啤酒包装的瓶盖内垫具有密封的作用，在加工过程中需要加入一定量增塑物质来改善材料的低温性能，提高其柔软度[1]，其基材多采用聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）[2]、聚乙烯（polyethylene，PE）[3]等材料。邻苯二甲酸酯类是全球塑料生产中最常用的增塑剂，尤其是聚氯乙烯塑料（PVC）的塑化剂和软化剂[4]，其用量占世界全年增塑剂消耗量的90%[5-6]。国内超过60%的PVC瓶盖内垫含有邻苯二甲酸酯（phthalate esters，PAEs）类增塑剂，在瓶盖内垫中PAEs的用量可达到50%左右，其中大部分是邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯（di（2-ethyl）hexyl phthalate，DEHP）[7]。目前，国内外对啤酒包装瓶盖内垫潜在的安全性问题越来越关注[8-9]。随着居民收入和消费水平的提高，我国啤酒消费量日益增长，因而，对啤酒中PAEs的检测尤为重要[10]。
邻苯二甲酸酯类增塑剂有一定毒性、呈无色无味液体，不允许作为添加剂或加工助剂添加到食物中[12]，其中DEHP的危害较大，是一种环境激素，其毒性比三聚氰胺高20倍，对人体的生殖系统和生育能力有影响，干扰内分泌，是导致人类生育能力降低的罪魁祸首[13-14]。长期大量摄取还会导致乳腺癌和肝癌，微量塑化剂在24～48 h可以排出体外[15]。很多国家对食品及其包装材料PAEs的使用和限量都有明确要求，日本、希腊、挪威等国要求禁止将PAEs用在聚氯乙烯等食品包装材料中；欧盟新《食品接触塑料材料和制品法规》中规定在用作与非脂肪类食品接触的重复使用材料和制品中邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）含量不能超过0.05%，DEHP、邻苯二甲酸二异壬酯（diisononyl phthalate，DINP）、邻苯二甲酸二异癸酯（didecyl phthalate，DIDP）和邻苯二甲酸苯基丁酯（butyl benzyl phthalate，BBP）含量不能超过0.1%，邻苯二甲酸二烯丙酯（diallyl phthalate，DAP）不得检出[16]；美国环境保护署（US Environmental Protection Agency，EPA）规定饮用水中DEHP的限量为6 μg/L[17-18]，我国生活饮用水卫生标准对DEHP的限量规定为8 μg/L[19]。
PAEs广泛存在于环境中，但因其含量极低，通常为mg/kg，因此对样品检测的前处理、仪器设备及人员的操作等要求都非常严格。近年来，各国纷纷颁布出邻苯二甲酸酯类物质的分析检测方法标准，如欧盟EN14372—2004《儿童喂养餐具的安全要求及测试》、欧盟BSEN 15777—2009《纺织品邻苯二甲酸酯的测定方法》、美国消费品安全委员会（Consumer Product Safety Commission，CPSC）-CH-C1001-09.3《儿童玩具和护理品中邻苯二甲酸酯的测试方法》、美国CPSC-CH-C1001-09.3ASTMD 3421-75《邻苯二甲酸酯测定方法标准》[20]，我国2016年发布了GB 5009.271—2016《食品安全国家标准食品中邻苯二甲酸酯的测定》[21-22]。针对啤酒样品，目前我国还没有专门针对其中PAEs的检测方法标准，检测只能参照食品中PAEs的检测标准，但在GB 5009.271—2016 中只对食品大类的PAEs检测方法做出了要求，没有对细分种类的检出限做出区分，方法中标出检出限DLDINP=9.0 mg/kg，DLDBP=0.3 mg/kg，其他16种目标化合物定量限均为0.5 mg/kg，而对含量较低该检出限的食品，该方法并不适用。如DBP和DEHP是我国地表水环境质量标准的检测项目，检出限（detection limit，DL）为DLDBP=0.1 μg/L，DLDEHP=0.4 μg/L[23]；刘靖靖等[20]对啤酒的PAEs检测结果显示，市售的30种啤酒样品PAEs 含量在0.77～16.67 μg/L 范围内，均低于GB 5009.271—2016中的检出限。因此，针对啤酒样品，建立灵敏、精准、高效的样品前处理方法及分析检测方法对啤酒的质量安全控制是极其重要的。
