枇杷（Eriobotrya japonica）对于我国南方来说是一种珍稀的特色果品，蒙自长虹枇杷果实果肉鲜嫩多汁、甜中带酸、风味独特，一直深受人们的欢迎[1-3]。梨和枇杷一样属于蔷薇科，其中贡梨表皮金黄，果肉鲜嫩多汁，口感香脆，深受广大消费者喜欢[4-6]。果酒是以各种水果或果汁为原料，通过自然发酵或人工添加酵母菌酿造而成的低酒精度饮料酒，果酒不仅保留了水果中绝大部分的营养物质，而且水果经发酵产生多种功能性成分，因而果酒具备较好的保健功能[7]。目前对于果酒发酵工艺的研究主要集中在葡萄酒等单一品种果酒，对于使用两种及以上水果为原料酿造复合果酒的研究呈逐渐上升的趋势[8-9]。目前，大部分对枇杷和贡梨的研究主要集中在保鲜、活性成分提取以及果脯类食品的加工等方面，而对于将两者酿制成果酒的研究鲜有报道[11-12]。枇杷和梨同属于药食同源的食物，在中医中均具有生津健胃、润肺止咳之功效，因此将两者酿制成复合果酒，不仅可以丰富果酒的品种，还能赋予果酒多种保健功效，复合消费者对于健康饮食的需求。本研究以枇杷与贡梨为原料，采用单因素试验和响应面试验优化枇杷-贡梨复合果酒的发酵工艺，酿造出绿色营养满足广大消费者需求的复合果酒，不仅可以解决水果资源因不易贮藏和保鲜造成的浪费问题，而且可以丰富市场上果酒的种类，满足人们对复合果酒的不同消费需求；还可以对枇杷和贡梨的深加工产业提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
枇杷：蒙自长虹星；贡梨：市售。纤维素酶（80 000 U/g）、果胶酶（80 000 U/g）、焦亚硫酸钾、柠檬酸：友谊食品添加剂公司；果酒酵母：安琪酵母有限公司；甲醇、乙醇（均为色谱纯）：天津化学试剂三厂；维生素C、盐酸、氢氧化钠、葡萄糖、次甲基蓝、酒石酸钾钠、硫酸铜、硫酸、酚酞（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；实验室用水均使用蒸馏水。
1.2 仪器与设备
GC-2010型气相色谱仪：日本岛津有限责任公司；GSP-9160MBE型隔水式恒温培养箱：上海博讯实业有限公司；CP224C型电子天平：上海奥豪斯仪器有限公司；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱：上海齐欣科学仪器有限公司；PHS-3C型pH计：上海雷磁-上海仪电科学仪器股份有限公司；手持糖度计LB90A：广州市铭睿电子科技有限公司；JYLY15型九阳高速破壁调理机：九阳股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 枇杷-贡梨复合果酒加工工艺流程
1.3.2 操作要点
预处理：挑选无机械破损、成熟的新鲜长虹枇杷果实，洗净，在95 ℃的沸水中热烫20～30 s后放入冷水冷却，去除果皮、果核、白膜，将果肉放入含有0.05%维生素C和0.15%柠檬酸的护色液中浸泡10 min，取出放入榨汁机中破碎打浆；选择无虫害、成熟度的贡梨，洗净，去除果皮和果核，切成小块，放入护色液中浸泡10 min，取出放入榨汁机中，加入0.1%的维生素C破碎打浆。
酶解：将枇杷汁和贡梨汁按一定比例混合，按0.1 g/L的用量分别加入纤维素酶和果胶酶，50 ℃恒温水浴搅拌3 h，酶解后迅速加热至90 ℃灭酶5 min，冷却备用。
调配：添加适量偏重亚硫酸钾，用白砂糖调节果汁糖度，用柠檬酸调节果汁的pH。
酵母活化：称取1g的活性干酵母于烧杯中，再加入10mL 2%的葡萄糖溶液，在37 ℃条件下活化30～40 min。
过滤、澄清：发酵结束后，用过滤袋分离果酒和果渣，即得枇杷-贡梨复合果酒。
1.3.3 枇杷-贡梨复合果酒发酵工艺优化单因素试验
枇杷汁和贡梨汁体积比的确定：将破碎打浆后的枇杷汁和贡梨汁分别按1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1的体积比进行混合，调整初始糖度240 g/L、初始pH4.0、酵母接种量为0.10%、SO2添加量为40 mg/L，置于20 ℃的条件下发酵，以感官评分和酒精度为评价指标，并考察枇杷汁和贡梨汁体积比对复合果酒发酵的影响。
初始pH值的确定：枇杷汁与贡梨汁的体积比为1∶2，加入40 mg/L的SO2（焦亚硫酸钾），初始pH分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，接入0.1%的酵母，在22 ℃的条件下发酵7 d，测定果酒的酒精度及残糖量，并考察初始pH值对复合果酒发酵的影响。
