纳豆（Natto）是一种工艺简单且营养丰富的食品[1-2]，其含有的纳豆激酶具有溶栓效果[3-5]。黄璇等[6]采用固相微萃取法鉴定纳豆挥发性成分为47种，包括酮类、吡嗪类、醇类、酸类等15类有机挥发物，主要为川芎嗪（26.223%）、2,5-二甲基吡嗪（23.835%）、2,3-丁二酮（15.648%）、3-羟基-2-丁酮（1.676%）；TANAKA T等[7]检测出74种纳豆挥发性成分，丙酮（70.84%）和异丁酸甲酯（13.35%）是其主要挥发性成分；刘野等[8]对2种国内纳豆和5种日本纳豆挥发性成分进行了分析测定，发现日本纳豆中吡嗪类和酮类物质比国内纳豆含量高，4-乙烯基-2-甲氧基苯酚为日本纳豆特有挥发性成分。
鹰嘴豆是一种分布广泛且营养全面的豆科植物，以其极高的营养与健康价值引起研究者的广泛关注。现代药理研究表明鹰嘴豆提取物尤其是鹰嘴豆异黄酮类和皂苷类化合物具有降血糖、降血脂、降胆固醇、抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、驱虫等药理活性[9-13]。罗仓学等[15]以纳豆激酶活性为指标优化了鹰嘴豆纳豆发酵条件，最佳工艺为基质含水量50%、接种量6%、发酵温度34 ℃、发酵时间48 h、后熟时间20 h；张俊杰等[16]对采用筛选的三株菌发酵鹰嘴豆纳豆进行感官评价，金黄色、表面有白色分泌物、湿润有光泽，并进行了感官评分；金爽等[17]采用固载纳豆菌发酵制备鹰嘴豆纳豆，进行感官评价，其在硬度、光泽度、气味和溶解性等方面都优于以大豆制备的纳豆，但未研究挥发性风味成分。
学者们对以大豆为原料制备的纳豆的挥发性成分进行了较多的研究[6-8，18-22]，KIMURA K等[21]研究了大豆纳豆发酵3 h、7 h、12 h、18 h时挥发性成分的变化，检测到38种挥发性成分，蒸煮的大豆发酵后挥发性成分增加5种、减少6种，贡献大的挥发性成分有12种，包括吡嗪类和支链脂肪酸。关于鹰嘴豆纳豆挥发性成分的研究极少，该实验以鹰嘴豆为原料，接种纳豆芽孢杆菌进行发酵，采用顶空固相微萃取（head space-solid phase micro-extraction，HS-SPME）和气质联用技术（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）分析鹰嘴豆纳豆发酵过程中的挥发性成分，以初步探索鹰嘴豆纳豆发酵过程中气味物质的变化。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
鹰嘴豆：广州新粮年农产品有限公司。
1.1.2 试剂氯化钠（分析纯）、蛋白胨（生化试剂）、酵母膏（生化试剂）：国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3 菌种与培养基
纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis Natto）：湖北工业大学食品酿造团队保藏菌种，菌种编号SPNA04。
液体培养基：NaCl 10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L。121 ℃灭菌15 min。
1.2 仪器与设备
SPME手动进样器、75 μm CAR-PDMS、100 μm PDMS萃取头：美国Supelco公司；7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪、DB-WAX毛细管色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm）：美国安捷伦公司；PC-420磁力恒温搅拌器：美国Corning公司；SW-CJ-2D净化工作台：广州瑞智科学仪器有限公司；LHS-250SC型智能型恒温恒湿箱：上海浦东荣丰科学仪器有限公司；大型SLY-2112B型立式双层大容量恒温培养摇床：金坛市盛蓝仪器制造有限公司；YM系列A型立式压力蒸汽灭菌器：上海三申医疗器械有限公司。
1.3 方法
1.3.1 鹰嘴豆纳豆的制作工艺流程与操作要点
鹰嘴豆→浸泡→蒸煮→接种种子液→培养发酵→鹰嘴豆纳豆
操作要点：
浸泡：100 g清洗好的鹰嘴豆在400 mL去离子水中20 ℃浸泡18 h。
蒸煮：将浸泡好的鹰嘴豆置于121 ℃高压蒸汽灭菌锅中蒸煮30 min。
接种发酵：蒸熟的鹰嘴豆接种5 mL纳豆菌种子液（菌落数为1.24×108 CFU/mL）后置于37 ℃恒温箱中培养，开始计时，将纳豆在不同发酵时间点取出，搅拌观察黏液类物质量和拉丝状态，测定理化指标以及挥发性物质。
1.3.2 样品处理
称量15 g纳豆样品置于50 mL样品瓶中，放入50 ℃恒温水浴锅保温20 min。将SPME萃取头插入样品瓶，推出纤维头，50 ℃顶空吸附40 min，萃取完成后抽回纤维头，从样品瓶中拔出萃取头，再将萃取头插入气相色谱质谱联用仪进样口进行解吸。