本研究建立了顶空固相微萃取-气质联用法（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry HS-SPME-GC-MS）分析啤酒中塑化剂邻苯二甲酸酯的测定方法，采用单点标准加入法测定了6种市售啤酒以及在3种迁移试验条件下瓶盖内垫片在啤酒和模拟物中PAEs的迁移量，为啤酒行业评估PVC和PE瓶盖内垫片问题奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
16种PAEs混标具体名称见表1。
表1 邻苯二甲酸酯类目标化合物名称
Table1 Name of phthalate esters target compound
混标各组分质量浓度为1 000 mg/L（正己烷溶剂）：广州太玮生物公司；正己烷、甲醇（junwei1色谱级）：百灵威科技有限公司；啤酒样品：超市采购；啤酒瓶盖内垫：某包装企业提供；高纯氦气（纯度≥99.99%）、高纯氮气（纯度≥99.95%）、高纯二氧化碳（纯度≥99.5%）：四平健新气体有限公司。
1.2 仪器与设备
Clarus600气相色谱-质谱联用仪（配有自动进样器、电子电离源）：美国珀金埃尔默仪器有限公司；DB-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）：美国Agilent公司；50 μm DVB/CAR/PDMS萃取头的固相微萃取装置（solid phase micro extraction process，SPME）：美国Supelco公司；UGC-12MF氮吹仪：北京优晟联合科技有限公司；2101TH超声波清洗器：上海安谱科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 标准溶液的配制
PAEs混标储备液：将PAEs标样用正己烷定容至10 mL，配制成质量浓度为100 mg/L的储备液，于4 ℃冰箱保存。
PAEs混标使用液：取16种PAEs混标储备液1mL于10 mL容量瓶中，用氮吹仪吹干，加甲醇复溶，定容至10 mL，质量浓度为10 mg/L，于4 ℃冰箱保存待用。
1.3.2 啤酒中邻苯二甲酸酯类化合物的检测[20，24]
采用顶空固相微萃取-气质联用（HS-SPME-GC-MS）法测定。
GC条件色谱柱：DB-5MS石英毛细管柱（30m×0.32 mm×0.25 μm）。程序升温：初温为60 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升至220 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升至280 ℃，保持4 min。进样口温度：250 ℃；不分流模式：进样0.75 min前不分流，之后流速为10.0 mL/min；恒流模式：流量为1.0 mL/min；载气为氦气（He）（纯度≥99.999%）；流速1 mL/min。
MS条件：电离方式采用电子电离（electctron ionization，EI）源；电子能量70eV；离子源温度230℃；传输线温度280℃；测定模式为选择离子监测（selected ion monitoring，SIM），溶剂延迟7 min；全扫描质核比范围为29～350 amu。
1.3.3 样品处理[25]
啤酒瓶盖垫片：将垫片破碎至最大颗粒不超过0.02 g，准确称取0.2 g试样（精确至0.1 mg）于100 mL具塞三角瓶中，加入20 mL正己烷，超声提取30 min，单层滤纸过滤，再用正己烷重复上述操作3次，每次10 mL，合并提取液用正己烷定容至50 mL，进行GC-MS分析，同时做试剂空白试验。
啤酒样品：啤酒样品超声20 min除气，取10 mL注入20 mL顶空瓶中，加盖密封。将SPME手柄插入顶空瓶中，推出萃取头水浴保温一段时间后进行GC-MS分析，解吸时间为5 min。
2 结果与分析
2.1 PAEs组分的定性和定量分析
2.1.1 PAEs组分的总离子流图
16种PAEs混标直接进样后获得的总离子流色谱图见图1。由图1可以看出，各组分的峰形基本对称，分离效果较好。
图1 16种邻苯二甲酸酯混标总离子流色谱图
Fig.1 Total ion chromatogram of 16 plasticizer phthalate acid esters mixed standard
2.1.2 PAEs组分信息汇总
采用顶空固相微萃取法萃取样品，定性方法采用选择离子扫描，定量时采用积于多离子比例定量，每个化合物选择1个定量离子，3个定性离子，这样定性、定量更为准确。通过对16种邻苯二甲酸酯（PAEs）组分的定性分析，得到其信息汇总见表2。