酵母添加量的确定：枇杷汁与贡梨汁的体积比为1∶2，加入40 mg/L的SO2，初始pH值为4.5，分别接入0.05%、0.10%、0.20%、0.30%和0.40%的活化酵母，在22 ℃的条件下发酵7 d，测定果酒的酒精度及残糖量，并考察酵母添加量对复合果酒发酵的影响。
发酵温度的确定：枇杷汁与贡梨汁的体积比为1∶2，加入40 mg/L的SO2，初始pH值为4.5，接入0.2%的酵母、分别置于20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃和28 ℃的条件下发酵7 d，测定果酒的酒精度及残糖量，并分析发酵温度对复合果酒发酵的影响。
SO2添加量的确定：枇杷汁与贡梨汁的体积比为1∶2，加入0、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L和100 mg/L的SO2，初始pH值为4.5，接入0.2%的酵母、在22 ℃的条件下发酵7 d，测定果酒的酒精度及残糖量，并考察SO2添加量对复合果酒发酵的影响。
1.3.4 枇杷-贡梨复合果酒发酵工艺优化响应面试验
根据单因素的试验结果，从中选择初始pH值（A）、酵母添加量（B）、发酵温度（C）和SO2添加量（D）4个因素为自变量，以酒精度（Y）作为响应值，采用4因素3水平的响应面试验分析法，对发酵工艺条件进行优化[13]。响应面试验设计因素与水平见表1。
表1 响应面试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiments design
1.3.5 理化指标测定
酒精度测定：采用密度瓶法；总糖测定：采用直接滴定法[14]。
1.3.6 感官指标测定
枇杷-贡梨复合果酒感官评价参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，请经果酒感官培训的10 位人员，对果酒色泽、透明度、香气、滋味和典型性5 项指标进行评价，取平均值作为最终感官得分[15]。
表2 枇杷-贡梨复合果酒感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of loquat-pear compound fruit wine
续表
1.3.7 数据分析
采用Design Expert 8.0.6软件对响应面试验数据进行分析。采用Origin 8.5软件进行数据的初步处理及作图，用SPSS Statistics 19.0软件进行显著性分析，认为P＜0.05时差异显著，试验结果用“均值±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 枇杷-贡梨复合果酒单因素试验
2.1.1 果汁混合比例的确定
由图1可知，枇杷汁与贡梨汁的不同体积比对复合果酒的感官品质影响较大，枇杷经榨汁所得枇杷汁相比于梨汁而言较浓稠，当枇杷汁比例过高时酒体颜色加深，澄清度有所下降，造成果酒感官品质的下降；而当梨汁含量较高时果酒颜色较浅，酒体果香不够突出。枇杷汁与贡梨汁体积比为1∶2时，果酒的感官评分是最高的，达到81.33分，复合果酒颜色为淡黄色，口感较为柔和，同时含有两种水果的风味，枇杷香气特征突出。不同的枇杷汁与贡梨汁体积比对酒精度的影响不大，酒精度基本处于12%vol～12.5%vol范围内且组间差异不显著（P＞0.05）；果酒的酒精度主要与初始糖度相关，虽然发酵的果汁比例不同但是发酵初始糖度一致，所以所得果酒的酒精度变化不大。因此，选择枇杷汁与贡梨汁的最佳体积比为1∶2。
图1 不同枇杷汁与贡梨汁的体积比对枇杷-贡梨复合果酒品质的影响
Fig.1 Effect of different volume ratio of loquat juice and pear juice on the quality of loquat-pear compound fruit wine
2.1.2 不同初始pH对枇杷-贡梨复合果酒发酵的影响
