红小米为南阳盆地特产，因谷壳呈红色，本地俗称红谷，学名为“粟”，也称作粱、粟米，为禾本科一年生草本植物“粟”加工去皮后的成品。红小米与糯米、黍米等农作物相比，其淀粉含量较低，蛋白质、脂肪和维生素含量较高，且富含人体必需的8种氨基酸，比例协调，具有较高的营养价值。红小米不仅可供食用，也可入药，起到清热、止渴，滋阴，补脾肾，健肠胃等功效。随着“健康中国2030”规划纲要的实施，具有养生及保健作用的小米黄酒已成为研究热点之一，如李安等[1]采用单因素试验及响应面分析试验，对小米黄酒的发酵工艺进行了研究；石黎琳等[2]利用顶空固相微萃取技术，结合气相色谱-质谱联用检测技术研究了不同品种小米对黄酒风味的影响。
黄酒是世界上最古老的酒类之一，在我国已有3 000余年的历史，与啤酒、葡萄酒并称世界三大古酒[3-4]。黄酒营养成分丰富，被誉为“液体蛋糕”，富含氨基酸、活性多肽、功能性低聚糖、有机酸、多种维生素及微量元素等[5-8]，具有降血压、降胆固醇、抗氧化、抗衰老和提高免疫力等生理功能[9-12]。
该研究以南阳盆地特色农作物红小米为主要原料酿制红小米黄酒，采用单因素试验与Box-Behnken试验相结合的方法，以酒精度为评价指标，对前发酵工艺进行优化；在此基础上，以黄酒国家质量标准为依据，以感官评分为评价指标，采用均匀设计试验对后发酵工艺进行优化，并对酿制的红小米黄酒进行体外抗氧化活性评价，以期为红小米黄酒酿造的工程化实践操作提供有价值的参考，为进一步研究红小米黄酒抗氧化作用的机理奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
红小米：南阳市镇平县；绍酒风味T3酿酒曲（根霉菌、α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、酿酒酵母）：安琪酵母股份有限公司；麦曲：山东梁山徐曙生物工程有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）：上海北诺生物科技有限公司；硫酸亚铁、抗坏血酸、水杨酸、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁等（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、盐酸、双氧水、磷酸等（均为分析纯）：天津科密欧化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
BS110S电子天平：北京赛多利斯天平有限公司；DNP-9082电热恒温培养箱、752N紫外-可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；HHS-6电热恒温水浴锅：上海跃进医疗器械厂；XH-A旋涡混合器：无锡杰瑞安仪器设备有限公司；TDL-40B台式高速离心机：上海安亭科学仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 红小米黄酒酿造工艺流程及操作要点
采用摊饭法酿造红小米黄酒，具体工艺流程如下：
浸米→蒸煮→摊凉→拌曲（酿酒曲、麦曲）→装罐→前发酵及开耙→后发酵→过滤→煎酒（灭菌）→装坛→陈酿→成品
操作要点：
称取经预处理的红小米适量，置于不锈钢锅内，加自来水浸泡，水面超过米层3 cm左右，室温下浸泡24 h，早晚各换水1次，沥干水分，蒸煮2 h，摊凉冷却至35 ℃；按比例加入粉碎后的麦曲、酿酒曲，拌合均匀；装入已灭菌的玻璃发酵罐，加适量煮沸后冷却至室温的蒸馏水，搅拌均匀，封口，进行前发酵；醪液品温升至37 ℃，开头耙，头耙后，间隔4～5 h开耙1次，开耙4次后，每日捣耙2次；前发酵结束后，密封罐口，进行后发酵；后发酵结束，使用滤布对醪液进行粗滤，滤液再用砂芯漏斗进行精滤，所得澄清酒液煮沸后，趁热装入已灭菌陶坛内，密闭陈酿，得到红小米黄酒。
1.3.2 红小米黄酒酿造前发酵工艺优化
（1）单因素试验
