氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是一种天然产生于发酵食品（面包、酸奶、酱油等）和饮料酒中的化合物[1-2]，可导致肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等疾病[3]，在2007年被世界卫生组织国际癌症调研机构列为2A类致癌物[4]。食用发酵食品和饮用酒精饮料是目前人体摄取EC的两种主要方式[5]，欧美发达国家为降低其食品安全风险纷纷对各类市场上的酒精饮料制定了含量不得超过150 μg/L的标准[6]。我国由于发酵食品种类众多，检测方法不统一等客观原因导致当下尚未制定出酒类饮用产品中氨基甲酸乙酯的强制性限量标准[7-8]。但随着国内酒行业快速发展和消费者的安全健康意识日益提升，酒中氨基甲酸乙酯所引发的食品安全潜在危害越发受重视，其强制性限量标准的制定势在必行[9-10]，因此，研究其控制方法及制定限量标准将成为白酒风险体系研究工作的重点。
根据研究报道，白酒中的尿素、氨甲酰磷酸、瓜氨酸等前体物质能够与乙醇反应生成氨基甲酸乙酯[11-12]，目前国内外关于解决饮料酒中EC问题的研究主要是从减少其来源、工艺条件控制和后续储存过程中去除等方面考虑，如构建低产尿素酵母[13]、添加酸性脲酶[14]以及采用合成树脂吸附[15]。但EC的形成途径多种多样，不同的存储环境对浓香型基酒中氨基甲酸乙酯的含量也有重要影响[16-18]。随着色谱与质谱的联用技术的逐渐成熟，在机理及减控方面的研究成为了重点[19-21]。
本研究选取浓香型酒库的基酒作为研究对象，探究储存条件对氨基甲酸乙酯含量的影响以及其形成机制的研究，以期对白酒中氨基甲酸乙酯的含量达到有效减控，促进我国白酒中氨基甲酸乙酯限量标准的制定提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
氨基甲酸乙酯标准品（99.50%）：ChemService公司；甲醇、甲酸（色谱纯）：安徽天地高纯溶剂有限公司；实验所用的浓香基酒均由贵州茅台酒厂（集团）习酒有限责任公司提供。所有实验用水均为超纯水（18.2 MΩ·cm-2）。
1.2 仪器与设备
UltiMate 3000 高效液相色谱仪：美国Dionex公司；配备HESI离子源的Q Exactive Focus高分辨质谱仪：美国Thermo Fisher Scientific公司；BPG型精密鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；OEM型电子精密天平：奥豪斯国际贸易（上海）有限公司；QT-1旋涡混合器：上海琪特分析仪器有限公司；Aquaplore 3S型全智能超纯水机：美国艾科浦国际有限公司；SB-25-12DT超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品处理
取样：按酿造加入粮食的种类差异分为单粮浓香基酒和多粮浓香基酒，单粮浓香基酒取自于浓香酒库3号房194#坛、219#坛、165#坛、105#坛；多粮浓香基酒取自于浓香酒库7号房239#坛、197#坛、228#坛。具体分级是由公司专业尝评人员认定入库。
酒样处理：准确吸取1 mL酒样于1.5 mL离心管中，置于80 ℃烘箱中去除酒精，取出冷却后加超纯水定容至1 mL，置于旋涡混合器上混匀，用注射器吸取后注入通过0.22 μm水相微孔滤膜过滤到进样瓶，上机检测。
1.3.2 标准溶液的配制
标准储备液：准确称取一定量EC标准品于100 mL容量瓶中，加水定容后配制成质量浓度100 mg/L的标准储备液，并放置于4 ℃冰箱中储存待用。
标准系列溶液：准确量取1 mL标准储备液于100 mL容量瓶中，加水定容后配制成质量浓度1 000 μg/L的标准中间液，再逐级稀释至10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、250 μg/L、500 μg/L的标准系列溶液，并放置于4 ℃冰箱中储存待用。
1.3.3 实验方法
（1）不同材质储存容器储存的基酒EC的变化规律
选取浓香型基酒单粮甲级194#和多粮甲级239#作为实验样品，分别取500 mL灌装于玻璃瓶、不锈钢瓶和陶制瓷瓶中，置于空调20 ℃的储物间的柜子（避光）存储，每月定期测量，研究不同材质储存容器对基酒中EC含量的影响。
（2）光照对基酒EC的影响
选取浓香型基酒单粮甲级194#和多粮甲级239#作为实验样品，分别取500 mL灌装于玻璃瓶，置于空调20 ℃的储物间台面（见光）和柜子（避光）分别存储，每月定期测量，研究光照条件对基酒中EC含量的影响。
（3）温度对基酒EC的影响
选取浓香型基酒单粮甲级194#和多粮甲级239#作为实验样品，分别取500 mL灌装于陶瓷瓶（排除光照干扰）中，分别置于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃的温度梯度下，储存一段时间后进行检测，以探究温度对基酒中EC含量的影响。
1.3.4 不同温度下酒样的差异比较
