小麦是我国的主要粮食作物，其产量和消费量占世界谷物消费总量的30%左右[1-2]。淀粉约占小麦籽粒干质量的54%～72%[3]。在制糖行业中，多采用小麦淀粉双酶法制糖，但是此工艺糖化液中的蛋白质等其他杂质多，容易造成葡萄糖收率低和蛋白质浪费[4]，大量的小麦蛋白并没有得到充分利用。小麦中的蛋白质含量约占小麦总质量的13%[5]。研究表明，小麦蛋白有几乎齐全的氨基酸组成，其中谷氨酰胺含量最高[6]。而谷氨酰胺经水解后所得到的产物谷氨酸是食品中鲜味的主要来源。
蛋白质发酵液是由动植物等天然蛋白质经化学和生物方法水解，通过分离纯化得到的产物[7]。蛋白质经过水解生成氨基酸、肽等具有生物活性的小分子物质，影响食品的呈味和营养特性[8]，可被开发成安全，营养的新型调味品。同时，这些发酵液在抗菌[9]、降低血压[10]、提高动物免疫水平[11]等方面的潜力也越来越受到人们的关注。
目前，生产蛋白质水解物主要途径是蛋白酶酶解[12]。这种方法条件温和，安全性高，可控性强[13]。但是商业用的蛋白酶制剂多为单一型内切酶[14]，存在原料利用不完全，成本高昂等问题。因此微生物水解法就成为一种非常安全，有效的替代方式。枯草芽孢杆菌在2008年被农业部列为益生菌之一[15]。而米曲霉是酿造酱油的重要微生物[16]。两种微生物胞外酶系十分复杂，能分泌蛋白酶[17-18]、谷氨酰胺酶、糖化酶等。
本研究的主要目的是以小麦宏量组分定向酶解后的一种产物，即脱淀粉麦粒中蛋白质为基质，利用枯草芽孢杆菌和米曲霉进行前发酵，获得具有高蛋白酶活力的前发酵基质，通过加盐水进行后发酵，评估两种微生物发酵液的理化指标和氨基酸组成，以期为小麦蛋白质的生物加工和高值化利用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
枯草芽孢杆菌BS001：由华南农业大学食品学院工业微生物育种实验室分离保藏；米曲霉孢子（沪酿3.042）：上海佳民酿造食品有限公司；脱淀粉小麦：由华南农业大学食品学院工业微生物育种实验室制备[19]；LB液体培养基：北京索莱宝科技有限公司；其他常规试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-1FD洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；三温区培养箱FPG 3：宁波莱福科技有限公司；FE20型pH计、AL204型分析天平：梅特勒－托利多仪器有限公司；759紫外线可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；手持折光仪：上海力辰仪器科技有限公司；日立L-8900全自动氨基酸分析仪：日立高新技术公司。
1.3 方法
1.3.1 枯草芽孢杆菌和米曲霉前发酵试验
取2个250 mL三角瓶，分别加入20.0 g脱淀粉小麦。枯草芽孢杆菌发酵样品按料液比2∶1（g∶mL）加入40 g质量分数为1.2%的葡萄糖溶液；米曲霉发酵样品按料液比1∶1（g∶mL）加入20 g质量分数为1.2%的葡萄糖溶液。两个样品在121 ℃高压灭菌15 min，使样品充分复水，冷却后，枯草芽孢杆菌发酵样品在无菌操作下按3.0%的接种量（以脱淀粉小麦干质量计）接入枯草芽孢杆菌种子液，于34 ℃培养箱培养48 h；米曲霉样品按脱淀粉小麦干质量的0.1%拌入米曲霉孢子，混匀后在4层纱布上摊开，表面同样覆盖4层纱布，置于30 ℃的人工气候箱中培养，相对湿度为90%，培养时间为48 h，在18 h翻动基质，防止温度过高。两种微生物的前发酵条件已进行工艺优化，为最佳产酶培养条件。
1.3.2 枯草芽孢杆菌和米曲霉后发酵试验
