黑米属于糯米类，呈黑色或者褐色，营养丰富，自古有“药米”、“贡米”、“寿米”之称[1]，现代医学表明，黑米具有预防心脑血管疾病，降低甘油三酯、胆固醇，滋阴养肾，健脾开胃，促进儿童骨骼增长，大脑发育等功效[2-3]。
蜂蜜酒是以蜂蜜和水为原料酿制而成的饮料酒，按生产工艺可以分为发酵型蜂蜜酒和蒸馏型蜂蜜酒[4-5]。因蜂蜜价格高昂，蜂蜜酒被称为贵族酒[6]。近年来关于传统蜂蜜酒的工艺优化及新型蜂蜜酒的研制多参照米酒、露酒和发酵酒的国家标准[7-11]，直到2020年，陶树兴等[4]起草并通过了QB/T 5475—2020《蜂蜜酒》的行业标准，规定了蜂蜜酒的术语和定义、技术要求、分析方法、检验规则和标志、包装、运输和储存，使得蜂蜜酒的研制、生产、检验和销售得以正规化。
我国对蜂蜜酒的研究较少，目前研究主要集中在纯蜂蜜酒[12-15]、中草药蜂蜜酒[16-19]和水果蜂蜜酒[20-23]等几个方面，对谷物蜂蜜酒的研制鲜有研究报道。杜刚等[15]从云南文山蜂蜜中分离纯化出5株酵母菌，以菌株Y3作为发酵菌株对蜂蜜稀释液进行发酵，制得的纯蜂蜜酒酒香和果香浓郁，其中含有41种挥发性成分。邓加聪等[16]以南平野花蜂蜜、百合酶解液和红曲作为原辅料，制得一款色泽清亮、酒香纯正、具有营养保健价值的红曲百合蜂蜜酒。邹璐[22]以红枣、蜂蜜和水为原材料，通过单因素试验和正交试验优化红枣汁的浸提工艺和蜂蜜酒的发酵工艺，制得一款酒体协调、香味浓郁、酒精度为17.9%vol的发酵型红枣蜂蜜酒。国外KOGUCHI M等[24-25]研究发现，黑米和精白米能够显著提高蜂蜜酒的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力，但未对谷物类蜂蜜酒加工工艺进行优化。因此，本研究以黑米和蜂蜜为试验材料，以感官评价为评价指标，通过单因素和响应面试验优化黑米蜂蜜酒发酵工艺，旨在得到黑米蜂蜜酒的最佳发酵工艺条件，既能提高酒精度，又能保留蜂蜜酒特有的风味，为谷物类蜂蜜酒的多样化发展提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑米：延寿县李氏米业有限公司；深山百花蜜（白利度≥42°Bx）：山东归农养蜂股份有限公司；甜酒曲、高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；纯净水：华润怡宝饮料有限公司。
1.2 仪器与设备
KFS-A1型电子称：浙江凯丰集团有限公司；CFXB40BE型电饭煲：广东浩特电器有限公司；LRH-150F型恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；YXQ-50A型立式压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SN-HWS-26型恒温水浴锅：上海尚仪仪器设备有限公司；RHB-32ATC型糖度计：上海天垒仪器仪表有限公司。
1.3 方法
1.3.1 黑米蜂蜜酒酿造工艺流程[13]
1.3.2 操作要点
选米：称取适量的黑米，去除黑米中的杂质、尘土、碎米与细糠。
浸泡：将黑米洗净放置于洁净容器中，加入清水没过黑米浸泡12 h。
蒸煮：黑米沥干水分后放置于蒸锅中，按照液料比6∶1（mL∶g）加入冷水，表面打出小孔，常压蒸煮40 min左右。
淋饭冷却：把蒸好的黑米倒入洁净容器中，用凉开水冲淋黑米表面至易搅拌，再用筷子摊匀，使米饭内外温度冷却至30 ℃左右。
拌曲糖化：选取适量的安琪酒曲，少量多次的洒在黑米上并搅拌均匀，用手轻轻压实，再在表面加入少量的酒曲，黑米中间挖出酒窝，增大与空气的接触面积。
发酵：糖化结束后，接入适量活性干酵母以及与黑米质量比1∶1的纯净水，置于恒温培养箱中32 ℃发酵72 h，至发出浓厚的酒香。
过滤澄清：发酵好的蜂蜜酒用灭菌过的多层纱布过滤3次，静置澄清。
灭菌：取澄清液的上清液，于80 ℃的条件下灭菌15～20 min，得到黑米蜂蜜酒。
1.3.3 黑米蜂蜜酒发酵工艺优化单因素试验设计
在前人研究的基础上[24-25]，以100 g黑米为基准，蜂蜜与黑米质量比分别为4∶100、6∶100、8∶100、10∶100、12∶100（g∶g），酒曲添加量分别为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%（均以100 g黑米质量计），发酵温度分别为26℃、29℃、32℃、35℃、38℃，发酵时间分别为24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，探究蜂蜜与黑米质量比、酒曲添加量、发酵温度及发酵时间对黑米蜂蜜酒酒精度与感官评价的影响，以感官评价为主要评价标准。
1.3.4 黑米蜂蜜酒发酵工艺优化响应面试验