通过对存放4 ℃、20 ℃和60 ℃条件下的浓香型基酒单粮甲级194#和多粮甲级239#样的全扫描，用仪器配带的Compound Discover软件对其进行统计分析及差异性比较，初步寻找形成EC的前体物质以及演变机制。
1.3.5 基酒存储的风险评估
选取酒库中的5个陶坛储存的浓香基酒（多粮甲级197#、多粮乙级228#、单粮甲级219#、单粮乙级165#、单粮丙级105#）在平均室温为22.6 ℃，平均湿度45%，避光储存条件下，每月定期跟踪EC含量，以期完成EC的风险评估。
1.3.6 液相色谱质谱联用检测方法
（1）色谱条件
流动相：A相为0.1%（V/V）甲酸水溶液，B相为甲醇；色谱柱：Accucore aQ 液相色谱柱（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）；柱温：35 ℃；进样盘温度：4 ℃；进样体积：10 μL；洗脱方式：梯度洗脱，具体程序见表1。
表1 梯度洗脱程序
Table 1 Gradient elution procedure
（2）质谱条件
离子源：可加热大气压电喷雾电离源，正离子扫描模式；扫描类型：选择离子监测（selected ion monitoring，SIM）模式；扫描范围：55～95 m/z；分辨率：70 000；自动增益控制目标离子数：1×e6；最大注入时间：5 ms；鞘气流速：30 arb；辅助气流速：15 arb；喷雾电压：2.3 kV；离子传输管温度：350 ℃；S-lens RF level：80；辅助气加热温度：200 ℃。
1.3.7 数据处理
使用Origin9.0软件进行绘图，使用仪器配带的Compound Discover分析软件进行酒样的差异性分析。
2 结果与分析
2.1 不同材质储存容器对基酒EC的影响
以浓香型基酒作为实验样品，选用玻璃瓶、不锈钢瓶和陶制瓷瓶作为储存容器于20 ℃的条件下存储，研究不同材质储存容器对基酒中EC含量的影响，结果如图1。三种容器存储的基酒中EC的含量均随着储存时间的增加而增加，且在90～120 d增加速度最快；不同的储存容器，基酒中EC含量的增长速度也有所不同。其中，陶瓷瓶的增长速度较为缓慢，180 d时基酒194#的EC含量增加到74.59 μg/L，约为初始的2.4倍，低于不锈钢瓶储存的93.07 μg/L和玻璃瓶储存的113.68 μg/L；基酒239#中EC含量的变化趋势与基酒194#一致，表明不同材质的储存容器能够影响基酒中EC含量的变化[4，22]，并且陶瓷瓶更适合储存白酒，故建议白酒生产企业采用陶制容器储酒。
图1 储存材质对基酒中氨基甲酸乙酯含量的影响
Fig.1 Effect of storage materials on ethyl carbamate contents in base liquor
（a）单粮甲级194#；（b）多粮甲级239#。
2.2 光照对基酒EC的影响
选取浓香型基酒作为实验样品于玻璃瓶中分别置于避光和见光条件下储存。储存温度为20 ℃的条件下，研究光照对基酒中EC含量的影响，结果见图2。
图2 光照对基酒中氨基甲酸乙酯含量的影响
Fig.2 Effect of light on ethyl carbamate contents in base liquor
（a）单粮甲级194#；（b）多粮甲级239#。
结果表明，在两种环境下，前30天基酒中EC含量增长速度较缓慢，30 d后基酒中EC含量急剧增加，120 d后出现平缓趋势。但在见光条件下EC含量增加速度远大于避光条件下，与文献报道一致[23]。因此，建议白酒生产企业存酒环境尽量避光。
2.3 温度对基酒EC的影响
以浓香型单粮甲级194#和多粮甲级239#两种基酒作为实验样品，分别设置5个温度梯度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃），储存一个月后进行检测，以探究温度对基酒中EC含量的影响，结果见图3。无论是单粮基酒还是多粮基酒，在温度低于20 ℃时，酒中的EC含量增加较为缓慢；超过25 ℃后，两种基酒的EC含量急剧增加，并且在30 ℃时超过了150 μg/L的食品安全风险限，而且随着温度越高，EC生成量越多，这与研究报道的当储存温度超过24 ℃时酒中EC的含量将迅速增加的论述基本吻合[4，24]。此外，通过比较两个酒样在15 ℃和35 ℃时的EC含量，可以发现存在有约7～9倍的差距，表明不同原料酿制的基酒在高温条件下储酒都存在EC含量增加的食品安全风险。因此，企业应选择在15～20 ℃范围内存储，有条件的酒厂可以考虑洞藏或者进行窖藏。
图3 温度对基酒中氨基甲酸乙酯含量的影响
Fig.3 Effect of temperature on ethyl carbamate contents in base liquor
2.4 不同温度下酒样的差异比较
由2.3所知，在一定温度范围内，基酒中EC的形成与其成正相关关系，为进一步证实温度是导致EC大量形成的重要因素，并初步筛选EC在酒中的前体物质，设置4 ℃、20 ℃和60 ℃三个温度条件储存，定期检测分析EC含量变化情况，结果见图4。
