定碳酸钙添加量0.30%，阿斯巴甜添加量0.10%，考察蜂蜜添加量（3%、4%、5%、6%、7%）对感官品质的影响；选定蜂蜜添加量6%，阿斯巴甜添加量0.01%，考察碳酸钙添加量（0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%）对感官品质的影响；选定蜂蜜添加量6%，碳酸钙添加量0.30%，考察阿斯巴甜添加量（0.005 0%、0.007 5%、0.010 0%、0.012 5%、0.015 0%）对感官品质的影响。
（2）正交试验
在单因素试验的基础上，以蜂蜜添加量（A）、碳酸钙添加量（B）、阿斯巴甜添加量（C）为变量，以感官评分为考察指标，采用L9（34）正交试验设计，正交试验因素与水平见表1。
表1 功能性乳酸菌饮品配方优化正交试验因素与水平
Table1 Factors and levels of orthogonal experiments for formula optimization of functional lactic acid bacteria beverage
1.3.3 感官评价
随机挑选10名食品专业的老师及学生组成评定小组，采用不记名的方式，对饮料的色泽、气味、口感和组织状态[22]进行单独打分，统计总分并计算平均分[23]，满分10分，功能性乳酸菌饮品评定标准见表2。
表2 功能性乳酸菌饮品感官评价标准
Table2 Sensory evaluation standards of functional lactic acid bacteria beverage
1.3.4 模糊数学综合评价模型的建立[24]
对不同条件下乳酸菌饮品感官指标进行模糊数学综合评价，并建立评价集。
评价对象集X，代表9组感官评价的乳酸菌饮品集合，X={X1，X2，X3，X4，X5，X6，X7，X8，X9}。Xj代表9组乳酸菌饮品的综合评价，其中j=1，2，3···9。
评价因素集U={U1，U2，U3，U4}，即U={色泽，气味，口感，组织状态}。
评语集V={V1，V2，V3，V4}，代表每个因素的评语集合，即V={优，良，中，差}={10，8，5，2}。
权重集K={K1，K2，K3，K4}，由表1可知，K={0.2，0.3，0.3，0.2}。
1.3.5 稳定剂配比优化
（1）单因素试验
以离心沉淀率和稳定效率为评价指标，固定黄原胶添加量0.10%、CMC-Na添加量0.10%，考察琼脂添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）对稳定性的影响；固定琼脂添加量0.10%、CMC-Na添加量0.10%，考察黄原胶添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）对稳定性的影响；固定琼脂添加量0.10%、黄原胶添加量0.10%，考察CMC-Na添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）对稳定性的影响。
（2）正交试验
在单因素试验的基础上，以琼脂添加量、黄原胶添加量、CMC-Na添加量为变量，以离心沉淀率为评价指标，设计L9（34）正交试验，稳定剂配比优化正交试验因素与水平见表3。
表3 稳定剂配比优化正交试验因素与水平
Table3 Factors and levels of orthogonal tests for stabilizer ratio optimization
1.3.6 稳定性测定
以离心管取待测样品30 mL，并测定样品质量M0（g）后，以5 000 r/min离心15 min后取出，除去上清液，测残余物的质量M（g）。每个样品进行3次平行测定后取平均值。离心沉淀率计算公式如下[25]：
稳定效率的测定：取待测样品于比色皿，在600 nm波长下测定其吸光度值A0；取一定量样品，于5 000 r/min离心15 min，取其上清液在600 nm波长下测定其吸光度值A。每个样品进行3次平行测定后取平均值。稳定效率计算公式如下[26]：
1.3.7 贮藏期饮品的成分变化
