黄豆渣是豆腐、豆浆、腐乳等豆制品加工过程中的主要副产物，其营养丰富，主要包括膳食纤维、蛋白质、脂肪、维生素及矿物质元素等，还含有异黄酮、皂苷等抗氧化活性成分，具有调节肠道菌群、辅助糖尿病治疗等保健功能[1-2]。但豆渣因颗粒大、口感粗糙，水分含量高、易腐烂、不易贮存等原因，长期被人们忽视，多作为畜禽饲料或直接废弃，造成极大的资源浪费及环境污染。
目前，豆渣主要用于豆渣饲料加工[3]、功能成分[4-5]提取、豆渣食品研制[6-9]、制曲[10]、培养基制作[11]等，也有很多发酵豆渣的研究[12-13]。申春莉等[14]采用灵芝菌丝体固态发酵豆渣后，总膳食纤维及脂肪含量下降，而可溶性蛋白、氨基酸态氮及多肽含量升高；GUPTA S等[15]研究发现，益生菌发酵豆渣后，豆渣的营养成分得到改善，抗氧化活性提高。
目前，对豆渣发酵产品多停留在前发酵阶段或制曲阶段，缺少对后发酵过程中豆渣酱各种营养成分及风味成分的研究[16-18]。本研究以豆渣为主要原料，采用米曲霉（Aspergillus oryzae）AS3.951制曲后进行发酵，制备黄豆渣酱，按照国标方法对其感官、理化及微生物指标进行测定，采用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）、氨基酸自动分析仪、超高效液相色谱串联四级杆质谱（ultra performance liquid chromatography tandem quadrupole mass spectrometry，UPLC-MS/MS）分别对其挥发性风味成分、游离氨基酸、异黄酮及酚类物质进行测定，并考察其对体外抗氧化活性，以期实现豆渣的高值化利用，减少资源浪费。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黄豆渣：自制；小麦粉、食盐：市售；米曲霉（Aspergillus oryzae）AS3.951（沪酿3.042）曲精：北京市食品酿造研究所；氯化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；福林酚（分析纯）、碳酸钠（分析纯）、维生素C（vitamin C，VC）（分析纯）、氨基酸标准品（纯度＞98%）、2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（均为分析纯）：美国Sigma公司；黄酮及多酚单体标准品（纯度均＞98%）：上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯）：德国默克有限公司。
1.2 仪器与设备
DHG-9051A电热恒温干燥箱、DHP-9051B微生物培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；KJELTEC 2300凯氏定氮仪：美国FOSS公司；722型数显可见分光光度计：上海光学仪器五厂有限公司；1290 infinity II-6470超高效液相色谱串联四级杆质谱仪、5975-7890A气相色谱-质谱仪：美国Agilent科技有限公司；5424高速冷冻离心机：德国Eppendorf科技有限公司；L-8900全自动氨基酸分析仪：日本日立科技有限公司；65 μm PDMS/DVB萃取头：美国Supelco有限公司；DT-FXG发酵罐：浙江东铁机械设备有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 黄豆渣酱加工工艺流程及操作要点[19]
操作要点：
黄豆渣、蒸煮：取生产腐乳后的残余黄豆渣，在压力0.1 MPa、温度121 ℃条件下蒸煮40 min，保温保压2 h，获得熟料。
冷却、混匀：待黄豆渣熟料于冷却槽中自然降温至60 ℃时与小麦粉按质量比3∶2混合均匀。
制曲：当混合物料冷却至35 ℃时，接种质量比为0.07%的米曲霉AS3.951曲精，搅拌均匀后，在30 ℃条件下培养48 h，每4～6 h翻曲一次，制得曲料；此时曲料呈黄绿色，表面有孢子。
发酵：在曲料中拌入20°Bé的盐水（温度50 ℃），盐水与曲料质量比为5∶3，搅拌均匀后放入发酵罐中，每个发酵罐中加入10 kg曲料，于42 ℃条件下进行发酵，每天搅拌一次，发酵60 d。