1.3.3 HS-SPME-GC-MS分析鹰嘴豆纳豆挥发性风味物质
气相色谱条件：HP-5ms毛细管色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；载气：氦气（He）；前进样口总流量：4 mL/min，不分流，前段样口温度260 ℃；Aux-2温度：260 ℃；离子源温度：230 ℃；MS四级杆温度：150 ℃；柱温：起始温度40 ℃，以5 ℃/min升温至150 ℃，再以10 ℃/min升温至260 ℃，保持5 min。
质谱条件：接口温度250 ℃，离子源温度230 ℃，电离方式为电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV，四级杆温度150 ℃，传输线温度280 ℃，扫描质量范围10～500 amu。
定性定量方法：通过美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）14标准谱库自动检索各组分质谱数据，按照标准谱图及保留指数对机检结果进行定性，采用面积归一法对各组分进行定量。
1.3.4 测定方法
还原糖的测定：参考GB 5009.7—2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》[23]；氨基酸态氮的测定：参考GB 5009.235—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》[24]；纳豆激酶活性的测定：参考文献[25]。
2 结果与分析
2.1 鹰嘴豆纳豆质量评价
2.1.1 纳豆感官评价
鹰嘴豆发酵制备的纳豆，体态均一、豆粒饱满，与传统大豆纳豆相比，鹰嘴豆纳豆口感更酥软，滋味方面差异不显著，发酵过程中有浓郁的氨臭味。
2.1.2 发酵过程中鹰嘴豆纳豆黏液类物质变化
鹰嘴豆纳豆分别发酵24 h、36 h、48 h、60 h的黏液类物质变化见表1。由表1可知，随着发酵时间的延长，黏液物质含量和拉丝长度均是先增大后减小，发酵48 h的鹰嘴豆纳豆搅拌后黏液类物质量最大、拉丝最长，发酵效果较理想，而其他发酵时间点的黏液量较少、且拉丝易断。
表1 鹰嘴豆纳豆发酵过程中黏液物质分析
Table1 Analysis of mucus substances in chickpea natto during fermentation process
2.1.3 理化指标测定结果
从表2可以看出，随着发酵时间的延长，鹰嘴豆纳豆纳豆激酶活性先增大而后有所减小，在48 h时最大，而还原糖和氨基酸态氮则是逐渐减小。可能是随着纳豆菌对营养成分的消耗，碳源和氮源逐渐降低，而纳豆激酶活性随纳豆菌的代谢达到最高值时而后趋于稳定。
表2 鹰嘴豆纳豆发酵过程中理化指标的检测结果
Table2 Determination results of physical and chemical indicators of chickpea natto during fermentation process
2.2 鹰嘴豆纳豆发酵过程中挥发性成分分析
根据鹰嘴豆纳豆发酵过程中挥发性风味成分的GC-MS总离子流色谱图，对所有成分经谱库检索和其他方法核实，从四个发酵时间点的鹰嘴豆纳豆中共鉴定出57种挥发性化合物，分别占各自总挥发性成分的73.34%、79.85%、82.0%、79.6%，测定结果见表3。
表3 鹰嘴豆纳豆发酵过程中挥发性成分GC-MS分析结果
Table3 Results of volatile components in chickpea natto during fermentation process analyzed by GC-MS
续表
鹰嘴豆纳豆发酵过程中挥发性物质种类及含量见图1。由图1和表3可知，鹰嘴豆纳豆发酵24 h时挥发性成分为54种，其中主要挥发性成分为酸类，其次为酯类，主要挥发性成分为4-乙烯基-2-甲氧基苯酚（7.49%）、3-甲氧基-4-羟基肉桂酸（阿魏酸，7.37%）、反式阿魏酸（6.31%）、乙酸乙酯（3.99%）；发酵36 h时挥发性成分为50种，其中主要挥发性成分为吡嗪类，其次是酸类，主要挥发性成分为2,3,5-三甲基吡嗪（14.55%）、反式阿魏酸（13.91%）、2,3,5,6-四甲基吡嗪（12.64%）、乙酸（2.96%）、3-甲氧基-4-羟基肉桂酸（2.74%）；发酵48 h为39种，其中主要挥发性成分与36 h一致,主要挥发性成分为2,3,5-三甲基吡嗪（21.12%）、2,3,5,6-四甲基吡嗪（17.95%）、反式阿魏酸（15.16%）、乙酸（3.22%）、3-甲氧基-4-羟基肉桂酸（2.85%）；发酵60 h的挥发性成分为37种，其中最主要的挥发性成分也与36 h一致，主要挥发性成分为2,3,5-三甲基吡嗪（23.32%）、反式阿魏酸（14.64%）、3-甲氧基-4-羟基肉桂酸（11.88%）、2,3,5,6-四甲基吡嗪（5.03%）、2,5-二甲基吡嗪（3.80%）。吡嗪类物质相对含量先增大后减小，可能是其为美拉德反应的产物，随着发酵时间其相对含量逐渐增大，也会进一步反应生成其他复杂化合物；阿魏酸在鹰嘴豆中以酯化物的形式存在，纳豆菌可能是分泌降解酯化物的酶系，从而是阿魏酸或反式阿魏酸百分比增大，同时其也会进一步转化为复杂酚类物质。
