白酒是中国传统的蒸馏酒，经固态发酵、固态蒸馏、贮藏和勾兑等步骤制得[1]，是中国独有的特色产品。其按照主体香气成分可分为浓香型、酱香型和清香型等12种[2]。白酒由酒精、水和微量成分组成，其中微量成分是主要功能性成分，来源于发酵过程中微生物和酶的催化反应、贮存过程中的化学变化以及生产原料特殊的化学反应[3-5]。多项研究均显示适量饮酒确是有益于健康[6-10]。白酒中的川穹嗪[11]、芳香族化合物[12]、4-萜烯醇[13]等微量成分对人体均具有一定有益作用。选择性改变非酒精成分可减少酒精对人类的有害影响。但目前缺乏对不同香型白酒的整体性研究比较，且非酒精成分在体内的作用途径及对机体的影响的研究也很少。
白酒经口入胃后，在胃肠道通过生物膜进入血液循环，迅速地在各组织器官进行代谢。经胃肠道吸收的酒精约90%在肝脏代谢，因此对肝脏的影响最为明显[14]。血液中谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）水平的升高在临床上通常作为酒精性肝损伤的标志[15]。但对于饮酒后机体的早期细微变化，仅通过ALT、AST等血清学指标较难反映。转录组是细胞或组织中基因在特定状态下转录出的所有核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）的总和，能反映出不同生理状态下机体基因的表达情况[16]。在转录组研究中基因芯片是应用最广泛的技术，可同时快速测定成千上万个基因活动[17]。因此本研究采用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术检测不同香型白酒中的非酒精成分，并以此为基础，从血清学、转录组学两方面，探索摄入适量[18]不同香型白酒后，SD大鼠肝肾功能和基因表达变化，初步探讨适量饮用不同香型白酒对健康的潜在影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级健康成年雄性SD大鼠60只（体质量215～235 g）：由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，饲养于四川大学华西公共卫生学院屏障级动物房。饲养环境温度21～25 ℃，相对湿度50%～60%。实验协议（No.K2016042）获得四川大学动物实验伦理委员会批准（成都）。
4种白酒样品：（酒样1、酒样2：不同品牌52°浓香型白酒；酒样3：53°酱香型白酒；酒样4：53°清香型白酒）：市售；酒精对照：蒸馏水配制成体积分数53.0%的乙醇溶液。
无水乙醇：上海安谱实验科技服份有限公司；2-甲基丁酸、2-甲基吡嗪：美国Chem Service公司；2-乙基-3甲基吡嗪、四-甲基吡嗪：美国Chromadex公司；RNeasy Mini Kit试剂盒：Qiagen公司；Trizol@Reagent：美国Invitrogen公司；DB-WAX毛细管柱（30.0 m×0.25 mm，0.25 μm），Quick Amp Labeling Kit One-Color 试剂盒：美国Agilent公司；10×Tris硼酸缓冲液：成都擎科梓熙生物技术有限公司；DNase/RNase-Free去离子水：天根生化科技（北京）有限公司。
1.2 仪器与设备
7890A-5975C气相色谱质谱联用仪、P/N G2545A微列阵杂交炉、P/N G2565BA芯片扫描仪：美国Agilent公司；AU-400全自动生化分析仪：日本Olympus公司；PICO 21高速离心机、ST 16R高速冷冻离心机、NanoDrop ND-1000超微量分光光度计：美国Thermo Scientific公司；PowerPace Basic电泳仪：美国BIO-RAD公司。
1.3 方法
1.3.1 GC-MS测定不同香型白酒中主要非酒精成分
（1）有机非酒精成分测定
