桤叶唐棣（Amelanchier alnifolia Nutt.）蔷薇科（Rosaceae）唐棣属落叶灌木或小乔木，果实形似蓝莓[1]，每100 g鲜果中含钙为88 mg，又称为高钙果[2]。果实中富含果胶、花色苷以及多酚类和黄酮类化合物，果胶可以治疗腹泻、对预防高血压和糖尿病等疾病具有良好效果[3-4]；花色苷具有降低胆固醇、保护心脏、预防心脑血管疾病等作用[5-6]；多酚类物质抗氧化活性高，效果优于维生素E，能够调节血糖血脂、保护血管[7]；黄酮类化合物可通过细胞中蛋白质的合成来抑制白血病细胞生长[8]。
果醋是以水果或果品加工下脚料为主要原料，经酒精发酵和醋酸发酵酿制而成的一种兼具水果和食醋风味的新型饮品[9]，同时也是集保健食疗为一体，营养丰富、风味优良的酸味调味品[10]。果醋中的风味物质醇类、酯类、醛类、酸类、酮类等物质[11-12]，有机酸作为果醋风味物质的主要成分，对果醋整体感官有重要的影响[13]。
本研究以桤叶唐棣为原料，采用半固态发酵法酿制桤叶唐棣果醋，以总酸含量为评价指标，研究并优化了桤叶唐棣果醋发酵工艺，并对其中有机酸及挥发性成分进行分析，以期为桤叶唐棣果醋的开发和生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
桤叶唐棣：2019年6月采摘于北华大学磨盘山实习基地，-80 ℃冷冻保藏。
果酒专用酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；醋酸菌：烟台帝伯仕自酿有限公司。
有机酸标准品（草酸、苹果酸、酒石酸、丙二酸、乳酸、乙酸）（纯度均＞98%）：上海精纯试剂有限公司；磷酸二氢铵、磷酸、氢氧化钠等（均为分析纯），甲醇（色谱纯）：天津致远股份有限公司。
1.2 仪器与设备
HH-4数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；BSA224S电子天平：北京赛多利斯科学仪器有限公司；SPX-2500S-Ⅱ型生化培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；LC-15C高效液相色谱仪（high performance liquid chromatograph，HPLC）（配备紫外检测器和Essentia LCsolution 15C工作站）：日本岛津公司；Agilent 5977C-7890B气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）：美国安捷伦仪器设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 桤叶唐棣果醋发酵工艺流程及操作要点
桤叶唐棣果→自然解冻→挑选除杂→清洗→破碎→成分调整→酵母菌活化→接种酵母菌→酒精发酵→过滤→果酒、果渣复配→加麸皮、稻壳、醋酸菌→醋酸发酵→过滤→成品
操作要点：
挑选及预处理：选择成熟度好、表面光滑、颜色紫红、无病虫害、无腐烂、无机械性损伤的桤叶唐棣果实，于室温（25 ℃）条件下自然解冻后用蒸馏水清洗至表面清洁；
破碎：着洁净的食品级一次性手套，进行手工破碎，避免打浆破碎过度；
成分调整：按酒精发酵最适宜的初始糖度含量（22%），在破碎好的桤叶唐棣果浆中加入绵白糖，搅拌均匀后备用。
果酒酵母活化：将蔗糖溶解于蒸馏水中，配制成为100 g/L的糖液，加入果酒酵母（糖液与果酒酵母质量比为10∶1），轻微搅拌，在29 ℃水浴锅中活化20 min，当溶液冒出很多细小气泡时，酵母活化完成。
酒精发酵：按酒精发酵最适宜的酵母菌添加量（2%），向桤叶唐棣果浆中加入活化好的果酒酵母，搅拌均匀，倒入容器，装罐量占容器容量的2/3，容器口用保鲜膜密封，放入培养箱中静置发酵，30 ℃发酵9 d。
过滤：果酒经过500目纱布自然沉降过滤。
醋酸发酵：发酵所需的容器都要经过严格的灭菌，防止在发酵过程中受到其他杂菌污染，灭菌后加入适量麸皮、稻壳，果酒与酒渣体积占容器容量的1/2，用两层纱布覆盖，放入培养箱中在一定温度条件下静置有氧发酵，在发酵过程中注意时常搅拌，防止果醋发干变臭。
