燃料乙醇作为一种清洁的可再生能源，具有资源丰富、碳沉积少、减少温室气体排放等优点[1-3]。21世纪期初期我国开始发展燃料乙醇[4]，随着车用燃料乙醇方案的推广，燃料乙醇行业发展迅速，成为可再生能源的重要组成部分[5-8]。
燃料乙醇发酵主要原料包括谷物原料、薯类原料、糖质原料以及纤维素原料，其中淀粉质原料主要为玉米、小麦、水稻和木薯等[9-10]。随着燃料乙醇行业的迅速发展，原料逐渐由单一原料向混合原料转化[11-12]。近年来，随着粮食产量的增加，我国水稻和小麦库存量巨大，大量超期储存粮亟待处理[13]。超期储存小麦和水稻是长期（3年以上）储藏的粮食，由于霉变、真菌毒素和重金属超标等问题，一般用于燃料乙醇的生产[14-15]。小麦和水稻原料的利用，能够实现原料多元化的柔性生产，避免企业过度依赖玉米原料，有效缓解原料供应紧张的问题[16]，形成多种原料替代格局，增强企业活力和市场竞争能力，促进企业的长足、健康发展[17]。由于超标的小麦和水稻价格较低，通过优化处理等方式，能够降低企业生产成本，取得较好的经济效益，还能保证粮食安全[18]。
目前，燃料乙醇的研究热点主要聚焦在如何利用超期储存小麦、水稻等多种原料发酵生产燃料乙醇。刘劲松等[19]研究了脱壳水稻粉与玉米粉混合发酵，并对于发酵醪进行高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography，HPLC）分析，筛选出超期储存水稻添加比例40%时，淀粉出酒率最高。沈存忠等[20]研究了超期储存水稻脱壳率对于燃料乙醇生产的影响，发现将稻谷进行一定程度脱壳生产，有利于生产稳定进行且降低生产成本。孙振江等[21]对于以小麦为原料进行酒精发酵研究，优化了适用于小麦发酵的固形物含量、液化时间和酶加量。其他相关的研究还有很多，这些研究也为燃料乙醇生产提供了指导。基于以上的情况，结合酒精工厂现有生产工艺情况，该研究以耐高温酒用干酵母为发酵菌株，采用同步糖化发酵法，通过测定液化醪和发酵醪指标，优化了超期储存小麦和水稻混合发酵的辅料，为复合原料生产燃料乙醇提供参考价值。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
超强复配淀粉酶（13万U/g）、低pH淀粉酶（14万U/g）：诺维信（中国）生物技术有限公司；耐高温淀粉酶（18万U/g）、糖化酶（26万U/g）、酸性蛋白酶（10万U/g）：山东隆科特酶制剂有限公司；α-淀粉酶（14万U/g）：杰能科（中国）生物工程有限公司；蔚蓝木聚糖酶（3万U/g）、夏盛木聚糖酶（3万U/g）、挑战定制酶（5万U/g）分别为青岛蔚蓝生物股份有限公司、夏盛（北京）生物技术有限公司、北京挑战生物技术有限公司惠赠；耐高温酒用干酵母：安琪酵母股份有限公司；安菌泰杀菌剂：柳州龙泰科技有限公司；色谱标品均为色谱纯，其他试剂均为分析纯；超期储存水稻和小麦取自广西中粮生物质能源企业车间。
1.2 仪器与设备
ZHWY-2112F摇床：上海智城分析仪器制造公司；安捷伦1200型液相色谱：安捷伦科技公司；3-18K离心机：美国Sigma公司；KQ-800KDV超声清洗机：江苏省昆山超声仪器公司；WELCH 2546C-02真空泵：美国威尔奇公司；AL204分析天平：瑞士Mettler公司；DSH-50-10快速水分测定仪：上海越平科学仪器有限公司；NDJ-5S黏度计：上海精密仪器有限公司；液化罐、蒸馏冷凝装置：河南神泰公司定制；HWS-28水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；PHSJ-3F pH计：上海雷磁仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 燃料乙醇生产工艺流程及操作要点
操作要点：
小麦和水稻粉碎后均过20目筛网，按一定比例混合，加入保温70 ℃的混合水（清液∶工艺水∶中水比例为34∶51∶15），控制粉浆干物质含量30%左右，调节pH5.6，添加α-淀粉酶0.17 kg/t粮，进行拌料30 min。然后将温度升至90 ℃，液化120 min，整个液糖化和发酵流程具体参考文献[21]。
将液化醪降温至32 ℃，硫酸调节pH至4.2～4.4，装液量200 mL/500 mL，发利耐高温酒用干酵母接种量0.05%，糖化酶加量0.68 kg/t粮，酸性蛋白酶加量0.035 kg/t粮，安菌泰5 mg/L，转速100 r/min，发酵时间72 h。