在枯草芽孢杆菌和米曲霉发酵样品中分别按料液比2∶1（g∶mL）和3.5∶1（g∶mL）（以前发酵基质质量计）加入120 g和140 g质量分数8.0%的盐水，保持枯草芽孢杆菌和米曲霉样品在整个发酵过程中加水量一致。两个样品同时置于42 ℃培养箱保温发酵。每2 d搅动发酵液，保持表面湿润，每6 d测定氨基酸态氮、pH、可溶性固形物等指标。42 d后停止发酵，过滤发酵液，测定其氨基酸组成，并进行感官评价。
1.3.3 测定方法
中性蛋白酶活力：参照GAO X L等[20]的方法进行测定，酶活力以干基计；pH值：采用pH计直接测定；可溶性无盐固形物含量：采用手持折光仪直接测定；氨基酸态氮：参照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定方法》[21]；蛋白质水解度：参照历望等[22]的方法进行测定。
发酵液中游离氨基酸分析：将发酵液中残渣过滤后，吸取1 mL发酵液稀释3倍，加入3 mL磺基水杨酸溶液（5%）混合，4 ℃静置1 h 后以12 000 r/min离心10 min。通过0.22 μm膜过滤后使用自动氨基酸分析仪进行分析。分析条件：柱温为程序变温；色谱柱为日立855-4507型；反应柱温135 ℃；柠檬酸（锂）PF缓冲液梯度洗脱；检测波长为570 nm+440 nm；洗脱泵流速0.35 mL/min，衍生泵流速0.30 mL/min；分析时间148 min；进样量20 μL。氨基酸评价：必需氨基酸（essential amino acid，EAA）按照参考文献[23]进行评价；呈味氨基酸参考王馨雨等[24]的方法进行评价。
发酵液感官评价：以色泽、体态、香气、鲜味、咸味、苦涩味、后味为指标，评分及评分标准见表1。
表1 发酵液的感官评定标准
Table 1 Sensory evaluation standards of fermentation broth
1.3.4 数据处理
所有实验均重复进行3次。数据处理与图表绘制采用Origin 8.5和Excel 2016。
2 结果与分析
2.1 前发酵中性蛋白酶活力比较
由图1可知，12～48 h时枯草芽孢杆菌中性蛋白酶活力快速升高，并在48 h达到最大值，此时中性蛋白酶活力为1 060.82 U/g。48 h后由于活细菌减少，开始形成芽孢，而在芽孢形成过程中，母细胞需要广泛的更新蛋白，消耗了母细胞的营养物质，因此，大量的中性蛋白酶用于新蛋白的合成迅速衰退[25-26]。12～48 h时米曲霉中性蛋白酶活力随培养时间的延长而逐渐提高，在48 h时达到最大值，此时中性蛋白酶活力为908.02 U/g。48 h后，米曲霉分解蛋白质产生的氨基酸、多肽等胞外蛋白物质开始累积，对蛋白酶的抑制作用和产蛋白酶的阻碍作用导致蛋白酶活力减小[27]。总体而言，枯草芽孢杆菌和米曲霉在培养48 h时，均能达到产酶峰值。因此，选定培养48 h的发酵基质进行加盐水后发酵。
图1 枯草芽孢杆菌、米曲霉前发酵过程中中性蛋白酶活力变化趋势
Fig.1 Change trend of neutral protease activity during the pre-fermentation process of Bacillus subtilis and Aspergillus oryzae
2.2 枯草芽孢杆菌和米曲霉加盐水后发酵
2.2.1 两种微生物后发酵过程中pH值的变化
由图2可知，加盐水后两种微生物发酵液的pH呈现较大差异，枯草芽孢杆菌发酵液的pH在0～24 d内稳定上升，这可能是枯草芽孢杆菌分泌的中性蛋白酶在水解蛋白质时，会产生胺类物质甚至氨气，从而使发酵液pH升高[28]，24 d后由于耐盐型乳酸菌繁殖代谢产生乳酸、乙酸等有机酸[29]，这些酸性代谢产物的积累，使枯草芽孢杆菌发酵液的pH逐渐降低至7.08。米曲霉发酵液的pH在0～30 d呈现降低趋势，这是由于发酵前期是氨基酸溶出的过程，pH快速降低；在发酵中后期，以乳酸菌逐渐繁殖[30]，因此pH值进一步降低。30 d后pH值趋于稳定（pH值为5.37）。