过滤：果醋经过500目纱布过滤，得到果醋成品。
1.3.2 桤叶唐棣果醋醋酸发酵条件优化单因素试验
以总酸含量为评定指标，分别考察初始酒精度（5%vol、7%vol、9%vol、11%vol、13%vol），果酒果渣质量比（1∶1、1∶1.4、1∶1.6、1∶1.8、1∶2），发酵温度（24 ℃、27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃），醋酸菌添加量（1.6%、1.8%、2.0%、2.2%、2.4%）对醋酸发酵的影响。
1.3.3 桤叶唐棣果醋醋酸发酵条件优化正交试验
在单因素试验的基础上设计L9（34）正交试验，以初始酒精度（A）、发酵温度（B）、醋酸菌添加量（C）、果酒果渣质量比（D）为评价因素，以总酸含量为考察指标，优化桤叶唐棣果醋醋酸发酵条件，正交试验因素与水平见表1。
表1 桤叶唐棣果醋醋酸发酵条件优化正交试验因素与水平
Table1 Factors and levels of orthogonal tests for acetic acid fermentation conditions optimization of Aelanchier alnifolia fruit vinegar
1.3.4 测定方法
酒精度的测定：参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酒精计法[14]；总酸的测定：参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》中的pH电位法[15]。
有机酸含量的测定：①样品预处理：原果汁和优化发酵条件后的桤叶唐棣果醋，过200目纱布，取5.00 mL待测样品，加入2.00 g聚酰胺后于70 ℃水浴锅中加热5 min，于3 000 r/min条件下离心10 min，取上清液加入2.00 mL 1 mol/L磷酸溶液和5.00 mL蒸馏水，过0.45 μm滤膜，备用。②色谱条件：参考GB 5009.157—2016《食品有机酸的测定》中果汁饮料及果汁、果味碳酸饮料的方法[16]。
有机酸定性定量方法：将样品的保留时间与标准品保留时间作对照进行定性，采用内标标准曲线法对样品含量进行定量。
挥发性成分的测定采用GC-MS法。①样品预处理：参考彭帮柱等[17]的方法。②气相色谱（GC）条件：色谱柱为HP-5ms（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；进样口温度250 ℃；载气氦气（He）（纯度＞99.999%）；流速1.0 mL/min；不分流进样。程序升温，起始温度为40 ℃于10 min后，以3 ℃/min升温至85 ℃，保持2 min，然后以5 ℃/min升温至110 ℃，保持2 min；最后以8 ℃/min升温至230 ℃，保持8 min。质谱（MS）条件：电子电离（electron ionization，EI）源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；质量扫描范围为35～400 m/z。
挥发性成分定性定量方法：将GC-MS检测的未知化合物的图谱与美国国家标准与技术研究院（national insititute of standards and technology，NIST）谱库II并结合文献报道的保留指数（retention index，RI）进行比对定性。采用内标标准曲线法对样品含量进行定量。
1.3.5 数据统计分析
采用Excel 2016对实验数据进行录入、计算，采用Origin 8.0软件进行作图。
2 结果与分析
2.1 桤叶唐棣果醋发酵条件优化
2.1.1 发酵时间的确定
由图1可知，随着发酵时间的延长，桤叶唐棣果醋产酸量也随之增加，在发酵初期醋酸菌处于生长繁殖阶段，导致产酸量较低，当发酵到12 d时产酸量开始大量增加，产酸明显，当发酵到18 d时，产酸量达到峰值，为3.66 g/100 mL，当发酵到21 d时，产酸量开始下降，由于前期酸的积累使醋酸菌生长受到抑制，产酸量下降。因此，确定18 d为最佳发酵时间。