灭菌、灌装：发酵产物灭菌后灌装即得黄豆渣酱成品。
1.3.2 黄豆渣酱基本指标的测定
（1）感官指标
按照GB 2718—2014《食品安全国家标准酿造酱》对黄豆渣酱的色泽、滋味、气味及状态进行感官评价。
（2）理化指标
水分含量：按照GB 5009—2016《食品中水分的测定》测定；铵盐含量：按照GB 5009.234—2016《食品中铵盐的测定》测定；氨基酸态氮含量：按照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》测定；总氮含量：按照GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》测定；总酸含量：按照GB/T 5009.39—2003《酱油卫生标准的分析方法》测定；还原糖含量：按照GB 5009.7—2016《食品中还原糖的测定》测定；食盐含量：按照GB 5009.44—2016《食品中氯化物的测定》测定。
（3）微生物指标
沙门氏菌、金黄色葡萄球菌：按照GB 29921—2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》测定；大肠菌群：按照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》测定。
1.3.3 黄豆渣酱挥发性风味物质的测定
样品处理：准确称取4.0 g黄豆渣酱样品于20 mL顶空瓶中，加入1.0 g氯化钠调节离子强度，吸取内标物3-辛醇溶液（100 μg/mL）10 μL。用65 μm PDMS/DVB萃取头对样品中的挥发性风味化合物进行富集提取。萃取温度50 ℃，萃取时间40 min，振荡速率200 r/min，振荡时间40 min。萃取后于气相色谱仪进样口解吸5 min，进行GC-MS分析。
GC条件：HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为高纯氦气（He），流速1.0 mL/min，采用不分流模式进样；进样口温度250 ℃。升温程序：40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升至100 ℃，再以6 ℃/min的速度升至220 ℃并保持10 min。
MS条件：电离方式为电子离子（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV；离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃；扫描模式为全扫描，扫描范围35～400 amu。
定性及定量方法：采用美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）08谱库检索进行化合物组成的分析，保留匹配度＞750的化合物；采用半定量法定量。
1.3.4 黄豆渣酱游离氨基酸组成的测定
按照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》测定黄豆渣酱中游离氨基酸的含量。
1.3.5 黄豆渣酱活性成分分析
大豆异黄酮及酚类化合物含量的测定采用UPLC-MS/MS法[20]并进行修改。液相色谱条件：色谱柱为Eclipse plusC18色谱柱（50 mm×3.0 mm，1.8 μm），柱温40 ℃，流速0.4 mL/min。流动相：A为0.1%甲酸溶液，B为甲醇，流动相梯度洗脱程序：0～1 min，90%A；1～6 min，90%～40%A；6～10 min，40%～10%A；10～12 min，10%A，12～14 min，90%A。进样量1.0 μL。质谱条件：采用电喷雾离子（electron spray ionization，ESI）源，负离子模式，喷雾电压3 000 V，辅助气气化温度200 ℃，鞘气流速11 mL/min，鞘气温度325 ℃。根据标准品保留时间定性，采用外标法进行定量。
1.3.6 抗氧化能力分析