选择麦曲接种量（5.5%、7.0%、8.5%、10.0%、11.5%、13.0%）、酿酒曲接种量（0.30%、0.35%、0.40%、0.45%、0.50%）、前发酵温度（19.0 ℃、22.0 ℃、25.0 ℃、28.0 ℃、31.0 ℃、34.0 ℃）、前发酵时间（3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d）作为考查因素，选择料液比1∶1.3（g∶mL）进行前发酵，酿造红小米黄酒。单因素试验时，每次固定其中3个因素，考查其他因素对红小米黄酒醪液酒精度的影响。
（2）Box-Behnken试验设计
在单因素试验基础上，选择麦曲用量（X1）、酿酒曲用量（X2）、前发酵温度（X3）、前发酵时间（X4）为自变量，以醪液酒精度（Y）为响应值，进行4因素3水平的Box-Behnken试验设计[13-14]，具体因素与水平见表1。
表1 Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design
1.3.3 红小米黄酒酿造后发酵工艺优化均匀设计试验
在前发酵基础上，选择后发酵温度X5（9.0 ℃、12.0 ℃、15.0 ℃、18.0 ℃、21.0 ℃、24.0 ℃）、后发酵时间X6（25 d、35 d、45 d、55 d、65 d、75 d）为考察因素，进行均匀设计试验[15-16]，具体因素与水平见表2。根据均匀设计试验因素水平，按不同后发酵条件组合进行后发酵试验，以感官鉴评得分为指标，确定较优后发酵工艺条件。
表2 均匀设计试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of uniform design experiments
1.3.4 指标测定方法
（1）红小米黄酒前发酵阶段酒精含量测定
食品安全国家标准GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》。
（2）红小米黄酒后发酵阶段感官鉴评方法
从南阳本地多家黄酒生产企业，邀请10位从事黄酒生产15年以上的专家，根据GB/T 13662—2018《黄酒》国家标准，从外观（15分）、香气（25分）、口味（40分）、风格（20分）等方面对后发酵结束经压榨、澄清处理的红小米黄酒原酒样液，进行感官鉴评打分，满分100分，感官鉴评标准见表3。
表3 红小米黄酒感官鉴评标准
Table 3 Sensory evaluation standards of red-millet Huangjiu
续表
1.3.5 红小米黄酒体外抗氧化活性评价方法（1）清除DPPH·活性测定
采用文献[17-18]的方法稍微修改，分别向10支具塞刻度试管中加入0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、1.8 mL、2.0 mL待测黄酒样液，加蒸馏水补至2.0 mL，加入2.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液，振荡均匀，常温条件下避光静置20 min，作为待测样品；用等体积的无水乙醇代替DPPH溶液作为对照组；用等体积的蒸馏水代替黄酒样液作为空白组；用等体积同浓度维生素C（vitamin C，VC）溶液作为阳性对照；以无水乙醇调零，分别在517 nm波长下测定待测样品、对照组、空白组及阳性对照组的吸光度值，通过下式计算黄酒样液及与黄酒样液等体积同浓度VC溶液对DPPH·的清除率，计算黄酒样液、VC溶液的半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值。
黄酒样液DPPH·清除率=（1-
）×100%
（2）清除·OH活性测定
