广东省拥有全球最优质的荔枝资源，利用这些原料酿造出的荔枝酒芳香独特，同时具有营养保健功能，是一种深受消费者喜爱的果酒[1-2]。酒精度是荔枝酒发酵过程及成品酒质量控制的关键因素。目前，国标规定的酒精计（或密度瓶）法以及气相色谱法被广泛应用于包含荔枝酒在内的发酵酒酒精度检测，但这些方法中样品均需蒸馏，操作繁琐，酒精易损失，检测速度慢，而且检测结果易有人为误差，无法满足发酵酒品质监控中快速检测需求[3-4]。近十几年以来，光谱分析技术以其快速无损、精确简便等优点，已逐渐应用于酒精度快速检测。其中拉曼光谱由于乙醇特征信号易受其他物质荧光干扰而普遍只应用于白酒酒精度测量[5-9]，近红外光谱则可用于葡萄酒、啤酒等发酵酒酒精度测量[10-13]，市场上也有少数国外生产的专用型近红外光谱仪如葡萄酒分析仪（丹麦Foss公司）、酒精分析仪（奥地利Anton Paar公司）和快速酒精分析仪（比利时Unisensor公司）等供选择[14-15]，但由于红外光谱容易受水吸收峰干扰，对水溶液测定结果有一定影响[16]，且这些仪器价格昂贵，从而无法普及。
为解决目前发酵过程及成品酒酒精度测量过程中存在的实际问题，本实验拟采用美国Ocean Optics公司即插即用微型光纤光谱仪，利用拉曼光谱对荔枝酒发酵过程及成品酒酒精度进行快速测定。通过不同方法对光谱进行预处理，重点解决发酵酒中成分复杂，荧光严重干扰拉曼信号的问题[17-19]，同时采用向量角偏最小二乘法（vector angle partial least square，VAPLS）解决偏最小二乘法（partial least square，PLS）中乘性误差对预测结果的干扰[20-22]，从而提高酒精度预测模型的稳定性和预测能力。该方法的建立可实现高效、准确、快速测定荔枝酒发酵过程及成品酒酒精度，并可通用于所有类型发酵酒，同时为后续开发价格低廉的便携式酒精快速检测仪以及实现发酵过程酒精度在线监测奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
荔枝（淮枝品种）：广东省从化市；活性干酵母（QA23、D47）：上海杰兔工贸有限公司；乙醇、亚硫酸（均为分析纯）：天津市大茂化学厂。
测试样品共64个，其中采用体积分数为99.0%乙醇配制不同酒精度酒样30个（编号1～30）（见表1），荔枝酒发酵过程F1不同时段取样18个（编号31～48），荔枝酒发酵过程F2不同时段取样16个（编号49～64），所有样品酒精度范围为：1.0%vol～20.0%vol。选取配制酒精溶液样品20个（酒精度为整数）用作建模校正集样品，剩余配制酒精溶液样品以及其他样品共计44个作为验证集。
表1 配制酒精溶液的酒精度
Table 1 Alcohol content of prepared alcoholic solutions
1.2 仪器与设备
QE65Pro拉曼光谱仪：美国Ocean optics公司；BQR-785-OEM光纤探头、BQ-Laser-532激光器：广州标旗光电科技股份发展有限公司；全玻璃蒸馏器（500 mL，1000 mL）：广州精科化玻仪器公司；精密酒精计（分度值0.1%vol）：河北衡水武强县兴隆仪表配件厂。
1.3 方法
1.3.1 荔枝酒加工工艺流程、操作要点
操作要点：荔枝去皮去核，果肉中加亚硫酸至总二氧化硫120 mg/kg以及1‰柠檬酸后榨汁，4 ℃澄清24 h后调糖酸（总含糖量23%，pH 3.8），加入亚硫酸调整至总SO2质量浓度为150 mg/L，以0.5%接种量接种已活化的活性干酵母，控制温度15 ℃静置发酵至酵母自然沉降，停止产气。荔枝酒发酵过程F1（菌种为酵母D47）和F2（菌种为QA23）分别为18 d及16 d，发酵过程中每天定时取样测定酒精度，当酒精度趋于稳定，终止发酵。经过陈酿得到荔枝酒。
1.3.2 酒精计法测定样品酒精度
参照食品安全国家标准GB 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》测定各样品酒精度，酒精度表示为体积百分比（%vol）。
1.3.3 拉曼光谱数据采集
开机预热光谱仪2 h；以空气为参比，选用光程为10 mm的石英比色皿，利用QSpecSuiteV1.0光谱软件采集样品光谱。其激发光源波长为532 nm（激光器功率500 mW），光谱测定范围为0～4 000 nm，分辨率10 cm-1，扫描步长4 cm-1，积分时间2 s，平滑参数1。每个样品采集3条光谱曲线，将其平均值作为该样品的原始光谱曲线。
1.3.4 样品酒精度光谱测量分析模型建立
以相同校正集分别采用常规偏最小二乘法PLS及向量角偏最小二乘法VAPLS建模。