图1 发酵时间对桤叶唐棣果醋总酸含量的影响
Fig.1 Effect of fermentation time on total acid content of Aelanchier alnifolia fruit vinegar
2.1.2 初始酒精度的确定
由图2可知，在醋酸发酵初期产酸量都较低，因为醋酸菌处于生长繁殖阶段，产酸效果未表现出来；初始酒精度较低时，产酸量在整个发酵过程中较少，是因为醋酸菌可利用的酒精含量过低导致产酸量过少；初始酒精度过高时，产酸量在整个发酵过程中几乎无变化，是由于酒精度过高使醋酸菌不耐受，醋酸菌在整个发酵过程中受到抑制[18]，初始酒精度为9%vol时，产酸量在第18天出现峰值，为3.8 g/100 mL。因此，确定初始酒精度为9%vol。
图2 初始酒精度对桤叶唐棣果醋总酸的影响
Fig.2 Effect of initial alcohol contents on total acid contents of Aelanchier alnifolia fruit vinegar
2.1.3 果酒果渣质量比的确定
由图3可知，在发酵初期产酸都较少，当果酒与果渣复配比例相对较低为1∶1时，由于容器中氧气含量相对较高，醋酸菌大量生长繁殖代谢旺盛，发酵过程结束过早[19]；果酒与果渣复配比例为1∶2时，产酸量在第15天出现峰值，而后下降，由于容器中氧气流通不足，醋酸菌生命活动受到抑制，在发酵后期产酸量降低；果酒与果渣复配比例为1∶1.6时，产酸量在第18天出现峰值，为3.12 g/100 mL。因此，确定果酒与果渣复配比例为1∶1.6。
图3 果酒果渣质量比对桤叶唐棣果醋总酸的影响
Fig.3 Effect of mass ratio of fruit wine and pomace on total acid contents of Aelanchier alnifolia fruit vinegar
2.1.4 醋酸菌添加量的确定
由图4可知，随着醋酸菌添加量的增加，产酸量随之增加；在发酵初期，过少的添加量产酸量相对较少；过高的添加量会使醋酸菌发生自溶现象，产生大量的代谢废物，影响醋酸菌的生长繁殖，在醋酸发酵后期产酸量降低[20]，醋酸菌添加量为2.0%时，在发酵末期的产酸量相对较多，第18天产酸量达到峰值，为3.65 g/100 mL。因此，确定醋酸菌添加量为2.0%。
图4 醋酸菌添加量对桤叶唐棣果醋总酸含量的影响
Fig.4 Effect of acetic acid bacteria addition on total acid contents of Aelanchier alnifolia fruit vinegar
2.1.5 发酵温度的确定
由图5可知，在发酵初期，随着温度的升高，产酸量随之增加；过低的温度会影响醋酸菌的生长，不易存活，导致发酵不完全，产酸量相对较少；过高的温度会使酸大量挥发，醋酸菌老化死亡，在醋酸发酵后期产酸量降低[20]，发酵温度为30 ℃时，总酸含量在第18天达到峰值，为3.71 g/100 mL。因此，确定发酵温度为30 ℃。
图5 发酵温度对桤叶唐棣果醋总酸含量的影响
Fig.5 Effect of fermentation temperature on total acid contents of Aelanchier alnifolia fruit vinegar
2.1.6 醋酸发酵条件优化正交试验
由表2可知，正交试验中的最佳工艺组合为A2B2C2D3，即初始酒精度9%vol，发酵温度30 ℃，醋酸菌添加量2.0%，果酒与果渣质量比1.0∶1.6，在此条件下桤叶唐棣果醋总酸含量为4.75 g/100 mL，结合单因素试验，总酸含量峰值均出现在第18天，因此将第18天确定为醋酸发酵终止时间。
表2 桤叶唐棣果醋醋酸发酵条件优化正交试验结果与分析