采用文献[19-20]的方法稍微修改，分别向10支具塞刻度试管中加入0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、1.8 mL、2.0 mL待测黄酒样液，加蒸馏水补至2.0 mL，加入6.0 mmol/L 的FeSO4溶液、6.0 mmol/L的水杨酸乙醇溶液各2.0 mL，再加入8.8 mmol/L的H2O2溶液2.0 mL，振荡均匀，37 ℃水浴下反应20 min，作为待测样品；用等体积的蒸馏水替代H2O2溶液作为对照组；用等体积的蒸馏水代替黄酒样液作为空白组；用等体积同浓度VC溶液作为阳性对照；以蒸馏水调零，分别在波长510 nm处测定待测样品、对照组、空白组及阳性对照组的吸光度值，通过下式计算黄酒样液及与黄酒样液等体积同浓度VC溶液对·OH的清除率，计算黄酒样液、VC溶液的IC50值。
黄酒样液·OH清除率=（1-
）×100%
（3）还原力测定
采用文献[21-22]的方法稍微修改，分别向5支具塞刻度试管中加入0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL的待测黄酒样液，加蒸馏水补至1.0 mL，加入2.5 mL 0.2 mol/L的H3PO4缓冲液（pH6.6）、2.5 mL 30.0 mmol/L的K3[Fe（CN）6]溶液，漩涡振荡器混匀；50 ℃水浴条件下反应20 min，迅速冷却，加入2.5 mL 0.6 mol/L的C2HCl3O2溶液，高速台式离心机4 500 r/min离心5 min。取离心后上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水及0.5 mL 6 mmol/L的FeCl3溶液，波长700 nm下测吸光度值。用等体积同浓度VC溶液代替黄酒样液作为阳性对照。
2 结果与分析
2.1 红小米黄酒酿造前发酵工艺优化
2.1.1 单因素试验结果及分析
（1）麦曲用量对醪液酒精度的影响
由图1可知，麦曲用量为5.5%～10%时，随着麦曲用量增加，醪液中糖化酶量逐渐增多，红小米所含淀粉水解程度增大，为酿酒曲中的微生物菌群（根霉菌、酿酒酵母）提供充足碳源，酿酒酵母迅速繁殖，达到一定程度时，不断通过自身代谢活动产生酒精，使醪液酒精度逐渐增大；当麦曲用量增加至10%时，红小米所含淀粉水解基本达到饱和，酿酒酵母将淀粉水解产物转化为酒精度为最大值，此时醪液酒精度最高；继续增加麦曲用量，对淀粉的水解程度影响不大，但是添加麦曲量多，带入产酸细菌增加，反而抑制酿酒酵母代谢产酒精，醪液酒精度有所下降[23]。因此，最佳麦曲用量为10%。
图1 麦曲用量对醪液酒精度的影响
Fig.1 Effect of wheat koji addition on alcohol content of mash
（2）酿酒曲用量对醪液酒精度的影响
由图2可知，酿酒曲用量为0.30%～0.45%时，随酿酒曲用量增大，α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶随之增多，将红小米所含淀粉水解为单糖，为酿造体系中的微生物菌群提供充足碳源，酿造体系发酵速度加快，醪液中酒精含量迅速增加；当酿酒曲用量为0.45%时，酒精度达到最大值；当酿酒曲用量＞0.45%时，酿酒酵母大量繁殖，呼吸代谢旺盛，醪液中糖分被快速消耗，使得酿造体系营养供给不足，黄酒醪液酒精度降低[24]。因此，最佳酿酒曲用量为0.45%。
图2 酿酒曲用量对醪液酒精度的影响
Fig.2 Effect of brewing koji addition on alcohol content of mash
（3）前发酵温度对醪液酒精度的影响
由图3可知，前发酵温度为19～25 ℃时，醪液酒精度随前发酵温度升高逐渐增大，可能是低温条件下，酿酒酵母代谢缓慢，酒精度较低，随着前发酵温度增加，酿酒酵母代谢活动加速，产生较多酒精，醪液酒精度逐渐增大；前发酵温度为25 ℃，酒精度达到最大值；前发酵温度＞25 ℃时，由于发酵过程比较剧烈，菌体繁殖过程中产生大量生物热，醪液迅速升温，高温条件下酿酒酵母易发生早衰，导致发酵不彻底，醪液酒精度呈下降趋势[25]。因此，最佳前发酵温度为25 ℃。