如图4所示，在4 ℃储存条件下基酒中的EC含量无明显变化；20 ℃储存条件下基酒中EC含量增加速度较缓慢，存放到180 d时EC的含量为原来的2～2.5倍；值得注意的是，在60 ℃储存条件下，基酒中EC的含量在前30天就能增加到较高数值，后期温度也是一直在升高。这反映了一定温度条件下短期内能够使EC前体物质完成转化。
图4 不同时间及温度对基酒中氨基甲酸乙酯含量的影响
Fig.4 Effect of different time and temperature on ethyl carbamate contents in base liquor
（a）单粮甲级194#；（b）多粮甲级239#。
此外，对所设温度条件下储存的基酒进行检测分析，将数据导入Compound Discover软件，进行差异性分析。如图5所示，每个小方格代表一种物质，每一列表示每个样品所有物质的表达量情况，颜色深浅表示物质表达量的大小，绿色表示含量低，红色表示含量高，颜色越深表示含量越低或者越高；上方树形图表示不同实验分组的聚类分析结果，左侧树状图表示不同物质聚类分析结果。从图中聚类分组来看，两个酒样的上方树形图基本一样，说明实验分组一致。左侧物质聚类分组差异较大，在颜色上也有所区别，说明不仅三个温度下物质表达存在差异，而且两个酒样之间的对比也存在一定差异。
图5 基酒的热图分析
Fig.5 Heatmap analysis of base liquor
（a）单粮194#；（b）多粮239#。
为了解全扫描物质变化差异，选取基酒在高温（60 ℃）和低温（4 ℃）两种条件下检测数据绘制火山图（图6），比较它们之间的差异分布情况。每个点代表一个检测到的差异物质，灰色表示该物质在4 ℃和60 ℃下无差异，绿色表示物质含量发生了下调，红色表示物质含量上调，圆点偏离中心越远表示差异倍数越大，越靠近顶部的点表示两个样本的物质含量变化差异越显著。通过统计分析，全扫描后的多粮基酒239#的物质种类为5 273种，多于单粮的194#的3 342种，这可能是造成单粮酒口感单薄寡淡而多粮酒醇厚丰满的原因。此外，在P≤0.05，差异倍数为2时，60 ℃与4 ℃相比，单粮甲级194#基酒有854种物质展现出无差异，338种物质下调，2 150种物质上调；多粮甲级239#基酒中有754种物质无差异，763种物质下调，3 756种物质上调。此外，P值保持不变，调整差异倍数为5时，194#基酒种有98种物质下调，239#基酒中有113种物质下调，通过逐一筛查，两种酒样中共同有三种与氨基甲酸乙酯结果相似的物质存在极大的下调显著性差异，分别是糠醛、尿素和二环氧基乙酯。因此，可推测在上调的物质中有一种是氨基甲酸乙酯在发生显著变化，而且在下调的物质中存在一种或者多种氨基甲酸乙酯的前体物质，这思路对氨基甲酸乙酯的前体物质筛查及形成机制的演化提供了参考。
图6 基酒火山分析图
Fig.6 Volcano plots analysis results of base liquor
（a）单粮甲级194#；（b）多粮甲级239#。
2.5 基酒存储风险评估
酒库被视为白酒企业的“液体银行”，是基酒老熟的存储基地，其环境条件直接影响酒质好坏及酒体特征的变化[25]。经研究，储存容器、光照条件和温度是影响储存过程中EC含量的重要因素，陶制容器储酒于低温避光条件下储存有利于EC含量的减控。由于储酒库房环境（陶坛储酒、避光和室温）基本与实验优化条件有相似之处，所以选择了酒库的5个浓香基酒（多粮2个级别，单粮3个级别）进行EC含量跟踪，探究其储存变化规律，以期完成EC的风险评估。浓香型酒库为陶坛作为储存容器，平均室温为22.6 ℃，平均湿度45%，避光储存。其跟踪酒中EC含量随储存时间的变化情况如图7所示。
图7 基酒中氨基甲酸乙酯含量随储存时间的变化情况
Fig.7 Change of ethyl carbamate contents in base liquor with storage time
结果表明，5个酒样在前90 d内EC含量变化缓慢，在90～150 d内酒样EC含量迅速增长，随后出现平缓趋势。尽管各基酒中EC随储存时间的增加，但均未超过加拿大、美国等国家认定的限量标准（150 μg/L），因此，酒库储酒EC的风险较低。
3 结论
文章探讨了储酒容器、光照和温度对不同原料制备的浓香型基酒中EC含量的影响并且简单分析了低含量EC基酒和高含量EC基酒差异性情况。在研究中发现使用陶瓷瓶的使用、避光和低温都有利于酒中EC含量的减控；对比三种影响因素，温度是短期内影响酒中EC含量变化最大的主要原因，同时高温下储酒具有较高的食品安全风险；不同温度下对基酒初步对比分析为准确筛选EC前体物质提供研究思路；在平均室温为20 ℃左右，平均湿度45%左右，用酒库用陶坛储酒能够实现低成本的储酒要求且储存风险较低。本研究对白酒中EC在不同条件下含量的变化情况的探究，为EC的生成机理及找出前体物质提供了参考依据，为白酒中EC的控制和消除提供了研究方向。
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