在最佳配方及最佳稳定剂配比条件下，制备功能性乳酸菌饮品，在不同贮藏时间（0 d、30 d、60 d、90 d），常温储藏温度（20～25 ℃）条件下进行贮藏，取样分别测定饮品中活菌数、pH值、GABA含量，同时测定杂菌总数、大肠菌群数量、致病菌以及霉菌、酵母数量，得到贮藏期间饮品的成分变化。每个样品进行3次平行测定后取平均值。
1.3.8 分析检测方法
乳酸菌活菌数：按照国标GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》中平板计数法[27]；pH值：采用pH计；总酸度：参照文献[28]及国标GB/T 5009.239—2016《食品酸度的测定》[29]；游离氨基酸：参照文献[30]及国标GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》[31]；菌落总数、大肠菌群、霉菌、酵母及致病菌的检测：按照国标GB/T 4789.21—2003《食品卫生微生物学检验冷冻饮品、饮料检验》[32]。
1.3.9 数据处理
试验数据采用Microsoft Excel 2010、Minitab 17.0、Origin 8.0等数据处理软件进行整理及统计分析作图。
2 结果与分析
2.1 发酵过程中活菌数、GABA含量和pH值的变化
菌株发酵过程中活菌数、GABA含量及pH值变化见图1。由图1可知，在发酵前16 h，乳酸菌增长显著，此时GABA的合成较为缓慢，pH值则呈显著下降趋势；发酵24 h后，乳酸菌进入生长稳定期，其活菌数不再发生显著性变化，此时为GABA的主要合成期；而到了48 h，GABA含量不再发生显著性变化，同时发酵液的pH值也趋于稳定。因此，选择发酵时间为48 h，此时发酵饮料中的GABA含量为1.98 g/L，乳酸菌含量＞1×1010 CFU/mL，pH值为4.0左右，符合作为乳酸菌饮品基质的条件[33]。
图1 功能性乳酸菌饮品发酵过程中活菌数、γ-氨基丁酸含量和pH值的变化
Fig.1 Changes of viable bacterial count,γ-aminobutyric acid contents and pH value during fermentation process of functional lactic acid bacteria beverage
2.2 功能性乳酸菌饮品配方优化
2.2.2 正交试验
由10名感官评定人员对9组调配的功能乳酸菌饮品进行感官评价，其结果见表4。
将表4中各样品因素等级所得票数与总票数进行折算，得到模糊矩阵R。例如将样品1的模糊矩阵R1与权重集K合成得到样品1的综合评价集Y1为：
表4 功能性乳酸菌饮料的感官评定结果
Table4 Results of sensory evaluation of functional lactic acid bacteria beverage
将综合评价集Y1和评语集V合成得到样品1的感官得分W1，即W1=0.41×10+0.15×8+0.24×5+0.2×2=6.90。同理可得到W1、W2……W9。
2.2.1 单因素试验
蜂蜜添加量、碳酸钙添加量及阿斯巴甜添加量对感官得分的影响见图2。
图2 蜂蜜（A）、碳酸钙（B）及阿斯巴甜（C）添加量对功能性乳酸菌饮品感官评价的影响
Fig.2 Effect of honey (A),calcium carbonate (B) and aspartame (C) addition on sensory evaluation of functional lactic acid bacteria beverage
由图2A可知，当蜂蜜添加量为5%时，感官评分最高为（8.9±0.1）分。此时饮品的色泽呈均一的深褐色，同时具有浓郁的乳酸香气；随着蜂蜜添加量的增加，乳酸香气逐渐变淡，蜂蜜添加量过多时，蜂蜜甜味过浓，颜色逐渐变浅，呈浅褐色；蜂蜜添加量较低时，无明显蜂蜜味。经综合考虑，选取蜂蜜添加量为4%、5%、6%进行正交试验。