图2 枯草芽孢杆菌、米曲霉后发酵过程pH值变化趋势
Fig.2 Change trend of pH value during post-fermentation process of Bacillus subtilis and Aspergillus oryzae
2.2.2 两种微生物后发酵过程中可溶性无盐固形物含量的变化
由图3可知，在后发酵过程，枯草芽孢杆菌和米曲霉发酵液中可溶性无盐固形物含量逐渐增加，分别在36 d和30 d保持稳定，可溶性无盐固形物最终含量为15.60%和18.98%。总体看，米曲霉发酵液各时期的可溶性无盐固形物含量均高于枯草芽孢杆菌，这可能是枯草芽孢杆菌对脱淀粉小麦中蛋白质的利用率较低，游离氨基酸转化能力差。
图3 枯草芽孢杆菌、米曲霉后发酵过程可溶性无盐固形物含量变化趋势
Fig.3 Change trend of soluble salt-free solids contents during postfermentation process of Bacillus subtilis and Aspergillus oryzae
2.2.3 两种微生物后发酵过程中氨基酸态氮含量的变化
由图4可知，0～24 d内枯草芽孢杆菌发酵液氨基酸态氮含量持续增加；24 d后保持平稳；42 d后发酵液氨基酸态氮含量为0.727 g/100 mL，蛋白质水解度为55.99%。米曲霉发酵液基酸态氮含量逐渐增加，最终值为0.746 g/100 mL，蛋白质水解度为59.71%。
图4 枯草芽孢杆菌、米曲霉后发酵过程氨基酸态氮含量变化趋势
Fig.4 Change trend of amino acid nitrogen contents during post-fermentation process of Bacillus subtilis and Aspergillus oryzae
2.3 两种微生物发酵液中游离氨基酸分析
2.3.1 两种微生物发酵液中游离氨基酸的组成和呈味特性
由表2可知，枯草芽孢杆菌发酵液中氨基酸种类共有16种，总游离氨基酸（total free amino acid，TAA）含量为4.352 mg/mL。米曲霉发酵液中氨基酸种类为17种，总游离氨基酸含量为9.044 mg/mL。除枯草芽孢杆菌发酵液中的16种氨基酸外，米曲霉发酵液中还检测出精氨酸，这说明枯草芽孢杆菌和米曲霉的酶系有一定差异，其对小麦蛋白的水解位点及活力有差别，导致最终发酵液的氨基酸组成不同[31]。
表2 枯草芽孢杆菌、米曲霉发酵液中游离氨基酸的组成及含量
Table 2 Composition and contents of free amino acids in fermentation broth of Bacillus subtilis and Aspergillus oryzae
注：“-”表示未检出；“*”表示必需氨基酸。
根据呈味特性，游离氨基酸可分为4类，鲜味氨基酸（Asp、Glu、Lys）、甜味氨基酸（Thr、Ser、Gly、Ala、His、Pro）、苦味氨基酸（Met、Ile、Val、Leu、Arg）、其他氨基酸（Tyr、Phe、Cys）。在呈味氨基酸总含量方面，米曲霉发酵液高于枯草芽孢杆菌发酵液。其中，米曲霉发酵液中鲜味氨基酸和甜味氨基酸含量均高于枯草芽孢杆菌发酵液，米曲霉发酵液中的谷氨酸含量为2.208 mg/mL，远高于于枯草芽孢杆菌；枯草芽孢杆菌苦味氨基酸占比更高。整体看，米曲霉发酵液中鲜味氨基酸和甜味氨基酸对发酵液的风味贡献更大。
2.3.2 两种发酵液中氨基酸的营养特性评价