酒样经0.22 μm滤膜过滤，以2-甲基丁酸（5 mg/mL）为内标，上样量1 μL。色谱条件：DB-WAX毛细管柱；载气为氦气（He）；流速1 mL/min；程序升温。质谱条件：离子源温度230 ℃；电子能量70 eV；四极杆温度150 ℃；溶剂延迟7 min；全扫描模式质量扫描范围30～500 amu，内标定量。
（2）主要吡嗪类化合物测定
样品稀释定容后直接测定或用二氯甲烷萃取浓缩后测定，以喹啉（25 μg/mL）为内标。上样量1 μL。
色谱条件：DB-WAX毛细管柱；分流比10∶1；载气为氦气（He）；流速1.0 mL/min；程序升温。质谱条件：离子源温度230 ℃；电子能量70 eV；四级杆温度150 ℃；溶剂延迟时间2min；全扫描模式质量扫描范围50～200 amu，内标定量。
1.3.2 实验动物分组及处理
60只SD大鼠适应性饲养后随机分为6组：空白对照组（Water组），酒精对照组（EtOH组），浓香型白酒1组（Strong1组），浓香型白酒2组（Strong2组），酱香型白酒组（Sauce组），清香型白酒组（Light组）；每组各10只。实验组以约0.64 mL/100 g体质量剂量[19]灌胃不同酒样，酒精对照组及空白对照组分别灌胃等量的体积分数53%的乙醇溶液和蒸馏水。每天灌胃一次连续灌胃5周。实验期间动物自由饮水及摄食，每周称质量一次。
灌胃结束后大鼠禁食16 h，称质量。腹腔注射2%的戊巴比妥钠麻醉，取动脉血，静置后分离血清，小管分装并冻存于-20 ℃冰箱。随后颈椎脱位法处死，收集所需脏器，称湿质量，计算脏器系数。脏器系数计算公式如下：
1.3.3 血清学指标检测
使用自动生化分析仪测定血清中的ALT、AST、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，Cr）等血清学指标。
1.3.4 微阵列检测
Trizol法提取肝组织总RNA，经逆转录、标记、纯化、杂交、孵育后，采用安捷伦DNA微阵列扫描仪清洗、固定、扫描杂交序列。
使用Agilent Microarray Scanner 11.0.1.1软件进行微阵列图谱扫描，Agilent Feature Extraction软件进行图谱分析。使用Agilent Gene Spring GX 11.5软件进行分位数标准化和后续数据处理。
Log2（Foldchange）
≥1且P＜0.05的基因认为是显著性差异表达基因。采用GO功能富集分析和KEGG通路富集分析对所得差异基因进行富集分析。
1.3.5 统计分析
数据处理及统计分析采用SPSS 19.0软件，连续变量以均值±标准差（
）表示，组间比较采用单因素方差分析或非参数检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 不同香型白酒的非酒精成分分析
白酒非酒精成分中的吡嗪类化合物有着特殊的作用。其不光能作为香味成分，还具有抗氧化[20]、抗炎[21]的功效，还有研究发现其可抑制幽门螺旋杆菌相关毒力基因的转录和表达[22]。四甲基吡嗪又名川芎嗪，具有扩张血管、改善微循环及抑制血小板积聚的作用[23]，还有保肝、护肝、防止肝纤维化等功效[24]。吡嗪化合物虽有一定健康功效，但中长期大量使用可导致血清球蛋白减少，血清肌酐和血糖增加[25]。因此，对饮用白酒的健康效果仍需谨慎评价。吡嗪类化合物标准溶液色谱图见图1。
图1 吡嗪类化合物标准溶液GC-MS分析总离子流色谱图
Fig.1 Total ion chromatogram of pyrazine standard solution analysis by GC-MS
峰1为2-甲基吡嗪（2-Methylpyrazine），峰2为2-乙基-3-甲基吡嗪（2-ethyl-3-methylpyrazine），峰3为2,3,5,6-四甲基吡嗪（2,3,5,6-Tetramethylpyrazine），峰4为喹啉（内标）。
由图1可见，全扫描模式下3种吡嗪类化合物和内标的色谱峰形及分离效果均较好。在该条件下对不同香型白酒中吡嗪类化合物含量进行检测，结果见图2。