发酵完成后，取100 mL成熟醪，加入100 mL去离子水，混合均匀后用蒸馏冷凝装置蒸酒；蒸酒后剩余的残液直接用板框布过滤，计算5 min内的过滤速率；滤液用快速水分测定仪测定干物含量。
1.3.2 检测方法
（1）理化指标的测定
粗脂肪按国标GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》[22]测定；粗蛋白按国标GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》方法测定[23]；半纤维素和纤维素参考文献测定[24]；灰分按国标GB 5009.4—2016《食品中灰分的测定》[25]测定；淀粉按国标GB/T 5009.9—2008《食品中淀粉的测定》[26]方法测定；还原糖的检测：按国标GB/T 5009.7—2008《食品中还原糖的测定》[27]测定；干物质的检测：使用快速水分测定仪测定；黏度：使用黏度测定仪测定；酒精度：酒精计法。
（2）DE值和淀粉出酒率的计算
葡萄糖当量（dextrose equivalent）值及淀粉出酒率的计算公式如下：
（3）发酵醪组成的测定
采用高效液相色谱法进行测定，色谱柱：HPX-87H（300 mm×7.8 mm）；流动相：0.005 mol/L H2SO4；泵流速：0.6 mL/min；柱温：65 ℃；示差折光检测器，设置温度：50 ℃；进样量20 μL；运行时间30 min。
1.3.3 试验优化
小麦添加比例优化实验：拌料阶段将小麦分别按0%、30%、50%和100%添加至水稻中，其余步骤与1.3.1一致，测定各组指标。
不同种类淀粉酶的筛选实验：将小麦按30%比例与水稻混合，以淀粉酶活性一致进行添加，设置4组实验，拌料阶段分别添加超强复配淀粉酶（0.26 kg/t粮）、隆大耐高温淀粉酶（0.21 kg/t粮）、低pH淀粉酶（0.26 kg/t粮）和杰能科α-淀粉酶（0.17 kg/t粮，对照），其余步骤与1.3.1一致，测定各组指标。
降黏酶种类及添加方式的筛选实验：将小麦按30%比例与水稻混合，根据降黏酶的耐温特性，设置4组实验，分别在拌料阶段额外添加蔚蓝木聚糖酶、夏盛木聚糖酶，同步糖化发酵阶段额外添加夏盛木聚糖酶、挑战定制酶，各组酶添加量均为0.3 kg/t粮，其余步骤与1.3.1一致，对照组为不添加降黏酶的实验，测定各组指标。
1.3.4 数据处理
实验数据均以均值表示，采用Excel 2010作图。
2 结果与分析
2.1 原料成分分析
将超期储存的小麦和水稻进行全组分分析，结果如表1所示，从粗脂肪和灰分含量来看，小麦中的两种成分含量均低于水稻，更利于发酵时的原料利用。从淀粉含量来看，小麦中的淀粉含量要比水稻中的高出约6个百分点，添加小麦更有利于发酵酒精度的提高。此外，小麦的粗蛋白和半纤维素含量分别是水稻的1.8和1.7倍，在液化发酵时会导致醪液的黏度较大，泡沫多，装料系数小[28]。因此，需要摸索小麦的最佳添加比例，在提高混合原料的淀粉含量的同时，醪液黏度也在可接受范围内，减少设备的处理压力。
表1 超期储存小麦和水稻原料的全组分分析
Table1 Total component analysis of aging wheat and rice raw materials%
2.2 小麦添加比例优化实验
小麦中的蛋白和可溶性戊聚糖是小麦醪液黏度高的主要原因[28]，当小麦与水稻掺混使用时，醪液浓度也会因高黏度受到限制，因此需要摸索小麦的添加比例。本实验设计了不同的小麦添加比例对液化醪进行黏度、还原糖和干物等指标的影响，结果见表2。
表2 不同小麦添加比例对液化醪指标的影响
Table2 Effect of different wheat addition ratios on indexes of liquefied mash
由表2可知，在同一拌料干物下，随着小麦添加比例的升高，液化醪的黏度明显升高，液化干物也随之提高。这可能是小麦中麸皮的存在，导致混合原料整体吸水性增强[29]，使得干物含量升高，从而导致液化后醪液的黏度有大幅升高。醪液黏度升高在生产上会导致管道的堵塞和压力升高，不利于生产设备的连续运行[30]。基于工厂设备管道对于醪液黏度的承受范围，陈化小麦添加30%是可以接受的。对不同小麦添加比例的成熟醪进行高效液相色谱HPLC分析，结果见表3。
表3 不同小麦添加比例对成熟醪指标的影响
Table3 Effect of different wheat addition ratios on indexes of mature mash
由表3可知，随着小麦添加比例的升高，残糖（DP4+、麦芽三糖、麦芽糖、葡萄糖和果糖）、副产物（如甘油和乙酸）等有所升高，成熟醪黏度在小麦添加比例在50%及以上时黏度升高较明显。