由图2可知，随着发酵液初始pH值的升高，复合果酒酒精度呈先上升后下降的趋势，残糖量逐渐降低。当发酵液初始pH值＜4.0时，发酵环境酸性较高，不利于酵母菌的生长，影响发酵速率，所得果酒的酒精度偏低，酒精度在10.39%vol～11.95%vol之间；当发酵液的初始pH值为4.5时，有利于酵母菌的生长繁殖，果酒发酵更充分，复合果酒的酒精度达到最高值12.50%vol，发酵液残糖量降到最低5.45 g/L；当发酵液的初始pH值＞4.5时，其他微生物的生长和繁殖增多，进而消耗较多的可发酵性糖，杂菌的生长繁殖还会影响酵母的繁殖和酒精代谢，这时复合果酒的酒精度较低，发酵液残糖量略有升高[16-17]。初始pH值为4.5、4.0、5.0的酒精度组间存在显著性差异（P＜0.05）。因此，选择发酵液初始pH值为4.5。
图2 不同初始pH值对枇杷-贡梨复合果酒的影响
Fig.2 Effect of different initial pH on the quality of loquat-pear compound fruit wine
2.1.3 不同酵母添加量对枇杷-贡梨复合果酒发酵的影响
由图3可知，随着酵母添加量的增加，复合果酒的酒精度呈先上升后下降的趋势，发酵液的残糖量不断降低。当酵母添加量在0.05%～0.20%时，初始酵母数量较低会导致酒精发酵阶段酵母数量不足，发酵时间延长，发酵时间结束时，发酵液还残留较多的可发酵性糖，进而所得复合果酒的酒精度偏低；当酵母的添加量为0.2%时，初始酵母数量较高，在酒精发酵阶段酵母菌的数量充足，果酒发酵充分，可发酵性糖的消耗激增，所得复合果酒的酒精度达到最高值12.5%vol；当初始酵母添加量＞0.2%之后，因为酵母的大量生长繁殖，会有较多的糖类用于酵母的生长和繁殖，进而用于酒精代谢的糖类偏少，使得所得复合果酒的酒精度偏低[18]。酵母添加量为0.20%与0.10%、0.30%的酒精度组间存在显著性差异（P＜0.05）。因此，最优的酵母添加量为0.20%。
图3 不同酵母添加量对枇杷-贡梨复合果酒发酵的影响
Fig.3 Effect of different yeast inoculum on the quality of loquat-pear compound fruit wine
2.1.4 不同发酵温度对枇杷-贡梨复合果酒发酵的影响
由图4可知，当发酵温度在20～22 ℃时，复合果酒的酒精度偏低而发酵液残糖含量最高，因为较低的发酵温度不利于酵母菌的生长和繁殖，酵母的代谢速率随之减缓，发酵时间随之延长，复合果酒的酒精度偏低；当发酵温度为22 ℃时，酵母的生长和繁殖速率最有利酒精的合成，果酒发酵充分，此时复合果酒酒精度最高12.39%vol，发酵液残糖量最低6.26 g/L；当发酵温度高于26 ℃之后，酵母菌的生长繁殖速度加快，衰老和死亡速率随之提高，较高的发酵温度有利于其他微生物的生长和繁殖，酵母的酒精代谢会受到抑制，因此复合果酒的酒精度低随之降低[19-20]。发酵温度为22 ℃与发酵温度为20 ℃、24 ℃的酒精度组间具有显著性差异（P＜0.05）。因此，最适的发酵温度为22 ℃。
图4 不同发酵温度对枇杷-贡梨复合果酒品质的影响
Fig.4 Effect of different fermentation temperature on the quality of loquat-pear compound fruit wine
2.1.5 不同SO2添加量对枇杷-贡梨复合果酒发酵的影响
由图5可知，复合果酒的酒精度随SO2添加量的增加呈先升高后降低的趋势，发酵液残糖含量不断升高。当SO2的添加量＜60 mg/L之前，发酵液中其他微生物的生长不能被彻底抑制，其生长和繁殖不仅会消耗较多的糖还会影响酵母的生长和代谢，导致酒精度的积累量偏低；当SO2添加量为60 mg/L时，酒精度达到最高值，为12.53%vol；当SO2添加量＞60 mg/L之后，对酵母菌的生长繁殖产生抑制作用，复合果酒的酒精度随之降低，而残糖量则随之增加[21]。SO2添加量为60 mg/L的酒精度与其他处理组均具有显著性差异（P＜0.05）。因此，SO2的最佳添加量为60 mg/L。
图5 不同SO2添加量对枇杷-贡梨复合果酒品质的影响
Fig.5 Effect of different SO2 addition on the quality of loquat-pear compound fruit wine
2.2 响应面分析试验优化与结果分析[22]
根据单因素的试验结果，固定枇杷汁与贡梨汁最佳体积比为1∶2，选择初始pH值（A）、酵母添加量（B）、发酵温度（C）和SO2添加量（D）四个因素为自变量，以酒精度（Y）作为响应值，响应面试验设计与结果见表3，方差分析见表4。