图1 鹰嘴豆纳豆发酵过程中挥发性物质种类及含量
Fig.1 Types and contents of volatile components in chickpea natto during fermentation
2.3 鹰嘴豆纳豆发酵过程中挥发性风味成分对比分析
鹰嘴豆纳豆发酵过程中挥发性成分会有一定的变化。从表3可以看出，发酵24 h、36 h、48 h及60 h的鹰嘴豆纳豆中分别鉴定出54、50、39和37种挥发性成分，分别占各自总挥发性成分的73.34%、79.85%、82%和79.6%，发酵24 h、36 h、48 h和60 h的纳豆相同的挥发性成分共有35种，其中醇类9种（甲醇、乙醇、1-丁醇、1,4-戊二醇、2-戊醇、2-己醇、苯乙醇、苯甲醇、L-薄荷醇），醛类2种（乙醛、甘油醛），酮类4种（3-羟基-2-丁酮、4-羟基-2-丁酮、苯氧基-2-丙酮、8-羟基-2-辛酮），酸类7种（乙酸、丁酸、3-羟基丁酸、异丁酸、异戊酸、3-甲氧基-4-羟基肉桂酸、反式阿魏酸），酯类5种（乙酸乙酯、异丁酸甲酯、丁酸异丙酯、3-羟基丁酸乙酯、苯乙酸甲酯），烃类5种（2-甲基戊烷、十二烷、1-碘十二烷、十六烷、2,3,4-三甲基正己烷），其他3种（氨气、N-（羟甲基）乙酰胺、2-甲基呋喃）。
鹰嘴豆纳豆发酵过程中，含量较高的挥发性成分为乙醇、3-羟基-2-丁酮、乙酸、反式阿魏酸等，其中，乙醇、异丁酸甲酯及3-羟基丁酸乙酯的含量随发酵时间的增加而逐渐减少，乙酸的含量随发酵时间的增加呈一直上升的趋势，3-羟基-2-丁酮和3-甲氧基-4-羟基肉桂酸的含量呈现先减少后增多的变化趋势，反式阿魏酸的含量随发酵时间的增加呈现先大幅度增多后缓慢减少的变化趋势，且反式阿魏酸为出现在发酵过程中含量最高的挥发性成分，这可能与鹰嘴豆的营养成分有关。
相比于发酵36 h、48 h、60 h的鹰嘴豆纳豆，发酵24 h的鹰嘴豆纳豆中特有的成分有7种，分别为2-羟基-5-甲基苯乙酮（0.07%）、脱氢乙酸（6.23%）、5-甲基壬酸乙酯（0.30%）、亚油酸乙酯（0.32%）、油酸乙酯（0.16%）、9-十六碳烯酸乙酯（1.3%）、5-甲基十一烷（1.63%），总量为10.01%，鹰嘴豆纳豆发酵24 h后挥发性成分减少7种，可能是随着发酵时间的延长，酯类物质会分解为酸和醇类物质，而醇类、酮类、烷烃类物质会进一步转化成其他物质。
在36 h、48 h、60 h时新增了三种吡嗪类物质，分别为2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪，三种吡嗪类物质在发酵36 h时百分比大幅提高，含量随着发酵时间的延长而增加，到达48 h后含量最高，其中2,3,5,6-四甲基吡嗪（川芎嗪）在48 h含量最高，占比17.95%；酸类物质含量随着发酵时间延长先减少后增加，其中在48 h时，反式阿魏酸占比15.16%；酯类物质随发酵时间的延长逐渐从17.54%减少到2.89%，因此发酵48 h的鹰嘴豆纳豆最好。
3 结论
鹰嘴豆纳豆在发酵24 h、36 h、48 h及60 h时分别鉴定出54、50、39和37种挥发性成分，分别占各自总挥发性成分的73.34%、79.85%、82%和79.6%，皆含有醇类、醛类、酮类、酸类、酯类、吡嗪类、烃类、氨气、苯酚和其他类物质，其中吡嗪类、酸类、酯类是主要的鹰嘴豆纳豆挥发性成分。含量较高的相同挥发性成分乙醇、异丁酸甲酯及3-羟基丁酸乙酯的含量随发酵时间的增加而逐渐减少，乙酸的含量随发酵时间的增加呈一直上升的趋势，3-羟基-2-丁酮和3-甲氧基-4-羟基肉桂酸的含量呈现先减少后增多的变化趋势，反式阿魏酸百分比随发酵时间的增加呈现先增多后缓慢减少的趋势，且反式阿魏酸为四种发酵时间中相对含量最高的挥发性成分。
发酵24 h鹰嘴豆纳豆未检出吡嗪类物质，而发酵36 h、48 h、60 h均可检出，包括2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪。随着发酵时间的延长，鹰嘴豆纳豆挥发性成分种类逐渐减少，但在发酵48 h时，2,3,5,6-四甲基吡嗪和反式阿魏酸的相对含量达到峰值，此时黏液含量最大，且拉丝最长，因此发酵时间为48 h的鹰嘴豆纳豆品质高于其它3个发酵时间点的鹰嘴豆纳豆。
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