DPPH、ABTS自由基清除能力的测定：参考张欢欢等[21]的方法。分别测定不同质量浓度的黄豆渣酱对DPPH和ABTS自由基的清除率，并计算出黄豆渣酱清除DPPH和ABTS自由基的半抑制浓度（half maximal inhibitory concen tration，IC50）值。以抗坏血酸作为自由基清除能力当量物质，配制不同浓度的抗坏血酸溶液，分别以其浓度（x）和自由基清除率（y）为横纵坐标，绘制标准曲线（y（DPPH自由基清除率）=0.894 2x+1.605 5，R2=0.997；y（ABTS自由基清除率）=0.688 9x-0.321 3，R2=0.996），并计算DPPH和ABTS自由基清除能力，以μmol维生素C当量（vitamin C equivalent，VCE）/g表示。
1.3.7 数据处理与分析
采用OriginPro 8.5.1软件对试验数据进行统计与分析；试验重复3次，结果以平均值的形式表示。
2 结果与分析
2.1 黄豆渣酱的感官指标
由表1可知，黄豆渣酱呈棕褐色，有光泽；味鲜醇厚，咸甜适口，无苦、焦糊及其他异味；有浓厚的酱香和酯香；无霉斑、无外来异物，其感官指标符合GB 2718—2014《食品安全国家标准酿造酱》要求。
表1 黄豆渣酱的感官指标
Table 1 Sensory indexes of soybean residue paste
2.2 黄豆渣酱的理化指标
由表2可知，黄豆渣酱的氨基酸态氮含量达到0.44g/100g，高于GB 2718—2014《食品安全国家标准酿造酱》要求≥0.30 g/100 g，其他理化指标均满足国标要求。
表2 黄豆渣酱理化指标的测定结果
Table 2 Determination results of physical and chemical indexes of soybean residue paste
2.3 黄豆渣酱的微生物指标
由表3可知，黄豆渣酱中大肠菌群＜10 CFU/g，致病菌沙门氏菌未检出，金黄色葡萄球菌＜10 CFU/g，结果表明，黄豆渣酱微生物指标满足GB 29921—2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》及GB 2718—2014《食品安全国家标准酿造酱》要求。
表3 黄豆渣酱微生物指标的测定结果
Table 3 Determination results of microbial indexes of soybean residue paste
注：n为同一批次产品应采集的样品件数；c为最大可允许超出m值的样品数；m为微生物指标可接受水平的限量值；M为微生物指标的最高安全限量值。
2.4 黄豆渣酱中挥发性风味成分分析
采用GC-MS测定黄豆渣酱中的挥发性风味成分，挥发性成分种类及含量见表4。
表4 黄豆渣酱中挥发性风味化合物GC-MS分析结果
Table 4 Results of volatile flavor substances in soybean residue paste analyzed by GC-MS
续表
由表4可知，通过GC-MS分析，从黄豆渣酱中共鉴定出60种挥发性风味化合物，包括醇类（4种）、酸类（12种）、酯类（11种）、醛类（11种）、酮类（6种）、酚类（3种）和其他类（13种），其中，其他类含量（7 346.39 μg/100 g）最高，酸类物质含量（2 234.93 μg/100 g）次之，酚类物质含量（243.98 μg/100 g）最少。这些挥发性化合物互相融合，共同形成了黄豆渣酱味鲜醇厚，酱香和酯香浓厚的独特风味。
醇类物质主要是在发酵过程中由微生物代谢、不饱和脂肪酸降解及羰基化合物的还原反应生成的，具有芳香和植物香气[22]。从黄豆渣酱中共检出4种醇类物质，包括正辛醇、苯乙醇、乙醇及苯甲醇。其中，正辛醇含量（500.00μg/100g）最高，苯乙醇含量（227.41 μg/100 g）次之，苯乙醇具有新鲜面包味和玫瑰花香[23]。
酸类物质可能是由微生物产生的脂肪酶对大豆油脂降解所产生，低分子质量脂肪酸也可能通过酵母或乳酸菌代谢生成[24]。从黄豆渣酱中共检出12种酸类物质，包括乙酸、3-甲基丁酸、甲基丙二酸、2-甲基丙酸等。除乙酸外，3-甲基丁酸含量（445.78 μg/100 g）最高，其具有辛辣味、酸味及尖刺的奶酪味[20，25]。