由图2B可知，当碳酸钙的添加量为0.30%时，感官评分最高为（8.8±0.15）分。此时饮品的色泽呈均一的深褐色，口感较好，同时具有浓郁的乳酸香气；随着碳酸钙添加量的增加，乳酸香气逐渐变淡，碳酸钙添加量过多时，乳酸味过淡，颜色逐渐变浅，呈深黄色；碳酸钙添加量较低时，口感较酸。经综合考虑，选取碳酸钙添加量为0.25%、0.30%、0.35%进行正交试验。
由图2C可知，当阿斯巴甜的添加量为0.010 0%时，感官评分最高为（9.1±0.09）分。此时的饮品酸甜可口，同时具有浓郁的乳酸香气；随着阿斯巴甜添加量的增加，乳酸味逐渐变淡，阿斯巴甜添加量过多时，口感过甜，并略有苦后味；阿斯巴甜添加量较低时，口感较酸。经综合考虑，选取阿斯巴甜添加量为0.007 5%、0.010 0%、0.012 5%进行正交试验。
以模糊数学评定法对正交试验各试验组的样品进行感官评价，结果见表5，方差分析结果见表6。
表5 功能性乳酸菌饮品配方优化正交试验结果与分析
Table5 Results and analysis of orthogonal tests of formula optimization for functional lactic acid bacteria beverage
由表5可知，各因素对饮品感官评分的影响顺序为蜂蜜添加量＞阿斯巴甜添加量＞碳酸钙添加量。最佳配方组合为A3B3C2，即蜂蜜添加量6%，碳酸钙添加量0.35%，阿斯巴甜添加量0.01%。在此最佳配比下进行3次平行验证试验，感官评分为最高8.52分。所得饮品色泽均一、酸甜可口、香气适宜、口感细腻。由表6可知，蜂蜜添加量对饮品感官评分影响显著（P＜0.05）；碳酸钙和阿斯巴甜对饮品感官评分影响不显著（P＞0.05）。
表6 功能性乳酸菌饮品配方优化正交试验结果方差分析
Table6 Variance analysis of orthogonal tests results of formula optimization for functional lactic acid bacteria beverage
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
2.3 稳定剂配比优化
2.3.1 单因素试验
琼脂添加量（A）、黄原胶添加量（B）、CMC-Na添加量（C）对稳定性的影响见图3。
图3 琼脂（A）、黄原胶（B）及CMC-Na（C）添加量对功能性乳酸菌饮品稳定性的影响
Fig.3 Effects of agar (A),xanthan gum (B) and CMC-Na (C) addition on stability of functional lactic acid bacteria beverage
由图3A可知，随着琼脂添加量在0.05%～0.25%范围内的增加，离心沉淀率呈现出逐渐升高的趋势。当琼脂添加量为0.05%时，此时的离心沉淀率达到最低，为（2.56±0.10）%。当琼脂添加量继续增加，离心沉淀率也随之增加。因此，选择0.05%、0.10%、0.15%3个水平进行正交试验优化。
由图3B可知，随着黄原胶添加量在0.05%～0.25%范围内的增加，离心沉淀率呈现出先降低后升高的趋势。当黄原胶添加量为0.15%时，此时的离心沉淀率达到最低，为（2.31±0.11）%。当黄原胶添加量继续增加，离心沉淀率也随之增加。因此，选择0.10%、0.15%、0.20%3个水平进行正交试验优化。
由图3C可知，随着CMC-Na的添加量在0.05%～0.25%范围内的增加，离心沉淀率呈现出逐渐降低的趋势。当黄原胶添加量为0.20%时，此时的离心沉淀率达到最低，为（2.35±0.12）%。当CMC-Na添加量继续增加，离心沉淀率也有所增加。因此，选择0.10%、0.15%、0.20%3个水平进行正交试验优化。
2.3.2 正交试验
在单因素试验的基础上，以离心沉淀率为主要评价指标，考察琼脂、黄原胶和CMC-Na添加量对功能性乳酸菌饮品稳定性的影响，正交试验结果与分析见表7，方差分析结果见表8。
