D-阿洛酮糖（D-allulose）是D-果糖在C3位的差向异构体[1]。D-阿洛酮糖是白色的粉末状晶体，无臭并且不易吸潮，易溶于水[2]，其甜度可以代替蔗糖作为Ⅱ型糖尿病人的甜味剂和膳食补充剂[3]。D-阿洛酮糖具有预防保护神经、治疗神经变性的作用[4]。其热量低，可以有效抑制血脂和血糖的升高[5]，具有调节血糖稳定等特殊功能，是近几年来发现的一种具有特殊保健功能[6]胞内产物。
D-阿洛酮糖在自然界中的含量很少，通过人工合成的方法可以大规模生产，合成方法主要有两种：化学法和生物法。D-阿洛酮糖可以利用钼酸离子催化剂催化D-果糖合成D-阿洛酮糖[7]，也可以加热乙醇和三乙胺合成得到D-阿洛酮糖[8]。化学法合成D-阿洛酮糖目前较为困难，尚未取得突破性进展，由此可以借鉴化学法合成稀少糖的方式合成D-阿洛酮糖。ANDREANA P R等[9-10]报道了一种通过关环转换合成稀少糖的方法，该反应相对简单，但只能产生3,4位顺式的稀有糖衍生物，还伴随产生烯烃物。NORTHRUP A B等[11]提出了两步法，通过选择性醇醛缩合合成糖类化合物，但在大规模生产中具有一定的局限性。化学法合成步骤复杂不可控、转化效率低，而市场对于D-阿洛酮糖的需求量和品质的要求越来越高，通过生物法生产D-阿洛酮糖成为该领域的研究热点。日本香川大学Izumori团队首次提出产碱杆菌属细菌能够以半乳糖醇、阿洛糖醇或D-塔格糖作为底物生产D-阿洛酮糖[12]。黄擎宇等[13]则是利用生物反应器的原理大规模生产D-阿洛酮糖。相比于化学法，生物法具有高度的专一性，反应条件和纯化步骤较为简单，也是国内外研究生产D-阿洛酮糖的主要方法。与国外研究现状相比，国内的研究起步较晚，但近年来通过生物法催化合成D-阿洛酮糖的研究也有了较大进展，主要有中粮营养健康研究院、江南大学等团队针对D-阿洛酮糖进行研究，其内容涵盖了产业化技术开发的各关键环节[14]。
通过生物合成法，以D-果糖为底物合成D-阿洛酮糖得到混合糖液，即为转化液，粗样品需要经过分离纯化得到纯度较高的D-阿洛酮糖。阿洛酮糖的分离纯化方法主要有两种，分别是直接分离法和间接分离法。直接分离法，如模拟移动床（simulated moving bed，SMB）[15]和色谱分离技术，其中SMB是一种利用色谱柱的吸附原理将液体进行分离操作的设备。色谱分离技术是利用不同物质在固定相和流动相中分配系数差异来分离混合物，混合糖液分别通过再生好的阳离子交换树脂和阴离子交换树脂脱色脱盐，再通过带有恒温夹套的DTF-Ca2+型色谱分离树脂分离纯化，用分部收集器对样品进行洗脱[16-17]。但由于D-果糖与D-阿洛酮糖的性质极为接近，因此使用色谱分离技术对D-果糖与D-阿洛酮糖进行直接分离难度较高。间接分离法，即利用微生物或酶对D-果糖进行转化消耗，降低D-阿洛酮糖的分离难度。如SONG Y等[18]利用发酵法，对蔬菜的残渣进行水解，经D-阿洛酮糖3-差向异构酶（D-allulose-3-epimerase，DAEase）催化后，利用酿酒酵母厌氧发酵消耗混合糖液中的D-果糖，在分离出D-阿洛酮糖的同时得到乙醇。LI Z J等[19]则使用两步法酶催化反应，利用葡萄糖异构酶和葡萄糖氧化酶将混合糖液中的D-果糖转化为葡萄糖酸，再利用离子交换树脂分离葡萄糖酸，以乙醇为D-阿洛酮糖的结晶体系[19-20]，可以得到纯度较高的D-阿洛酮糖。上述分离方法虽然对D-果糖进行了消耗，但会引入新的物质，对后续的分离纯化造成一定的影响。另外，可以利用酵母的代谢特异性去除发酵产物中的杂糖，具有耗时短，安全性高，价格低廉，操作工艺、设备要求简单的特点，有利于中下游分离纯化，易于工业化[21-22]，如王秀娟等[23-24]分别采用酿酒高活性干酵母发酵法去除木糖母液中的葡萄糖，提高其中木糖及阿拉伯糖的纯度，以便进行后续分离，在最适条件下，葡萄糖浓度降至0.2%以下。曹如燕等[25]采用面包酵母发酵法对蛋清进行脱糖处理，脱糖率可达95%以上。本研究利用含有组成型启动子的质粒pET-20b作为载体，在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中对3种D-阿洛酮糖3-差向异构酶进行异源表达，其后以D-果糖为底物进行静息细胞转化。同时为降低D-果糖对D-阿洛酮糖纯化过程中的影响，在产糖后偶联酿酒酵母好氧发酵，相比于酵母的厌氧发酵产CO2和乙醇，偶联酿酒酵母好氧发酵的产物为CO2和水，不产生额外的物质，针对D-阿洛酮糖的深入研究，为下游D-阿洛酮糖的分离和纯化提供了新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 主要质粒、菌株和引物