酯类物质是由脂肪氧化产生的醇和游离脂肪酸相互作用形成的，主要呈水果香味。从黄豆渣酱中共检测出11种酯类物质，包括丁二酸单甲酯、十六烷酸乙酯、（E）-9-十八烯酸乙酯、9,12-十八烯酸乙酯、苯乙酸乙酯、3-羟基-2,3,4,5-四甲基-戊酸乙酯、乙酸乙烯酯等。其中，丁二酸单甲酯含量（173.19μg/100g）最高，其次为十六烷酸乙酯（103.92μg/100g）。
醛酮类化合物一般由氨基酸脱氨脱羧、酮酸脱羧、醇氧化等化学反应生成。从黄豆渣酱中共检出11种醛类和6种酮类，醛类物质包括5-甲基-2-苯基-2-己烯醛、5-甲基-2-糠醛、苯甲醛等，酮类物质包括2-叔丁基-5-甲基[1，3]二氧戊环-4-酮、3-羟基-2-丁酮等。其中，糠醛呈甜香、杏仁香气，对国内酱的风味贡献较大[26]。康蕾[27]也从黄豆酱中检测出了3-羟基-2-丁酮。
酚类物质主要是在发酵过程中通过曲霉的降解作用产生[28]。从黄豆渣酱中共检出3种酚类物质，含量为243.98μg/100g，包括4-乙基-2-甲氧基苯酚、苯酚及2-甲氧基酚。其中，4-乙基-2-甲氧基苯酚含量（129.52 μg/100 g）最高。
此外，黄豆渣酱中还检出呋喃类、吡嗪类等其他物质，吡嗪类化合物主要由微生物代谢或美拉德反应生成，四甲基吡嗪能为黄豆渣酱提供烘烤可可和坚果的香气[29]。麦芽酚具有焦糖香气，香气浓郁[30]。
2.5 黄豆渣酱中游离氨基酸分析
有研究表明，豆渣经微生物发酵后，很多性能均能得到很好的改善[31]。米曲霉发酵豆渣过程中能分泌蛋白酶，具有分解蛋白质的性能，使发酵产品中富含氨基酸等多种易被人体吸收的成分[32]。因此，对黄豆渣酱中的游离氨基酸进行检测分析，结果见表5。
表5 黄豆渣酱中游离氨基酸的测定结果
Table 5 Determination results of free amino acids in soybean residue paste
注：“*”表示必需氨基酸。
由表5可知，从黄豆渣酱中共检出18种游离氨基酸，总含量为1.403 g/100 g，其中包含7种必需氨基酸（essential amino acid，EAA），含量为0.593 g/100 g，EAA与总氨基酸（total essential amino acid，TAA）含量的比值为0.423，与非必需氨基酸（nonessential amino acid，NNEAA）含量的比值为0.732。根据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）和联合国粮食及农业组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）在1973年提出的理想蛋白模式中EAA/TAA在0.40左右、EAA/NEAA在0.60以上的蛋白质营养价值较好[33]，说明黄豆渣酱中的游离氨基酸含量丰富，蛋白质达到理想蛋白质的要求。18种游离氨基酸中包含2种鲜味氨基酸，6种甜味氨基酸，8种苦味氨基酸，1种酸味氨基酸及1种无味氨基酸，苦味氨基酸（0.538 g/100 g）＞甜味氨基酸（0.532 g/100 g）＞鲜味氨基酸（0.313 g/100 g）＞无味氨基酸（0.014 g/100 g）＞酸味氨基酸（0.006 g/100 g）。相对于谷类食品，黄豆渣酱中含有丰富的赖氨酸（0.062 g/100 g），是人体难以合成的，且是一般植物所缺少的，因此多吃黄豆渣食品，有助于弥补谷物中赖氨酸的不足；黄豆渣酱中的支链氨基酸（Leu、Ile、Val）含量较高，而芳香族氨基酸（Phe、Tyr）含量较低，恰与动物蛋白的氨基酸组成互补。
2.6 黄豆渣酱抗氧化能力分析
2.6.1 黄豆渣中异黄酮及酚类物质分析
由表6可知，从黄豆渣酱中检测出9种异黄酮类物质，包括大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、鸢尾黄酮苷、大豆苷元、染料木素、鸢尾黄素、鹰嘴豆芽素A及黄豆黄素，其中，染料木素含量最高，为4 655.363 g/100 g，其次为大豆苷元（3 857.448 g/100 g）。从黄豆渣酱中检测出7种酚类物质，包括原儿茶素、没食子酸、表没食子儿茶素、咖啡酸、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯及阿魏酸，其中，咖啡酸含量最高，为39.869 g/100 g，其次为原儿茶素（23.287 g/100 g）。结果表明，黄豆渣酱含有丰富的异黄酮及酚类等活性物质。