图3 前发酵温度对醪液酒精度的影响
Fig.3 Effect of pre-fermentation temperature on alcohol content of mash
（4）前发酵时间对醪液酒精度的影响
由图4可知，前发酵时间为3～7 d，随前发酵时间延长，酿造体系中的酿酒酵母利用原料水解提供的营养成分，快速繁殖，醪液酒精度迅速上升；前发酵时间为7 d，酒精度达到最大值；前发酵时间＞7 d时，原料水解所产生的营养成分大部分被消耗，不能为酿酒酵母产酒精代谢提供充足底物，同时酿酒酵母在高酒精度条件下其代谢活性被抑制，菌体发生衰亡，随前发酵时间延长，部分酒精被转化为有机酸和酯类，醪液中酒精度稍有下降[26]。因此，最佳前发酵时间为7 d。
图4 前发酵时间对醪液酒精度的影响
Fig.4 Effect of pre-fermentation time on alcohol content of mash
2.1.2 Box-Behnken试验结果
为优化红小米黄酒酿造前发酵工艺条件，在单因素试验基础上，以麦曲用量（X1）、酿酒曲用量（X2）、前发酵温度（X3）、前发酵时间（X4）为评价因素，以醪液酒精度（Y）为评价指标进行Box-Behnken试验，具体试验设计及结果见表4。
表4 Box-Behnken试验设计与结果
Table 4 Design and results of Box-Behnken experiments
利用SAS数据统计分析软件对Box-Behnken试验数据进行二次多元回归拟合，建立麦曲用量（X1）、酿酒曲用量（X2）、前发酵温度（X3）、前发酵时间（X4）与醪液酒精度（Y）之间关系的二次多元回归方程如下：
对上述数学模型进行方差分析，结果见表5。主要因素交互作用对酒精度影响的响应面图见图5。
图5 主要因素交互作用对醪液酒精度影响的响应面图
Fig.5 Response surface plots of the effects of interaction between main factors on alcohol content of mash
由表5可知，回归方程的F值为10.264 9，大于F值的概率（Pr＞F）为0.000 129，表明所建立的回归方程达到极显著水平（P＜0.01），模型可信度极高。回归方程的R2=98.23%，说明响应值有98.23%的变化源自对应变量，回归方程拟合良好。由P值可知，方程的X4、X1X4、X2X3、X2X4、X32、X42对醪液酒精度Y值的影响极显著（P＜0.01），X3、X22对醪液酒精度Y值的影响显著（P＜0.05），说明麦曲用量（X1）、酿酒曲用量（X2）、前发酵温度（X3）、前发酵时间（X4）与醪液酒精度Y之间并非简单的线性关系，因素间的交互作用对醪液酒精度Y影响较大。由F值确定各因素对醪液酒精度Y影响的主次顺序为：前发酵时间＞前发酵温度＞酿酒曲用量＞麦曲用量。
表5 回归模型方差分析
Table 5 Variance analysis of regression model
2.1.3 红小米黄酒前发酵最佳工艺条件的预测及验证
利用SAS数据统计分析软件对建立的数学模型进行分析求解，得出红小米黄酒前最佳发酵工艺条件为：麦曲用量9.048 6%，酿酒曲用量0.483 6%，前发酵温度25.910 6 ℃，前发酵时间7.009 d。
为便于实践操作，将最佳前发酵工艺条件修正为：麦曲用量9%，酿酒曲用量0.48%，前发酵温度26 ℃，前发酵时间7 d。在上述条件下进行3次平行发酵试验，测得醪液酒精度为16.15%vol，与预测值偏差为0.24%，说明经优化后的前发酵工艺条件切实可行。
2.2 红小米黄酒酿造后发酵阶段工艺优化均匀设计试验结果