表3 响应面试验设计与结果
Table 3 Design and results of response surface experiments
表4 回归模型的方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
利用Design Expert 8.0.6软件对表3中得到的响应面试验结果进行多元线性回归拟合，可以初步得到枇杷-贡梨复合果酒的酒精度（Y）对应发酵工艺条件中初始pH值（A）、发酵温度（B）、酵母添加量（C）和SO2添加量（D）的回归方程模型为Y=12.81+0.22A+0.023B+0.071C+0.046D+0.14AB-0.067AC+0.11AD-0.27BC+0.15BD-0.15CD-0.96A2-0.68B2-0.66C2-0.47D2。
由表4可知，该模型P值＜0.000 1，差异极显著；失拟项的P值为0.786 0＞0.05，所以差异不显著，可得出试验所得的模型拟合性较好[23-24]。从模型中各个影响因素的决定系数R2=0.978 3，调整决定系数R2Adj=0.974 4，对于实际试验中的响应值，该模型能够做出98.72%的解释，因此本模型适用于分析和预测枇杷-贡梨复合果酒的发酵工艺条件。一次项A、C，交互项AB、AD对试验结果影响显著（P＜0.05）；二次项系数的P值均＜0.001，模型的曲面效应极显著；交互项BC、BD、CD对试验结果影响极显著（P＜0.01）。通过比较F值的大小可以得出，对枇杷-贡梨复合果酒酒精度产生影响顺序为初始pH值（A）＞酵母添加量（C）＞SO2添加量（D）＞发酵温度（B）。
2.2.1 交互作用分析
从响应面图和等高线的变化趋势可以反映出各个因素之间的交互作用对枇杷-贡梨复合果酒的酒精度的影响情况。曲面坡度大小来表示各因素对酒精度（响应值）的影响程度，曲面坡度越陡峭表示各因素的交互作用对酒精度的影响程度越大，曲面坡度越平缓则影响程度越小[25-26]。
由图6可知，初始pH值和发酵温度交互形成的曲面的坡度较大，说明其对酒精度的影响较大，但等高线图近似椭圆形说明交互作用较显著；初始pH值和酵母添加量、初始pH值和SO2添加量两两交互形成的曲面的坡度较大，说明其两两对酒精度的影响较大，但是等高线图近似圆形说明两两交互作用不显著；发酵温度和酵母添加量、发酵温度和SO2添加量、酵母添加量和SO2添加量因素对酒精度的影响较大且交互作用极显著。
图6 初始pH值、二氧化硫添加量、酵母添加量和发酵温度交互作用对复合果酒酒精度影响的响应面及等高线
Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between initial pH value,SO2 addition,yeast inoculum and fermentation temperature on the alcohol content of compound wine
2.2.2 最佳工艺条件的预测与检验
利用Design-Expert8.0.6软件对该模型优化求解得出枇杷-梨复合果酒发酵工艺的最佳参数为：初始pH值为4.56，发酵温度为22.06 ℃，酵母添加量为0.2%，SO2添加量为61.23 mg/L；模型预测酒精度为12.83%vol。为了便于实际操作，将枇杷-贡梨复合果酒的最优发酵工艺条件修改为枇杷汁与贡梨汁的体积比为1∶2，SO2的添加量为61 mg/L，发酵温度为22 ℃，初始pH值为4.6，酵母添加量为0.2%。在此最佳条件下，复合果酒的酒精度为12.67%vol，表明实际值与理论值相差较小，用此模型进行试验设计和数学模型具有可靠性。
3 结语
通过采用单因素试验和响应面分析试验，对枇杷-贡梨复合果酒发酵过程中主要发酵条件的分析，得出对复合果酒影响最大的是酵母添加量，其次是初始pH值和发酵温度，而SO2添加量的影响最小；枇杷-贡梨复合果酒的最佳发酵工艺条件为：枇杷汁与贡梨汁的体积比1∶2，SO2添加量61 mg/L，发酵温度22 ℃，初始pH值4.6，酵母添加量0.2%。在此最优发酵条件下，复合果酒的酒精度为12.67%vol，酒体呈淡黄色、澄清透明、果香浓郁、口感醇厚。枇杷-贡梨复合果酒的研制不仅为枇杷和贡梨的深加工艺提供理论依据，还可以丰富果酒市场，推动果酒产业的发展。
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