表2 16种邻苯二甲酸酯信息汇总
Table2 Information aggregation of 16 phthalate acid esters
2.2 萃取条件的优化
对于顶空固相微萃取法，萃取效果影响较大的因素是温度和时间，萃取温度和时间对邻苯二甲酸酯类化合物（DIBP、DBP、DEHP）的影响结果见图2。
由图2可知，DIBP、DBP和DEHP三种物质的含量随萃取时间的延长，整体都呈上升趋势，55 ℃水浴保温60 min和65 ℃水浴保温60 min萃取效果相差不大，说明达到一定温度和时间时，萃取头吸附已接近饱和而对于萃取头来说，长时间高温萃取容易造成萃取头老化加速甚至脱落，而且55 ℃条件较65 ℃条件更有利于检测结果的稳定，重现性较好。综合因素考虑，选取55 ℃水浴保温60 min条件进行萃取效果最好。
图2 萃取时间及温度对邻苯二甲酸酯类化合物组分（DIBP、DBP、DEHP）含量的影响
Fig.2 Effect of extraction time and temperature on phthalate acid esters components (DIBP、DBP、DEHP) contents
2.3 啤酒瓶盖内垫片中PAEs的定量分析
对于啤酒中痕量PAEs的来源，很少有相关的报道，有人推断啤酒瓶盖的PVC内垫片可能对其有影响。为了验证瓶盖内垫对啤酒酒液中PAEs的影响，对本地某啤酒企业目前所使用的啤酒瓶盖A厂PVC内垫片的23个样品、B厂PE内垫片的26个样品和C厂PE内垫片的21个样品进行了测定，其中共检出DIBP、DBP和DEHP三种PAEs，其结果平均值见表3。
表3 不同厂家不同材质的瓶盖内垫片中邻苯二甲酸酯类化合物组分含量
Table3 Contents of phthalate acid esters components in bottle cap gaskets made of different materials from different manufacturers
注：“－”表示未检出。
由表3可知，PVC和PE内垫片差异很大，PVC内垫片的DEHP含量很高，达到179 214 mg/kg，而PE内垫片仅为6.25 mg/kg，两者相差3万倍左右，作为与啤酒直接接触的材料，PVC内垫片是存在一定风险的。在2014年中国酒业协会啤酒分会年会上，就啤酒及啤酒瓶盖内垫塑化剂问题展开过专题讨论，协会责成各大啤酒龙头企业牵头，将PVC内垫逐步替换为PE内垫，现大部分企业已经开始、正在进行更换，甚至已经更换完毕，但仍有部分企业更换进展很慢，存在一定的安全隐患。
2.4 啤酒中PAEs的定量分析
采用单点标准加入法做定量分析，计算啤酒中PAEs的含量。通过前期对大量啤酒样品的检测发现，所选样品范围内仅能检出DIBP、DBP和DEHP三种物质，其余13种均为未检出，在此，仅对这三种物质进行分析。采用此方法测定了6种市售啤酒，啤酒中所含的3种PAEs组分含量见表3，结果为三个平行样品的平均值。
由表4可知，啤酒中也含有痕量的PAEs，其含量均为μg/L级，DBP含量稍高，在1.41～8.45 μg/L之间，而DIBP在0.79～3.62 μg/L之间，DEHP在≤7.88 μg/L。我国对于食品中的PAEs限量尚无要求，如果比照我国生活饮用水卫生标准对DEHP的限量为8 μg/L[18]的规定，啤酒样品并未超标，但检测结果已经接近饮用水的限量值，应该采取更新包装材料等手段进行干预，避免其含量过高，也期待啤酒的相应标准尽快出台。
表4 啤酒中3种邻苯二甲酸酯类化合物组分（DIBP、DBP、DEHP）的含量
Table4 Contents of 3 phthalate acid esters components (DIBP、DBP、DEHP) in beer
2.5 迁移量试验
为研究啤酒瓶盖内垫片在啤酒中迁移量的问题，根据GB/T 23296.1—2009《食品接触材料塑料中物质向食品及食品模拟物特定迁移试验和含量测定方法以及食品模拟物暴露条件选择的指南》中对迁移试验条件的相关规定以及啤酒实际储存的条件[26]，选取了3种迁移试验条件，即70 ℃保温1 h、20 ℃储存10 d、40 ℃储存10 d，通常被认为更严厉的试验条件为40 ℃储存10 d[27]，啤酒和模拟物样品应横放在培养箱中储存。
2.5.1 温度及时间对PVC内垫片在啤酒中PAEs迁移量的影响
测定啤酒本底的含量以及在3种迁移试验条件下的迁移量，结果见图3。
图3 温度及时间对PVC内垫片在啤酒中邻苯二甲酸酯类化合物组分（DIBP、DBP、DEHP）迁移量的影响