表6 黄豆渣酱中异黄酮及酚类物质的检测结果
Table 6 Determination results of isoflavones and polyphenol substances in soybean residue paste
注：“-”表示未检出。
2.6.2 抗氧化能力分析
由图1可知，随着黄豆渣酱质量浓度的升高，ABTS自由基及DPPH自由基的清除率均呈先升高后趋于平缓的趋势。黄豆渣酱清除ABTS自由基的IC50值为36.523 μmol VCE/g，清除DPPH自由基的IC50值为10.824 μmol VCE/g。说明黄豆渣酱具有很好的抗氧化能力，分析原因可能与黄豆渣酱中含有丰富的异黄酮及酚类物质有关[34]。
图1 黄豆渣酱对ABTS（a）及DPPH自由基（b）的清除能力
Fig.1 Scavenging capacity of soybean residue paste against ABTS (a)and DPPH free radical (b)
3 结论
以豆渣为主要原料，采用米曲霉（Aspergillus oryzae）AS3.951制曲后发酵制备黄豆渣酱。黄豆渣酱的感官、理化及微生物指标均符合相关国标要求。采用GC-MS从黄豆渣酱中共检测出60种挥发性风味成分，包括4种醇类、12种酸类、11种酯类、11种醛类、6种酮类、3种酚类和13种其他类物质；采用氨基酸自动分析仪从黄豆渣酱中共检出18种游离氨基酸，总含量为1.403 g/100 g，其中7种EAA含量为0.593 g/100 g；黄豆渣酱中含有丰富的异黄酮、酚类物质，具有较好的抗氧化能力，清除ABTS自由基的IC50值为36.523 μmolVCE/g，清除DPPH自由基的IC50值为10.824μmolVCE/g。该研究为实现豆渣的高值化利用奠定了基础。
[1]LI S H,ZHU D,LI K J,et al.Soybean curd residue:Composition,utilization,and related limiting factors[J].Int Scholar Res Notic,2013,2013:1-8.
[2]FEI L,YANG L,BO L.Okara dietary fiber and hypoglycemic effect of okara foods[J].Bioact Carbohyd Dietary Fibre,2013,2(2):126-132.
[3]HERMANN J R,HONEYMAN M S.Okara:A possible high protein feedstuff for organic pig diets[J].Anim Ind Rep,2004,650:1965.
[4]江连洲，毛惠婷，毕爽，等.超声波辅助提取水酶法黄豆渣中植酸的工艺优化[J].食品工业科技，2016，37（6）：255-259，263.
[5]田瑞红，江连洲，李丹.水酶法提取黄豆渣中水溶性多糖的工艺优化[J].大豆科技，2019（S1）：228-232，238.
[6]姚垚，王明爽，刘芳辰，等.小米黄豆渣低糖纤维饼干工艺条件的优化[J].农产品加工，2020（3）：47-49.
[7]吕思琪，郝晓亮，全艳玲，等.以黄豆渣为原料制备膳食纤维零食的研究[J].农业技术与装备，2020（10）：57-58.
[8]张美玉，郝晓亮，许婉晴，等.以黄豆渣为原料制备膳食纤维饮料的研究[J].农业技术与装备，2020（10）：61-62.
[9]王霏霏，王莎，李丹林.豆渣发酵工艺优化研究及其腐乳产品开发[J].农产品加工，2020（21）：28-31.
[10]段松林，彭荣，殷钟意，等.基于综合酶活力优化的黄豆渣酱油曲制备工艺[J].大豆科学，2018，37（6）：955-960，974.