Escherichia coli BL21（DE3）：北京全式金生物技术有限公司；pET20b-DPE1、pET20b-DPE2 和pET20b-DPE3 质粒：生工生物工程有限公司。pET20b-DPE1、pET20b-DPE2和pET20b-DPE3的大小分别为4 500 bp、4 509 bp和4 515 bp。以Nde I和BamH I作为基因的载体插入位点，连接后分别转化到大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中。得到E.coli BL21-DPE1、E.coli BL21-DPE2和E.coli BL21-DPE3。其中基因DPE1、DPE2、DPE3的来源分别为土壤农杆菌（Agrobacterium sp.）、类芽孢杆菌（Paenibacillus senegalensis）和斑叶黄酮菌（Flavonifractor plautii）。
表1 本研究所用引物
Table 1 Primers used in the study
注：下划线标识为酶切位点。
1.1.2 化学试剂
限制性内切酶BamH I（10 U/μL）、Nde I（10 U/μL）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；果糖（质量浓度为100 g/L）、氨苄青霉素（质量浓度为100 mg/mL）：北京索莱宝科技有限公司；酵母浸粉、蛋白胨（均为生化试剂）、氯化钠（分析纯）：北京奥博星生物技术有限责任公司；PAGE凝胶快速制备试剂盒、三色预染蛋白Marker（10～250 kDa）：上海雅酶生物科技有限公司；质粒小提试剂盒：天根生化科技（北京）有限公司；超高保真脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶：南京诺唯赞生物科技有限公司。
1.1.3 培养基
种子培养基采用LB液体培养基：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L。121 ℃灭菌20 min。
含氨苄青霉素LB平板：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂粉15 g/L。121 ℃灭菌20 min，晾凉后加入0.1%氨苄青霉素。在无菌环境下分装添加了抗生素的培养基至培养皿内，厚度约为2～3 mm，约为15 mL固体培养基。其中每个培养皿中的成分和含量依次是酵母浸粉0.075 g，蛋白胨0.15 g，NaCl 0.15 g，氨苄青霉素100 μg/mL。
发酵培养基：酵母浸粉20 g/L，蛋白胨20g/L，糊精20 g/L。115 ℃灭菌20 min。
灭菌后的发酵培养基中经无菌操作分别加入经过单独灭活的无机盐A（20%）、B（0.20%）、C（0.20%），其中无机盐为：KH2PO4 3.0 g，Na2HPO4 12.8 g，NaCl 0.5 g，NH4Cl 1.0 g，溶于200 mL的水中；无机盐B：MgSO4·7H2O 2.4 g，溶于10 mL的水中；无机盐C：CaCl2 0.11 g，溶于10 mL的水中。
1.2 仪器与设备
BSA124S电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司DK-8D电热恒温水槽：上海精宏实验设备有限公司；Applied BiosystemsTM VeritiTM 96 孔热循环仪、Applied BiosystemsTM MiniAmpTM热循环仪：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Z326K高速离心机：德国Hemeus公司；D3024 台式高速微量小型离心机：大龙兴创实验仪器（北京）有限公司；DYY-12核酸电泳仪：北京六一生物科技有限公司；JY300C蛋白质电泳仪：北京君意东方电泳设备有限公司；ZQZY-70BS振荡培养箱：上海知楚仪器有限公司；ESSENTIAL V6凝胶成像系统：英国UVItec公司；LC-20A高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：日本岛津公司；Hi-Plex Ca色谱柱（300 mm×7.7 mm，8 μm）：安捷伦科技（中国）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品处理方法
取1 mL待测样品于1.5 mL离心管内，在转速5 000 r/min条件下离心2 min，取上清液稀释10倍，取1 mL于1.5 mL针管内，滤膜过滤置于样品瓶中，进行高效液相色谱分析。
1.3.2 质粒pET20b-DPE1、pET20b-DPE2和pET20b-DPE3的构建