Fig.3 Effect of temperature and time on phthalate acid esters components (DIBP、DBP、DEHP) migration of PVC inner gasket in beer
由图3可知，在70 ℃保温1 h、20 ℃储存10 d、40 ℃储存10 d的条件下，PVC内垫片在啤酒中DIBP的含量是啤酒本底的1.3～2.0倍，DBP是2.0～5.9倍，DEHP是1.7～8.3倍，DEHP的含量增加尤为显著。因此，从整体的迁移量角度出发，发现：在40 ℃、储存10 d的条件下，DBP的含量最高为9.48 μg/L，DIBP的含量最高为1.88 μg/L，DEHP的含量最高为1.89 μg/L。通过上述得出PVC内垫片中的DBP在较高的温度且较长的储存条件下，DBP较其他两者更易迁移至啤酒中。
2.5.2 温度及时间对PE内垫片在啤酒中PAEs迁移量的影响
测定啤酒本底的含量以及在3种迁移试验条件下的迁移量，结果见图4。
图4 温度及时间对PE瓶盖内垫片在啤酒中邻苯二甲酸酯类化合物组分（DIBP、DBP、DEHP）迁移量的影响
Fig.4 Effect of temperature and time on phthalate acid esters components (DIBP、DBP、DEHP) migration of PE bottle cap inner gasket in beer
由图4可知，在70 ℃保温1 h、20 ℃储存10 d、40 ℃储存10 d的条件下，PE内垫片在啤酒中DIBP的含量是啤酒本底的1.3～1.9倍，DBP是1.4～3.0倍，DEHP是3.2～4.0倍。因此，从整体迁移量来看，在40 ℃、储存10 d的条件下DBP含量最高为8.26 μg/L，DIBP含量最高为1.73 μg/L，DEHP含量最高为1.46 μg/L，结合2.5.1结论可知：PE内垫片中的DBP较其它两者更易迁移至啤酒中，而且PVC内垫片中的三者的含量均要高于PE内垫片中的三者含量。
2.5.3 温度及时间对PVC内垫片在模拟物中PAEs迁移量的影响
测定模拟物本底的含量以及在3种迁移试验条件下的迁移量，结果见图5。
图5 温度及时间对PVC内垫片在模拟物中邻苯二甲酸酯类化合物组分（DIBP、DBP、DEHP）组分迁移量的影响
Fig.5 Effect of temperature and time on phthalate acid esters components (DIBP、DBP、DEHP) migration of PVC inner gaskets in simulators
由图5可知，在70 ℃保温1 h、20 ℃储存10 d、40 ℃储存10 d的条件下，PE瓶盖内垫片在啤酒中DIBP的含量是啤酒本底的1.2～1.7倍，DBP是1.6～3.7倍，DEHP是0.3～7.6倍，DEHP的含量增加也是显著的。因此，从整体迁移量的角度出发，在40 ℃，储存10 d的条件下，PVC内垫片中的DEHP在模拟物（10%含量的乙醇溶液）中的含量最高为7.55 μg/L，DBP的含量为3.04 μg/L，DIBP的含量为1.16 μg/L，说明在较高的温度且较长的储存时间下，DEHP更易溶于较高含量的乙醇溶液，而DEHP在酒精含量相对较低的啤酒中的迁移量最少。
总结图3～图5的结果，温度及时间是啤酒中PAEs增加的重要因素，而且通过试验结果可知啤酒在正常条件下储存，其中的DIBP、DBP与DEHP的含量是不会达到上述试验中的迁移量。在夏季时，啤酒放在冰箱里冷藏饮用、在运输过程中超过30 ℃，这些都是常有的现象，因此应严格禁止将啤酒横放、倒放或高温储存，避免酒液接触内垫片。
3 结论
本试验研究优化了采用顶空固相微萃取-气质联用法测定啤酒中邻苯二甲酸酯的方法，该方法操作简单，灵敏度较高，试验检测结果表明，啤酒中所含3种PAEs组分，即DIBP、DBP、DEHP，而且含量较低。PVC内垫片中DBP的含量高达9.48 μg/L，PE内垫片为8.26 μg/L。在迁移试验中，PVC、PE内垫片中DEHP在啤酒中的迁移量有所提高，但在PVC内垫片中DEHP在模拟物中即10%含量的乙醇溶液中的迁移量更为显著。温度及时间是啤酒中PAEs增加的一个重要因素，应严格禁止将啤酒横放、倒放或高温储存，避免酒液接触内垫片。
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