（1）VAPLS法建模主成分数与分割步长的确定
设置校正集的光谱数据矩阵为A，校正集的酒精浓度为C；基准光谱m（酒精度为20%vol样本光谱）。将A、C、m导入计算平台。首先根据二阶差分值序列的折点初步判断A的主成分数p[23]，调用VAPLS算法程序，将A、m均被分为n段，即A=[A1，A2，……An]，m=[m1，m2，……mn]，计算得到不同的主成分数pi和分割步长ki（i=1，2，……p）下的实测值与预测值相关系数R2（correlation coefficient）和均方根误差（root mean square error，RMSE）[24]。
（2）VAPLS法模型建立
取相关系数R2最大和RMSE最小时的p与k，根据cos φ=（m·A）/|m||A|，求得A与m的夹角余弦矩阵，将光谱信号转化为角度信号，即cos φ=［cos φ1，cos φ2，……cos φn］。将cos φ与C进行拟合，得到酒精浓度的预测模型。
（3）模型验证
在确定的主成分数与分割步长下，调用VAPLS算法程序，得到验证集的预测值，评价模型的预测效果，并与PLS建模结果比较。
2 结果与分析
2.1 样本的拉曼光谱分析
乙醇配制不同酒精度酒样和荔枝酒发酵过程不同时段取样的拉曼光谱图分别见图1和2。由图1和图2可知，波数为880 cm-1及1 000～1 100 cm-1附近的特征峰分别由C-C-O面内和面外伸缩产生；波数1 300 cm-1附近的特征峰由C-O-H弯曲振动产生；波数为1 450 cm-1附近的拉曼峰由CH3不对称变形产生，而波数为2 800～3 040 cm-1拉曼峰是由—CH2，—CH3基团的对称/不对称伸缩振动产生的[25]，波数为3 050～3 800 cm-1拉曼峰则是OH伸缩振动峰。其中以波数为2 800～3 040 cm-1范围内的CH伸缩振动特征峰最为显著，因为纯水中不存在—CH基团，所以纯水的拉曼光谱在这一范围内没有特征峰，波数为2 800～3 040 cm-1范围的拉曼峰主要是乙醇的—CH伸缩振动峰，乙醇浓度越高，振动峰值越高。
图1 乙醇配制不同酒精度酒样拉曼光谱图
Fig.1 Raman spectra of samples with different alcohol contents prepared by ethanol
图2 荔枝酒发酵过程不同时段样品拉曼光谱图
Fig.2 Raman spectra of litchi wine samples at different fermentation stage
采用光谱软件QSpecSuiteV1.0对各样本原始光谱进行2阶导数法预处理，结果分别见图3和图4。由图3和图4可知，各样本光谱分辨率增强，荧光干扰影响减小。
图3 乙醇配制不同酒精度酒样二阶导光谱图
Fig.3 Second derivative spectra of samples with different alcohol contents prepared by ethanol
图4 荔枝酒发酵过程不同时段样品二阶导光谱图
Fig.4 Second derivative spectra of litchi wine samples at different fermentation stage
2.2 酒精度分析模型建立
选取配制酒精溶液样品20个（浓度为整数）用作建模校正集样品，酒精度范围为1%vol～20%vol，剩余配制酒精溶液样品作为验证集，酒精度范围为5.5%vol～14.5%vol，该范围为实际发酵过程中主要的酒精度范围。
以样本的光谱数据矩阵作为自变量（x），而样本的酒精度实际值作为因变量（y），对校正集各样本原始光谱2阶导数法预处理后，分别采用VAPLS及PLS法建立模型，两种方法的建模结果比较见图5。由图5可知，PLS法建立模型的相关系数R2为0.994 3，RMSE为0.447 9，VAPLS法建立模型的相关系数R2为0.998 0，RMSE为0.265 9。
图5 VAPLS及PLS法建模结果比较
Fig.5 Comparison of modeling results with VAPLS and PLS method
对验证集样本（浓度为非整数配制酒精）拉曼光谱数据进行2阶导数处理后，分别采用VAPLS和PLS法所建立模型对其进行预测，结果分别见表2和表3。
由表2和表3可知，将原始光谱进行2阶导校正处理，并对光谱数据进行夹角化后，选择主成分数为4，分割步长为10时建立的模型效果更佳，VAPLS预测值与真实值的绝对误差为-0.487～0.236，相对误差为-5%～1.6%，其相关系数R2为0.9931，RMSE为0.285 6，优于PLS建模方法，说明VAPLS法建立的预测模型其预测能力以及稳定性相对较好。