对12组在不同后发酵温度及时间组合条件下酿造的红小米黄酒，从外观、香气、口味、风格等方面进行品评的得分情况见图6。由图6可知，第1、5、12号黄酒样液感官得分较高，对应的后发酵温度及时间组合分别为：12 ℃、75d；9℃、55 d；9 ℃、65 d。通过对专家鉴评得分情况进行分析可知，后发酵温度和时间对红小米黄酒品质有重要影响，低温、长时后发酵有助于提升红小米黄酒品质，高温、短时后发酵不利于红小米黄酒品质提升。结合黄酒酿造实际，温度过低，不易进行工程实践操作，故确定红小米黄酒后发酵酿造较优工艺条件为：后发酵温度12 ℃、后发酵时间75 d。
图6 不同后发酵条件组合试验结果
Fig.6 Experiment results of different combination of post-fermentation conditions
2.3 红小米黄酒样液体外抗氧化活性评价结果
2.3.1 清除DPPH·活性测定结果
由图7可知，随黄酒样液及VC溶液浓度增加，两者对DPPH·的清除率迅速增大，当黄酒样液浓度＞0.6 mL/mL，VC溶液质量浓度＞0.6 mg/mL时，两者对DPPH·的清除率趋于平缓。黄酒样液清除DPPH·的IC50值为0.45 mL/mL，VC溶液清除DPPH·的IC50值为0.31 mg/mL，说明两者均具有较强的DPPH·清除能力，黄酒样液清除DPPH·能力弱于同等浓度的VC溶液。
图7 红小米黄酒样液对DPPH·的清除效果
Fig.7 Scavenging effect of red-millet Huangjiu samples on DPPH·
2.3.2 清除·OH活性测定结果
由图8可知，黄酒样液和VC溶液对·OH的清除率与浓度有明显的量效关系，黄酒样液清除·OH的IC50值为0.48 mL/mL，VC溶液清除·OH的IC50值为0.27 mg/mL，就两者对·OH的清除能力而言，同等浓度的VC溶液强于黄酒样液，但两者均具有较强的·OH清除活性。
图8 红小米黄酒样液对·OH的清除效果
Fig.8 Scavenging effect of red-millet Huangjiu samples on·OH
2.3.3 还原力测定结果
由图9可知，黄酒样液和VC溶液对K3[Fe（CN）6]的还原力与浓度呈线性关系，随着黄酒样液和VC溶液浓度的增加，其对K3[Fe（CN）6]的还原力逐渐增强。同等浓度情况下，黄酒样液对K3[Fe（CN）6]的还原力明显低于VC溶液。
图9 红小米黄酒样液还原力测定结果
Fig.9 Determination results of reduction ability of red-millet Huangjiu samples
通过综合分析黄酒样液对DPPH·和·OH清除率能力及对K3[Fe（CN）6]的还原力测定试验结果，发现黄酒样液对K3[Fe（CN）6]的还原力与清除DPPH·和·OH的能力存在一定相关性，黄酒样液对DPPH·和·OH的清除活性越强，其对K3[Fe（CN）6]的还原力也越强。
3 结论
研究对影响红小米黄酒前发酵阶段醪液酒精度的麦曲用量、酿酒曲用量、前发酵温度、前发酵时间等因素，在单因素试验基础上，进行Box-Behnken试验，利用SAS软件对Box-Behnken试验数据进行二次多元回归拟合，建立了反映麦曲用量、酿酒曲用量、前发酵温度、前发酵时间与醪液酒精度之间关系的二次多元回归方程。利用SAS软件对建立的数学模型进行分析求解，并结合工程实际，确定红小米黄酒前发酵阶段较优工艺条件为：麦曲用量9%，酿酒曲用量0.48%，前发酵温度26 ℃，前发酵时间7 d。在上述条件下，红小米黄酒前发酵阶段醪液酒精度可达16.15%vol。后发酵试验结果显示，红小米黄酒后发酵最佳工艺条件为温度12 ℃、时间75 d。
综合分析红小米黄酒样液对DPPH·和·OH清除能力及还原力测定试验结果，发现黄酒样液对K3[Fe（CN）6]的还原力与清除DPPH·和·OH的能力存在相关性，黄酒样液对DPPH·和·OH的清除活性越强，其对K3[Fe（CN）6]的还原力也越强。
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