由图2可知，不同香型白酒中3种主要吡嗪类化合物含量存在较大差异：浓香型白酒1组中的吡嗪类化合物以2-乙基-3-甲基吡嗪为主，所测得的含量为0.17 μg/mL，其他三组白酒中均以2,3,5,6-四甲基吡嗪为主要吡嗪类化合物，且酱香型白酒中的四甲基吡嗪含量高达17.03 μg/mL，远高于其他测试酒样。除醇类物质以外，浓香型白酒1组中含有较高含量的己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯等酯类和糠醛；除酯类物质外，浓香型白酒2另含有较高的糠醛、丙酮等醛酮类组分。酱香型白酒中含有较高的乳酸乙酯、乙酸乙酯、戊酸乙酯等酯类以及丙酮、乙醛等醛酮物质；清香型白酒中除酯类物质外，还含有较高含量的糠醛。
图2 不同香型白酒中的主要吡嗪类化合物检测结果
Fig.2 Detection results of main pyrazine compounds in different flavor Baijiu
2.2 不同香型白酒对SD大鼠基线体征及肝肾功能影响
实验结束时，除浓香型白酒2组有3只大鼠死亡外，其余各组大鼠身体及精神状态均良好。处理组大鼠体质量、脏器系数及肝、肾功能指标变化见表1。由表1可知，处理组大鼠体质量、脏器系数均较空白组无统计学差异，且实验组大鼠血清AST、Cr、BUN水平无显著改变，而浓香型白酒2组的血清ALT水平较酒精对照组显著升高（P＜0.05）。说明短期适量饮用白酒对SD大鼠肝肾功能影响有限，与浓香型白酒2组相比，其他白酒中的某些非酒精成分可能对酒精所致的肝功障碍有一定保护作用。
表1 不同香型白酒中非酒精成分对大鼠脏器指数及肝肾功能的影响
Table 1 Effect of non-alcoholic ingredients on viscera index and liver and kidney functions in different flavor Baijiu
注：“a”表示与酒精对照组比较差异显著（P＜0.05）。
2.3 不同香型白酒对大鼠肝脏基因表达谱及相关通路影响
2.3.1 mRNA差异表达情况
两组间mRNAs的显著差异表达情况见图3。由图3可知，与空白组相比，浓香型白1组有369条差异基因表达显著上调，216条差异基因显著性表达下调；浓香型白酒2组有1 014条差异基因表达显著上调，428条差异基因显著性表达下调；酱香型白酒组有927条差异基因表达显著上调，510条差异基因显著性表达下调；清香型白酒组有1 048条差异基因表达显著上调，558条差异基因显著性表达下调；酒精对照组有803条基因表达上调，408条基因表达下调。除浓香型白酒1组外，其余香型白酒引起的上调或下调的基因数均高于酒精对照。
图3 差异表达基因的火山图
Fig.3 Volcano plot of differentially expressed genes
绿色竖线表示mRNA表达的2倍上调或下调，绿色横线表示P值为0.05。红点表示mRNA的差异性表达有统计学意义。
2.3.2 GO和KEGG富集分析
GO功能富集分析能从生物学过程（biological process，BP）、细胞学组分（cellular components，CC）和分子生物学功能（molecular function，MF）三个方面对基因功能进行描述，部分结果见图4。
由图4可知，浓香型白酒1组中，在BP分类中，化学应激、生物调节、刺激反应相关功能基因差异性表达上调，免疫系统过程、长链脂肪酸代谢过程、苦味感受相关功能基因差异性下调；在CC分类中，膜组成成分、固有成分相关功能基因差异性上调而与自噬体膜相关功能基因差异性表达下调；在MF分类中，差异基因上调主要富集在嗅觉感受器活动、信号受体活性相关功能上，下调基因富集在嘌呤核糖核苷三磷酸结合、嘌呤核糖核酸结合等功能上。
图4 GO功能富集分析部分结果
Fig.4 Some results of GO functional enrichment analysis