乙醇/甘油是反映发酵质量的重要指标[31]，其值越高说明发酵水平越高，需控制在一定范围内。当小麦添加比例高于30%时，此值明显下降。这说明小麦添加比例超过一定范围时，会导致酵母发酵生产酒精的性能下降，产生更多的副产物—甘油等。淀粉出酒率是乙醇质量（以95%vol计）与原料中淀粉含量的比值[31]，由于两种原料按不同比例混合时的淀粉含量差异较大，以淀粉出酒率表征发酵效率较为准确。结果显示，当小麦添加比例0和30%时，淀粉出酒率最高，均为53%。
结合液化醪及成熟醪分析结果，综合考虑，30%小麦的添加比例比较合理，对于生产稳定性影响较小，且提高了乙醇产量。
2.3 不同种类淀粉酶的筛选实验
耐高温淀粉酶可以快速将长链淀粉切割成长短不一的糊精，因此具有明显的降黏效果[32]。不同厂家的耐高温淀粉酶来源有所差异，对于同一种底物的降解效果也会不同。针对优化出的30%小麦添加比例的混合原料，主要考察淀粉酶对于液化醪黏度及发酵效果的影响，结果见图1。
由图1可知，从液化醪黏度来看，超强复配淀粉酶对于液化醪的降黏效果最佳，液化醪黏度为372 mPa·s，其次是杰能科α-淀粉酶。从发酵酒精度来看，使用超强复配淀粉酶的酒精度最高为12.37%vol，其余三种淀粉酶酿造的酒精度约为11.38%vol，约高出1个百分点。这可能与超强复配淀粉酶中复配了耐高温的蛋白酶有关。由于小麦原料中蛋白含量较高（表1），影响着液化醪液的黏度，而超强复配淀粉酶中的蛋白酶可以较好的发挥作用，缓解了小麦添加带来的黏度升高。由于小麦蛋白的降解，可能使得混合原料的淀粉释放更彻底，从而导致酒精度的升高。因此，针对添加30%陈化小麦的混合原料，使用超强复配淀粉酶更适合。
图1 不同种类淀粉酶对液化和发酵的影响
Fig.1 Effect of different amylases on liquefaction and fermentation
2.4 降黏酶种类及添加方式的筛选实验
小麦麸皮中含有较高的非淀粉多糖，在水溶液中形成黏度较高的胶体溶液，导致添加小麦后醪液黏度升高，最终导致清液干物的升高，增大了后期污水处理的压力。降黏酶含一系列能够对非淀粉多糖（纤维素、半纤维素、木聚糖和β-葡聚糖）进行转化和分解的酶[33]。采用降黏酶来水解非淀粉多糖[34]，可以降低小麦预处理过程中的黏度[26]，从而提高初始拌料干物和后续发酵酒精度。根据不同酶的酶学特性，设计不同降黏酶种类及添加方式的降黏效果对比见图2。
图2 不同降黏酶种类及添加方式的降黏效果
Fig.2 Viscosity lowering effect of different types and adding ways of viscosity lowering enzyme
首先，从降黏酶的添加方式来看，在拌料阶段添加降黏酶可以显著将液化醪黏度从449 mPa·s降低至140 mPa·s左右，并且发酵醪黏度也出现明显下降；相比之下，在发酵阶段添加降黏酶只能降低发酵醪黏度，并不能解决前期液化醪黏度高的问题。对于蒸酒后的残液进行滤速和滤后干物分析，发现不管何种降黏酶和添加方式，均能不同程度的提高残液的滤速（以5 min内的过滤速率计），在拌料阶段添加蔚蓝木聚糖酶的滤速最高，由对照（不添加降黏酶）的4.8 mL/min提高至7.8 mL/min；最终滤过的清液干物也由对照的8.2%降低至5.7%。这可能是由于小麦麸皮中半纤维素含量较高（表1），降黏酶尤其是木聚糖酶的添加促进了小麦麸皮的部分降解，使得大分子的非淀粉多糖降解成长短不一的小分子，从而导致表观黏度下降，蒸馏残液过滤速度快。因此，结合黏度、滤速及清液干物结果分析，降黏酶在拌料阶段添加效果最佳，最优的降黏酶是蔚蓝木聚糖酶，参考工厂中降黏酶的添加量，选择添加量为0.3 kg/t粮。
3 结论
该文通过摇瓶发酵小试实验，优化了超期储存小麦和水稻混合发酵生产燃料乙醇的发酵辅料。在两者混合发酵生产乙醇时，干物质含量为30%，小麦添加比例30%，使用超强复配淀粉酶的条件下，液化醪黏度最低（约370 mPa·s），酒精度最高可达12.37%vol。若在拌料阶段额外添加0.3 kg/t粮的蔚蓝木聚糖酶，可显著降低液化醪和发酵醪黏度，蒸馏残液滤速（以5 min内过滤速率计）由4.8 mL/min提高至7.8 mL/min，清液干物由8.2%降低至5.7%，从而有效的减轻后期污水处理压力。这为更多元谷物的生产优化提供一定的指导思路。
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