以pET20b-DPE1、pET20b-DPE2和pET20b-DPE3质粒作为模板，设计含有Nde I和BamH I酶切位点的引物DPE1-F和DPE1-R、DPE2-F和DPE2-R、DPE3-F和DPE3-R，分别扩增3种D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因序列，通过Nde I和BamH I连接pET-20b，构建获得3个不同的质粒pET-20b-DPE1、pET-20b-DPE2、pET-20b-DPE3。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min，4 ℃保存。
1.3.3 大肠杆菌的转化及抗性筛选
在冰上融化感受态细胞，取5 μL质粒加到25 μL的感受态中，混匀。冰浴30 min，42 ℃水浴，热激45 s，迅速转至冰浴1 min，过程中避免振动。加入800 μL LB液体培养基，37 ℃培养45 min。分别将E.coli BL21-DPE1、E.coli BL21-DPE2和E.coli BL21-DPE3接种到含100 μg/mL氨苄青霉素的LB冷平板上。将平板倒置，放到37℃恒温培养箱中过夜培养。在含有氨苄青霉素的培养基上长出菌落即为成功转入抗性质粒。
1.3.4 大肠杆菌工程菌的发酵和制备方法
将25 mL种子培养基装于250 mL锥形瓶中，按1%（V/V）接种量从E.coli BL21-DPE1甘油管接种至种子培养基，摇床培养温度为37 ℃，转速200 r/min，连续培养16 h后，得种子液。将种子液按2%的接种量接种至发酵培养基，摇床培养温度为30 ℃，转速200 r/min，培养48 h，得发酵液。
取50 mL带菌发酵液离心，转速12 000 r/min离心5 min，留取菌体，加入50 mL pH 8.0的KOH缓冲液（含200 g/L D-果糖），悬浮菌体。在50 ℃水浴反应10 h，每小时取样1 mL，稀释10倍，进行HPLC检测，测定D-阿洛酮糖含量。
1.3.5 D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性的测定
D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性采用高效液相色谱法。高效液相色谱条件：Hi-Plex Ca色谱柱（300 mm×7.7 mm，8μm）；流动相为超纯水，预先超声排除空气；流速0.6mL/min；柱温箱温度80 ℃；检测器为示差折光检测器；温度40 ℃；进样量10 μL。
样品前处理：100 μL待测样品与900 μL 50 mmol/L浓度的缓冲液（pH 8.0，含100 g/L D-果糖）充分混合后，55 ℃水浴反应10 min，反应结束后转至沸水中灭活5 min。将煮沸后的菌液，12 000 r/min离心10 min，上清液稀释10倍，用13 mm×0.22 μm的水系滤器过滤去除杂质后，转移到样品瓶中，进样10 μL，HPLC分析D-果糖和D-阿洛酮糖的浓度。
定性定量方法：根据D-阿洛酮糖的保留时间定性，采用外标法定量。
D-阿洛酮糖3差向异构酶酶活定义：在55 ℃，pH 8.0的条件下，每分钟生成1 μmol D-阿洛酮糖即为一个酶活单位（IU/mL）。
酶活计算公式如下：
式中：m为HPLC进样10 μL样品中D-阿洛酮糖的含量，mg；进样量为100 μL；稀释倍数为10；μL换算mL乘以1 000；D-阿洛酮糖的分子质量为180.16；反应时间为10 min。
D-果糖转化率计算公式如下：
1.3.6 转化液偶联酵母好氧发酵
干酵母活化方法：2%果糖与纯水混合液，加5%干酵母，38 ℃水浴15 min，再于30 ℃摇床中，以100 r/min活化2 h，即为酵母活化液。将此酵母活化液5 000 r/min离心10 min，弃上清，蒸馏水洗酵母后再次离心，收集酵母泥备用。
在50 ℃水浴条件下，大肠杆菌利用D-果糖10 h后加入1%～2%的酵母菌泥，在35 ℃、pH 4.5的条件下发酵14 h，发酵过程中每2 h取一次样，采用HPLC法测定分析D-果糖和D-阿洛酮糖的含量。
2 结果与分析
2.1 重组菌大肠杆菌BL21（DE3）-DPE的验证
3个重组菌的PCR验证结果见图1。由图1可知，目的片段大小分别为872 bp、879 bp、885 bp，与目的基因大小相符说明目的基因均已成功转化入E.coli BL21(DE3)中。
图1 PCR扩增产物电泳图
Fig.1 Electrophoresis of PCR amplified products
M为DL 5000 Marker；123泳道分别为E.coli BL21（DE3）-DPE1、E.coli BL21（DE3）-DPE2、E.coli BL21（DE3）-DPE3的PCR验证结果。
2.2 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳分析