Table2 Results and analysis of orthogonal tests for acetic acid fermentation conditions optimization of Aelanchier alnifolia fruit vinegar
由表3可知，在发酵过程中，初始酒精度（A）和发酵温度（B）对桤叶唐棣果醋的总酸含量影响极显著（P＜0.01），醋酸菌添加量（C）对桤叶唐棣果醋的总酸含量影响显著（P＜0.05），果酒与果渣质量比（D）影响不显著（P＞0.05）。
表3 正交试验结果方差分析
Table3 Variance analysis of orthogonal tests results
2.2 有机酸组成分析
采用反相高效液相色谱法对桤叶唐棣原果汁和果醋中的有机酸进行定性和定量分析，结果见表4。
表4 桤叶唐棣果汁和果醋有机酸含量分析结果
Table4 Analysis results of organic acid content in Amelanchier alnifolia juice and fruit vinegar
注：“-”表示未检出。
由表4可知，桤叶唐棣果汁中苹果酸含量最高为1.20 mg/mL，丙二酸次之，为0.47 mg/mL，草酸和乙酸含量相对较低，这些有机酸构成了桤叶唐棣浆果独特的口感；桤叶唐棣果醋中，乙酸含量最高为5.00 g/100 mL，其次是丙二酸和乳酸，分别为0.43 mg/mL、0.25 mg/mL。与桤叶唐棣果汁相比，桤叶唐棣果醋中苹果酸含量明显降低，这是由于酒精发酵过程中部分苹果酸被转化成酒精和乳酸，因此苹果酸含量下降，随着醋酸发酵的进行，桤叶唐棣果醋中苹果酸、丙二酸含量持续下降，在醋酸发酵过程中醋酸菌利用乙醇发酵产生大量乙酸，造成乙酸含量突增，同时有一部分糖发酵不完全转化成了乳酸，使得乳酸含量相对增加[21]。
2.3 挥发性成分组成分析
桤叶唐棣果汁和果醋挥发性成分分析结果见表5。
由表5可知，桤叶唐棣果汁中分离出6种化合物，分别为乙酸-3-甲基丁酯、乙酸乙酯、苯甲醛、丁酸、苯甲醇、2-甲氧基-4-乙烯苯酚，其中苯甲醛（73.53%）含量相对较高，是桤叶唐棣果汁中挥发性成分的主要组分，具有苦杏仁味。从桤叶唐棣果醋中分离出5种化合物，分别为3-羟基-2-丁酮、乙酸、乙酸乙酯、苯甲酸、苯甲醇，其中乙酸（35.62%）含量最高，是桤叶唐棣果醋中挥发性成分的主要组分，具有刺激性的酸味，乙酸乙酯（24.32%）含量次之，具有酯香和果香。随着酒精发酵过程的进行，酵母菌利用糖进行无氧发酵产生大量乙醇，使得进行醋酸发酵之前就已经具有香气较为复杂；当进行到醋酸发酵阶段，醋酸菌利用乙醇有氧发酵产生大量乙酸，发酵液具有明显的醋酸味，同时乙酸与乙醇酯化生成乙酸乙酯，构成了果醋的独特香味[22-25]。
表5 桤叶唐棣果汁和果醋挥发性成分分析结果
Table5 Analysis results of volatile components in Amelanchier alnifolia juice and fruit vinegar
3 结论
桤叶唐棣营养价值相对较高，可以用来发酵果酒和果醋，通过试验分析，确定了桤叶唐棣果醋醋酸发酵最佳条件为初始酒精度9%vol，果酒与果渣质量比1.0∶1.6，醋酸菌添加量2.0%，发酵温度30 ℃，醋酸发酵时间18 d。其中，初始酒精度和发酵温度为影响醋酸发酵的极显著性因素，酵母添加量为显著性因素。在此条件下进行发酵，总酸含量为4.75 g/100 mL。
桤叶唐棣果醋的6种有机酸中乙酸（5.00 mg/mL）含量最高，乳酸（0.25 mg/mL）和丙二酸（0.43 mg/mL）次之。5种挥发性成分分别是3-羟基-2-丁酮、乙酸、乙酸乙酯、苯甲酸、苯甲醇，其中含量较高的是乙酸（35.62%）和乙酸乙酯（24.32%）。在发酵过程中，桤叶唐棣果汁香气较为酸涩，有桤叶唐棣独特的果酸味，而桤叶唐棣果醋成分复杂多样，集酯香、果香以及醋的酸味于一体，香气宜人且浓郁。
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