表2 VAPLS及PLS模型对验证集酒精度预测结果
Table 2 Prediction results of validated collection of alcohol content with VAPLS and PLS models
表3 VAPLS及PLS模型对验证集酒精度预测结果分析
Table 3 Analysis of prediction results of validated collection of alcohol content with VAPLS and PLS models
2.3 荔枝酒发酵过程酒精度变化预测结果
在荔枝酒发酵过程中每天取一次发酵液分别采用酒精计法及拉曼光谱法测量酒精度，共监测两批次。用建立的VAPLS模型，预测得到样本的酒精度见图6。由图6可知，曲线充分体现了荔枝酒发酵过程中乙醇浓度与时间变化的关系，由于是低温发酵，酒精度随着发酵时间的延长缓慢上升，发酵15 d以后酒精度逐渐趋于平稳甚至有所下降。
图6 VAPLS模型对荔枝酒发酵过程F1（A）和F2（B）酒精度变化的预测结果
Fig.6 Prediction results of alcohol content change of litchi wine during fermentation process of F1 (A) and F2 (B) by VAPLS model
拉曼光谱测量与酒精计法测量的对比结果见表4（荔枝酒发酵过程F1酒精度真实值与VAPLS模型预测值对比）和表5（荔枝酒发酵过程F2酒精度真实值与VAPLS模型预测值对比）。由表4及表5可知，建立的拉曼光谱测量方法与酒精计法测量的酒精度差异不大，可以用于快速测定荔枝酒发酵过程中发酵液的酒精度。
表4 VAPLS法对荔枝酒F1发酵过程酒精度预测结果与真实值对比
Table 4 Comparison of the prediction results of alcohol content in litchi wine F1 fermentation process by VAPLS method with the real value
表5 VAPLS法对荔枝酒F2发酵过程酒精度预测结果及真实值对比
Table 5 Comparison of the prediction results of alcohol content in litchi wine F2 fermentation process by VAPLS method with the real value
进一步对发酵过程F1及F2的酒精度预测值与真实值进行回归分析，结果见表6。由表6可知，各时间段预测值均与真实值非常接近，相关系数达到0.99以上，说明模型具有较好的预测能力及稳定性。
表6 VAPLS法对荔枝酒发酵过程酒精度预测值与真实值相关性分析
Table 6 Correlation analysis of predicted alcohol content and true alcohol content in litchi wine fermentation process by VAPLS method
3 结论
本研究采用拉曼光谱建立荔枝酒发酵过程中酒精浓度的定量分析模型，校正集相关系数R2为0.998 0，RMSE为0.261 7，说明模型建立的方法较好；进一步对模型进行验证和评价，验证集中10个配制酒精溶液预测值与实际浓度的相关系数R2为0.993 1，RMSE为0.285 6，预测值与真实值的绝对误差为-0.487～0.236，相对误差为-5.0%～1.6%，具有较好的预测能力及稳定性。采用VAPLS法对第一批发酵酒样品18个拉曼光谱预测值与与气相色谱法实测值的相关系数R2为0.996 4，RMSE为0.246 0，第二批发酵酒样品16个拉曼光谱预测值与气相色谱法实测值的相关系数R2为0.996 1，RMSE为0.336 5，说明模型的预测效果很好，能满足生产中荔枝酒酒精度的快速检测精度要求。因此，拉曼光谱利用2阶导数法进行预处理后，VAPLS构建荔枝酒酒精度预测模型在应用上是可行可靠的，具有良好的稳定性。该方法不仅具有分析速度快、准确度高等优点，还实现了无损、绿色的乙醇浓度定性、定量检测，为荔枝酒发酵过程中酒精度在线监测及成品酒酒精度快速检测奠定了良好的基础，在发酵酒的实际生产过程质量监测具有良好的应用前景。
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