为验证pET-20b-DPE1、pET-20b-DPE2、pET-20b-DPE3在E.coli BL21（DE3）中是否正确表达，对发酵培养破碎后的重组大肠杆菌细胞进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）检测分析结果见图2。由图2可知，发酵后的重组大肠杆菌在32 kDa左右处有目的条带，与目的蛋白的分子质量一致，SDS-PAGE结果证明了D-阿洛酮糖3-差向异构酶DPE1、DPE2和DPE3在E.coli BL21（DE3）中均已正确表达。
图2 重组大肠杆菌SDS-PAGE电泳图
Fig.2 SDS-PAGE analysis of the recombinant Escherichia coli cells
M：蛋白Marker（10～250 kDa）；1、2、3分别为发酵后的E.coli BL21-DPE1、E.coli BL21-DPE2和E.coli BL21-DPE3，以及E.coli BL21，分子质量分别约为31.9 kDa、32.2 kDa、32.4 kDa。
2.3 D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性及果糖转化分析
采用HPLC方法对E.coli BL21-DPE1、E.coli BL21-DPE2和E.coli BL21-DPE3细胞中的D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活进行测定，结果见图3。由图3可知，E.coli BL21-DPE1的D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活性最高，为10.18U/mL，E.coli BL21-DPE2和E.coli BL21-DPE3的酶活分别为3.06 U/mL、6.48 U/mL。
图3 D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性及果糖转化分析
Fig.3 Analysis of the activity and fructose conversion of D-allulose 3-heteroisomeras
离心收集含有D-阿洛酮糖3-差向异构酶的细胞E.coli BL21-DPE1、E.coli BL21-DPE2和E.coli BL21-DPE3，并对各含有D-阿洛酮糖3-差向异构酶的菌体的转化率进行分析，经55 ℃水浴转化10 h后，每1 h取样，结果见图3。由图3可知，0～3 h时，果糖不断减少，酮糖不断增加，转化率升高。4 h以后转化率基本达到平稳状态。其中E.coli BL21-DPE1转化率最高为27.56%，E.coli BL21-DPE2转化率最高为23.99%，E.coli BL21-DPE3转化率最高为25.98%。考虑到E.coli BL21-DPE1具有最高的转化率，后续偶联酿酒酵母发酵时采用E.coli BL21-DPE1的转化液进行进一步转化。
2.4 转化液偶联酵母发酵分析
转化液偶联酵母发酵分析结果见图4。
图4 转化液偶联酵母发酵分析
Fig.4 Transfer liquid-coupled yeast fermentation analysis
由图4可知，加入2%酵母菌泥后，前8 h 酵母消耗D-果糖较慢，转化8 h后，酵母快速消耗D-果糖，而在发酵培养过程中，几乎不消耗酮糖，质量浓度保持在54 g/L左右，而经24 h 转化后，D-果糖质量浓度降低至7.71 g/L，D-阿洛酮糖的质量浓度则由初始的28.33%提高至87.54%，D-果糖转化转化后的D-果糖率达到94.22%。
3 结论
本研究经基因克隆得到pET-20b-DPE1、pET-20b-DPE2、pET-20b-DPE3这三个质粒，通过电转化将三个质粒导入E.coli BL21（DE3）中，得到重组菌E.coli BL21-DPE1、E.coli BL21-DPE2和E.coli BL21-DPE3。经活性分析发现，E.coli BL21-DPE1的酶活性最高为10.18 U/mL，E.coli BL21-DPE2和E.coli BL21-DPE3的酶活分别为3.06 U/mL、6.48 U/mL。其中E.coli BL21-DPE1转化率最高为27.56%，E.coli BL21-DPE2和E.coli BL21-DPE3的转化率分别为23.99%和25.98%，由此可以看出E.coli BL21-DPE1的优势远高于其他两种基因。与此同时偶联酵母菌发酵，消耗混合糖液D-果糖和D-阿洛酮糖中的D-果糖，D-果糖去除率达到94.22%，增加D-阿洛酮糖的相对含量，为推进下游D-阿洛酮糖的纯化提供新思路，对推动工业化大规模生产，丰富功能性稀有糖市场具有重要的意义。
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