由表7可知，各因素对饮品稳定性的影响顺序为CMC-Na添加量＞黄原胶添加量＞琼脂添加量。最佳稳定剂的配比组合为A2B3C2，即琼脂添加量0.10%，黄原胶添加量0.20%，CMC-Na添加量0.15%。在此最佳配比下进行3次平行验证试验，所得饮品的离心沉淀率为1.92%、稳定效率为68.18%。由表8可知，CMC-Na添加量对饮品稳定性影响显著（P＜0.05），琼脂和黄原胶添加量对饮品稳定性影响不显著（P＞0.05）。
表7 稳定剂配比优化正交试验结果与分析
Table7 Results and analysis of orthogonal tests for stabilizer ratio optimization
表8 稳定剂配比优化正交试验结果方差分析
Table8 Variance analysis of orthogonal tests results of stabilizer ratio optimization
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
综上所述，功能性乳酸菌饮品的最佳配方为：蜂蜜添加量6%，碳酸钙添加量0.35%，阿斯巴甜添加量0.01%，稳定剂最佳配比为：琼脂添加量0.10%，黄原胶添加量0.20%，CMC-Na添加量0.15%。
2.4 功能性乳酸菌饮品分析检测
对功能性乳酸菌饮品成品氨基酸进行分析检测，结果见见表9。
表9 功能性乳酸菌饮品氨基酸含量分析
Table9 Amino acid contents analysis of functional lactic acid bacteria beverage
续表
注：“*”表示必需氨基酸。
由表9可知，饮品中共检出游离氨基酸18种，除GABA外，还包括7种必需氨基酸；其中谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸及天氡氨酸等功能性氨基酸的含量均≥0.1 g/100 g。
2.5 贮藏期饮品的品质变化
将在上述最佳配方及稳定剂条件下制得的饮品成品置于常温（20～25 ℃）下贮藏，并对其进行监测，贮藏期间成品各项指标的监测结果见表10。由表10可知，随着贮藏时间的延长，乳酸菌活菌数的减少趋势较为显著，第30天时减少了约38%，第60天时减少了约80%，而到了第90天，其数量仍在108 CFU/mL以上；pH值则由4.46降低为3.65；而GABA含量则未发生明显变化，由此可见GABA含量未受到贮存时间的影响。
表10 贮藏期间成品各项指标的监测结果
Table10 Monitoring results of various indexes of finished products during storage
注：不同字母代表各数值间具有显著性差异（P＜0.05）。
2.6 功能性乳酸菌饮品质量指标
感官指标：饮品色泽均一、酸甜可口、香气适宜、口感细腻，感官评分为8.52分。
理化指标：蛋白质1.960 g/100 g，总酸19.160 g/kg，游离氨基酸（18种）1.82 g/100 g。
微生物指标：乳酸菌活菌数1.026×1010 CFU/mL；杂菌总数＜10 CFU/mL；大肠菌群＜3 MPN/100 mL；霉菌及酵母＜10 CFU/mL；致病菌未检出。
3 结论
本研究以色泽、香气、口感、组织状态为评价因素，结合正交试验设计，采用模糊数学模型对GABA乳酸菌饮品进行综合评判，最终得到饮品最佳配方为：以乳酸菌发酵饮料为基质，添加蜂蜜6%、碳酸钙0.35%、阿斯巴甜0.01%。此条件下得到的饮品色泽呈均一深褐色、酸甜可口、乳酸香气浓郁，感官评分为最高的8.52分；饮品稳定剂的最佳配比为：琼脂0.10%、黄原胶0.20%、CMC-Na 0.15%。在此条件下所得饮品的离心沉淀率为1.92%、稳定效率为68.18%，稳定性较高。采用上述配方条件制备的乳酸菌饮品中GABA的含量为1.98 g/L，乳酸菌活菌数达1.026×1010 CFU/mL，且其中富含多种其他氨基酸等益生因子，具有一定的保健功能且在常温下具有较好的贮藏性，为富含GABA的功能性乳酸菌饮品的产业化生产奠定坚实的基础。
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