必需氨基酸（EAA）的种类和比例是评价食物蛋白质的重要营养指标，必需氨基酸的组成与比例越接近世界卫生组织/联合国粮农组织（World Health Organization/Food and Agriculture Organization of the United Nations，WHO/FAO）推荐的氨基酸模式谱，营养价值就越高，也越容易被人体吸收利用[34]。由表3可知，与WHO/FAO模式谱相比，枯草芽孢杆菌发酵液中的Lys、Ile、Val、Leu、Tyr+Phe、Cys+Met均高于WHO/FAO模式谱标准，仅Thr未达到该模式谱要求；米曲霉发酵液Thr、Ile、Val、Leu、Tyr+Phe均高于模式谱标准，而Lys、Cys+Met未达到。总体看，枯草芽孢杆菌发酵液中必需氨基酸比例除Thr外，其余必需氨基酸比例均高于米曲霉发酵液，其中Val、Leu、Tyr+Phe、Cys+Met含量占比约为米曲霉发酵液的两倍。
表3 枯草芽孢杆菌、米曲霉发酵液必需氨基酸比例对比
Table 3 Comparison of essential amino acids ratio in fermentation broth of Bacillus subtilis and Aspergillus oryzae%
根据WHO/FAO提出的理想蛋白质模式，EAA与TAA的比值应在40%左右，EAA与非必需氨基酸（non-essential amino acid，NEAA）的比值接近或超过60%。枯草芽孢杆菌和米曲霉发酵液样品EAA/TAA和EAA/NEAA的比值见表4。
表4 枯草芽孢杆菌、米曲霉发酵液必需氨基酸和非必需氨基酸比例对比
Table 4 Comparison of essential and non-essential amino acids ratio in fermentation broth of Bacillus subtilis and Aspergillus oryzae%
由表4可知，米曲霉发酵液EAA/NEAA的值为56.36%，EAA/TAA的比值也接近40%。枯草芽孢杆菌发酵液样品EAA/TAA的比值为65.23%，高于此模式标准。EAA/NEAA的比值为187.64%，因此，可以将枯草芽孢杆菌发酵液与其他营养物质进行复配，作为营养补充剂摄入。
2.3.3 发酵液感官评定
由表5可知，米曲霉发酵液各项感官指标的评分均高于枯草芽孢杆菌，两者在后味、咸味和咸味方面接近。综合感官评定的各项指标，米曲霉发酵的脱淀粉麦粒蛋白质发酵液的风味要好于枯草芽孢杆菌。这与游离氨基酸的检测结果相印证，说明米曲霉发酵液更适合作调味液使用。
表5 两种发酵液感官评价结果
Table 5 Results of sensory evaluation in two kinds of fermentation broth
注：统计结果以“平均值±标准偏差”表示。
3 结论
在最适前发酵工艺的条件下，枯草芽孢杆菌和米曲霉中性蛋白酶活力分别为1 060.82 U/g和908.02 U/g；两种微生物最终发酵液pH值为7.08和5.37，可溶性无盐固形物为15.60%和18.98%，氨基酸态氮含量为0.727 g/100 mL和0.746 g/100 mL，总游离氨基酸含量为4.352 mg/mL和9.044 mg/mL，蛋白质水解度为55.99%和59.71%。枯草芽孢杆菌发酵液中的必需氨基酸比例高于米曲霉发酵液，而米曲霉发酵液中的呈味氨基酸总量高于枯草芽孢杆菌发酵液，尤其是鲜味氨基酸和甜味氨基酸；米曲霉发酵液中氨基酸态氮含量也高于枯草芽孢杆菌。因此，枯草芽孢杆菌发酵液可以作为营养补充剂的原料；米曲霉发酵液风味更好，可以用作调味品基料。
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