以单因素试验结果为依据，选取对结果影响较大的蜂蜜与黑米质量比（A）、酒曲添加量（B）、发酵温度（C）和发酵时间（D）为自变量，以感官评分为响应值（Y），采用4因素3水平的Box-Behnken响应面试验进行发酵工艺优化，响应面试验因素与水平见表1。
表1 黑米蜂蜜酒发酵工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation technology optimization of black rice mead
1.3.5 黑米蜂蜜酒感官评价
黑米蜂蜜酒感官评分参照中华人民共和国轻工行业标准QB/T 5475—2020《蜂蜜酒》，取50 g样品于干净的透明玻璃杯中，在自然光亮处，由10人组成评价小组，对酒液进行评价，主要从色泽（10分）、香味（30分）、滋味（50分）、外观（10分）四个方面依次对成品进行评分，总分为100分，黑米蜂蜜酒的感官评分标准见表2。
表2 黑米蜂蜜酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of black rice mead
1.3.6 分析检测
酒精度的测定参照国标GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》的酒精计法测定；总酸、挥发性酸和总糖按国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行测定。
1.3.7 数据处理
本试验数据分析采用Excel 2019和Design Expert.V8.0.6软件进行数据处理。
2 结果与分析
2.1 发酵工艺优化单因素试验结果
2.1.1 蜂蜜与黑米质量比对黑米蜂蜜酒酒精度与感官评价的影响
蜂蜜与黑米质量比对黑米蜂蜜酒酒精度与感官评价的影响见图1。由图1 可知，当原料比处于4∶100～6∶100（g∶g）时，蜂蜜酒中的蜂蜜风味较淡，酒精度较低；当蜂蜜与黑米质量比在6∶100时，酒体风味协调，口味较好，酒精度较高，为11.4%vol，此时蜂蜜酒感官评分最高，为82.3分；随着蜂蜜与黑米质量比的不断增加，初始糖度逐渐增大，当蜂蜜与黑米质量比＞8∶100（g∶g）时，酒液开始变浑浊，高渗透压抑制了部分酿酒酵母的生物活性[5，14]，酒精度有所下降，蜂蜜味较浓，感官评分有所降低。综合考虑，最佳蜂蜜与黑米质量比为6∶100。
图1 蜂蜜与黑米质量比对黑米蜂蜜酒酒精度与感官评价的影响
Fig.1 Effects of mass ratio of honey and black rice on alcohol content and sensory evaluation of black rice mead
2.1.2 酒曲添加量对黑米蜂蜜酒酒精度与感官评价的影响
酒曲添加量对黑米蜂蜜酒酒精度与感官评价的影响见图2。由图2可知，随着酒曲添加量在0.2%～1.0%范围内的增加，蜂蜜酒的酒精度与感官评分呈现出先上升后下降的趋势。当酒曲添加量在0.2%～0.6%时，蜂蜜酒的酒精度与感官评分随酒曲添加量增加而增高；当酒曲添加量在0.6%时，蜂蜜酒的酒精度与感官评分最高，分别为11.4%vol、80.4分；当酒曲添加量＞0.6%之后，过量的酵母会额外消耗掉蜂蜜酒中的糖分用于生长繁殖，不利于酒精发酵，酒精度有所下降，导致黑米蜂蜜酒整体风味有所下降[13]。综合考虑，酒曲的最佳添加量为0.6%。
图2 酒曲添加量对黑米蜂蜜酒酒精度与感官评价的影响
Fig.2 Effects of Jiuqu addition on alcohol content and sensory evaluation of black rice mead
2.1.3 发酵温度对黑米蜂蜜酒酒精度与感官评价的影响
发酵温度对黑米蜂蜜酒酒精度与感官评价品质的影响见图3。由图3可知，当蜂蜜酒发酵温度为26～32 ℃时，黑米蜂蜜酒酒精度与感官评价随发酵温度增加而逐渐提高，由于温度偏低导致微生物发酵不完全，酒香味低，黑米风味不明显；当发酵温度达到32 ℃时，发酵速度明显加快，微生物代谢旺盛，酒香味明显，此时酒精度及感官评分最高，分别为11.4%vol、82.7分；当发酵温度高于32 ℃之后，微生物生长繁殖加快，容易造成酵母菌早衰，而杂菌代谢旺盛[26]，酒精度降低，蜂蜜酒品质迅速变差，同时酒体开始浑浊，导致感官评价值偏低。综合考虑，最佳发酵温度为32 ℃。
图3 发酵温度对黑米蜂蜜酒酒精度与感官评价的影响
Fig.3 Effects of fermentation temperature on alcohol content and sensory evaluation of black rice mead
2.1.4 发酵时间对黑米蜂蜜酒酒精度与感官评价的影响