浓香型白酒2组中，在BP分类中，差异性上调基因主要富集在多细胞生物过程、细胞表面受体信号通路等相关功能，差异下调基因富集在免疫系统相关功能上；在CC分类中，膜的固有成分、膜组成成分相关功能表达基因上调，中间纤维细胞骨架相关功能基因表达下调；在MF分类中，SMAD蛋白结合相关功能基因差异性上调表达，CCR趋化因子受体结合相关功能基因表达下调。
酱香型白酒组中，在BP分类中，差异性上调的基因富集在肝胆管系统发育、后肾发育调节、肝脏发育相关功能上，而免疫系统过程、免疫系统过程的正向调节、对外部刺激应答相关功能基因表达下调；在CC分类中，核质相关功能基因表达上调，细胞外间隙相关功能表达下调；在MF分类中，差异性上调的基因富集在转录因子结合、组蛋白乙酰转移酶结合相关功能上，而差异性下调基因富集在细胞因子活性相关功能上。
清香型白酒组中，在BP分类中，差异上调的基因富集在感官知觉、G蛋白偶联受体信号通路、嗅觉感觉相关功能上，发育过程、胶质细胞生成、细胞化学应激相关功能基因表达下调；在CC分类中，膜组成成分等功能基因表达上调，细胞外基质、胞外区相关功能基因表达下调；在MF分类中，差异上调基因主要富集在跨膜信号受体活性、G蛋白偶联受体活性、嗅觉感受器活性相关功能上，而RNA聚合酶II核心启动子序列特异性DNA结合相关功能基因表达下调。
酒精对照组中，在BP分类中，嗅觉感知、神经系统过程、刺激感应相关功能基因差异性上调，大分子代谢过程的正向调控、第二信使介导的信号转导、胶质细胞生成相关功能基因下调；在CC分类中，膜组成成分相关功能表达基因上调，中间纤维细胞骨架相关功能基因表达下调；在MF分类中，差异性上调基因富集在嗅觉受体活性相关功能上，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性相关功能基因表达有所下调。
利用KEGG 数据库可以分析差异表达基因参与的最主要代谢途径和信号转导途径，分析部分结果见图5。
由图5可知，在浓香型白酒1组中，差异性表达上调的基因主要调控嗅觉传导通路，而差异性表达下调的基因则参与调控移植物抗宿主病、自然杀伤细胞介导的细胞毒作用、不饱和脂肪酸的生物合成等通路。
图5 KEGG通路富集分析部分结果
Fig.5 Some results of KEGG pathway enrichment analysis
在浓香型白酒2组中，参与调控嗅觉传导、大肠癌等通路基因表达上调，而差异性表达下调的基因则主要调控γ-氨基丁酸能突触通路。
在酱香型白酒组中，调控前列腺癌、甲状腺癌等多种癌症通路的基因差异性表达上调，而参与调控疟疾、Toll样受体信号通路的基因表达下调。
在清香型白酒组中，调控嗅觉传导通路的基因表达上调，参与病毒性心肌炎、血管平滑肌收缩等通路基因表达差异性下调。
在酒精对照组中，差异性表达上调的基因主要调控嗅觉传导通路，而表达下调的基因则主要参与调控Toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路。
3 结论
本研究应用GC-MS对不同香型白酒中的非酒精成分进行检测，结果显示不同香型白酒中具有不同的酯类成分，除此之外，浓香型白酒中还含有糠醛、丙酮等特殊成分。另外还对不同香型白酒中吡嗪类化合物含量进行了检测，结果显示酱香型白酒中四甲基吡嗪含量远高于其他测试酒样。基于该结果，在后续的研究中可对白酒中的非酒精成分进行缺失/添加试验，进一步探讨特定非酒精成分的单独或协同健康作用。
对各组SPF大鼠分别进行不同酒样的灌胃处理，连续灌胃5周后处死并对大鼠的基线体征和肝肾指标进行评价，提取大鼠肝脏中的mRNA进行转录组学分析。血清学结果表明，短期内适量摄入不同香型白酒对SD大鼠的肝肾功能影响不大。进一步的转录组学结果显示适量摄入白酒对SD大鼠肝脏基因表达有显著调控，主要影响大鼠的嗅觉感受、应激反应、肝肾系统发育、免疫反应和代谢过程等相关基因。部分酒样还导致大肠癌、甲状腺癌等数个肿瘤相关通路上调。与其他测试酒样相比，浓香型白酒1组具有更优的健康效应，可能与其中某些功能性非酒精成分的独特健康效应有关，但具体机制还有待深入探究。
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