[11]袁华伟，陶涛，周敏，等.黄豆渣培养杏鲍菇菌丝体培养基配方的优化[J].食用菌，2020，42（6）：29-31，40.
[12]VONG W C,LIU S Q.Biovalorisation of okara(soybean residue)for food and nutrition[J].Trends Food Sci Tech,2016,52:139-147.
[13]YANG L C,FU T J,YANG F C.Biovalorization of soybean residue(okara)via fermentation with Ganoderma lucidum and Lentinus edodes to attain products with high anti-osteoporotic effects[J].J Biosci Bioeng,2020,129(4):514-518.
[14]申春莉，李曼，沙见宇，等.灵芝菌丝体固态发酵黄豆渣的营养成分变化[J].食品与发酵工业，2019，45（12）：114-119.
[15]GUPTA S,LEE J J L,CHEN W N.Analysis of improved nutritional composition of potential functional food (okara) after probiotic solid-state fermentation[J].J Agric Food Chem,2018,66(21):5373-5381.
[16]宋昊，郑玉芝.黄豆豆渣发酵产物中挥发性风味化合物成分分析[J].食品科学，2016，37（10）：176-182.
[17]苟婷婷，彭荣，殷钟意，等.纯黄豆渣酱的酿制工艺研究[J].大豆科学，2020，39（1）：130-137.
[18]赵爽.大豆豆渣替代部分黄豆发酵豆酱的研究[J].食品研究与开发，2019，40（3）：116-118，166.
[19]刘晓庆，殷丽君，鲁绯，等.豆渣酱制曲工艺条件优化[J].食品与发酵工业，2008，34（7）：111-114.
[20]马尚智，秦惠玉，龙飞，等.没食子多酚类化合物的鉴定及其在UPLCMS/MS 中的裂解规律研究[J].中草药，2017，48（22）：4632-4638.
[21]张欢欢，耿予欢，李国基，等.麦胚对高盐稀态酱油理化特性及抗氧化活性的影响[J].食品科学，2019，40（4）：108-115.
[22]LEE S M,SEO B C,KIM Y S.Volatile compounds in fermented and acidhydrolyzed soy sauces[J].J Food Sci,2006,71(3):C146-C156.
[23]王梦泽，王敬文，管世敏，等.微生物转化生产β-苯乙醇的研究进展[C]//第十一届中国香料香精学术研讨会论文集.中国香料香精化妆品工业协会，2016.
[24]高献礼，赵谋明，崔春，等.高盐稀态酱油挥发性风味物质的分离与鉴定[J].华南理工大学学报：自然科学版，2009，37（10）：117-123.
[25]王静，刘宇，马银花，等.菌藻混合发酵对豆渣中B 族维生素含量和风味成分的影响[J].现代食品科技，2018，34（1）：75-82.
[26]赵聪，范文来，徐岩.乙醚萃取法分析郫县豆瓣酱重要香气成分[J].食品科学，2021，42（12）：184-188.
[27]康蕾.黄豆酱品质成因及发酵条件优化的研究[D].长沙：湖南农业大学，2015.
[28]杜小燕，吴晖，赵超敏，等.泡盛曲霉发酵麦麸过程中酚类物质含量的变化与三种酶活性的相关性[J].现代食品科技，2015，31（4）：69-76，209.
[29]陈清婵.米曲霉发酵豆豉挥发性风味成分及其在加工过程中变化研究[D].武汉：华中农业大学，2011.
[30]田甜.东北豆酱自然发酵过程中风味品质与微生物变化规律研究[D].沈阳：沈阳农业大学，2015.
[31]周亚楠，柴贺，初琦，等.纳豆芽孢杆菌发酵豆渣营养成分变化研究[J].食品研究与开发，2016，37（23）：170-174.
[32]董伟亮.米曲霉发酵豆渣制备大豆多肽和多糖[D].哈尔滨：哈尔滨工业大学，2018.
[33]中国疾病预防控制中心营养与食品安全所.中国食物成分表2004[M].北京：北京大学医学出版社，2005：89-93.