发酵时间对黑米蜂蜜酒酒精度与感官评价的影响见图4。由图4可知，随着发酵时间在24～120 h范围内的增加，蜂蜜酒的感官评分呈现先迅速增加后缓慢降低的趋势，酒精度呈现先迅速升高后趋于不变的趋势。当发酵时间为24～72 h时，黑米蜂蜜酒酒精度与感官评价随发酵时间增加而逐渐提高，由于发酵时间较短，大部分酿酒酵母处于增殖阶段，酒精产量较少，酒精度较低，导致风味相对不明显；当发酵时间在72 h时，蜂蜜酒感官评分最高，为81.9分，酒精度为11.5%vol；而当发酵时间＞72 h之后，由于发酵时间较长，酒精度虽然仍缓慢升高，但由于菌体开始出现衰亡自溶，口感会呈现出苦味，酒体不协调，导致感官评分较低[18]。综合考虑，最佳发酵时间为72 h。
图4 发酵时间对黑米蜂蜜酒产品酒精度与感官评价的影响
Fig.4 Effects of fermentation time on alcohol content and sensory evaluation of black rice mead
2.2 发酵工艺优化响应面试验结果
2.2.1 响应面试验结果与方差分析
在单因素试验结果基础上，以感官评分作为响应值（Y），蜂蜜与黑米质量比（A）、酒曲添加量（B）、发酵温度（C）和发酵时间（D）为自变量，采用响应面法进行优化，筛选出黑米蜂蜜酒的最佳发酵工艺条件，响应面试验设计及结果见表3，方差分析结果见表4。
表3 黑米蜂蜜酒的响应面试验设计及结果
Table 3 Design and results of response surface tests for black rice mead
续表
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果的影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果的影响极显著（P＜0.01）。
采用Design Expert.V8.0.6软件对表3中的结果进行回归拟合和方差分析，得到模型的二次多项回归方程为：
根据表4可知，该模型极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P=0.720 0＞0.05），表明理论和实际值偏差很小，拟合度较高，得到的方程可以很好地预测结果。一次项A、B、D对黑米蜂蜜酒感官评分的影响极显著（P＜0.01）。决定系数R2=0.970 4，调整决定系数R2adj=0.940 9，可知此模型中的94.09%黑米蜂蜜酒的感官评分变化来自于自变量A、B、C、D。通过F值和显著水平得到影响感官评分的各因素顺序为酒曲添加量（B）＞发酵时间（D）＞原料比（A）＞发酵温度（C）。
2.2.2 响应面交互作用
各因素交互作用对黑米蜂蜜酒感官评分影响的响应曲面及等高线见图5。
图5 各因素交互作用对黑米蜂蜜酒感官评分影响的响应面与等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the sensory score of black rice mead
由图5可知，当原料比（A）、酒曲添加量（B）、发酵温度（C）和发酵时间（D）两两交互作用时，对黑米蜂蜜酒感官评价均有影响，但影响不够显著，各响应曲面陡峭程度存在一定差异。AB坡面上感官评分随着A、B的增加呈现先快速升高后缓慢降低的趋势，AC、AD、BC、BD、CD坡面上感官评分随着A、B、C、D的增加均呈现先缓慢升高后快速降低的趋势，能够说明存在感官评分的最大值点。
由Design Expert.V8.0.6软件预测得出黑米蜂蜜酒最佳发酵工艺为：蜂蜜与黑米质量比6∶100（g∶g）、酒曲添加量0.56%、发酵温度32.50 ℃、发酵时间78.11 h，此时感官评分理论值为85.7分。为了便于实际操作，将发酵工艺修正为蜂蜜与黑米质量比6∶100（g∶g）、酒曲添加量0.6%、发酵温度33 ℃、发酵时间78 h。在此优化发酵工艺下进行3次平行验证试验，感官评分实际值为87.1分，与预测值相差不大，表明该工艺可行。
2.3 产品理化指标检测结果
将优化工艺酿制出的黑米蜂蜜酒进行理化指标检测，结果见表5。
表5 黑米蜂蜜酒理化检测结果
Table 5 Physical and chemical test results of black rice mead
3 结论
通过单因素及响应面试验得到黑米蜂蜜酒最佳发酵工艺条件为蜂蜜与黑米质量比6∶100、酒曲添加量0.6%、发酵温度33 ℃、发酵时间78 h。在此优化条件下，感官评分为85.7分，酒精度为12.7%vol，总酸（以乙酸计）为4.5 g/L，挥发性酸（以乙酸计）为0.8 g/L，总糖为57.2 g/L。黑米蜂蜜酒呈酒红色，酒体协调，色泽均匀，底部无明显沉淀物，酒味浓郁无明显酸味和苦涩味，兼有黑米和蜂蜜特殊风格，口感更为爽口。本研究可为我国蜂蜜酒大规模工业化生产提供理论基础。
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