枸杞（Lycium barbarum）是茄科、枸杞属植物，其果实是历史悠久的药食两用物品[1]。宁夏是我国枸杞的发源地和主要生产地，且宁夏中宁枸杞更是因其高品质被载入新中国药典。中医药用记载枸杞具有强筋健骨、清肝明目、润肺滋肾、益气补虚等功能[2]。枸杞中不仅含有糖类、蛋白质等营养物质，而且含有枸杞多糖、甜菜碱、氨基酸、多酚、黄酮等多种生物活性成分[3-4]。这些营养及活性物质赋予了枸杞提高人体免疫功能、抗氧化、改善新陈代谢、预防肿瘤、延缓衰老等功效[5-6]。因其优质的保健价值被列入我国卫生部药食同源物品。
宁夏枸杞种植面积大，产量高，其药效和营养价值上均居国内前列，但目前主要以干果形式出售，产业多样化相对单一，枸杞加工转化率不足，严重阻碍了宁夏枸杞的产业发展。为了缩短原料处理周期、降低成本，克服枸杞不宜储存、加工转化率低的问题，将枸杞加工果酒，提高果酒品质和产品价值，增强市场竞争力，提高枸杞深加工产品市场份额。目前枸杞果酒的生产分为发酵型和配制型两种，其中传统发酵型枸杞酒多以枸杞干果为原料经发酵得到枸杞酒，家庭自酿、小企业小规模生产居多，发展缓慢。OUYANG X等[7]对枸杞酒的发酵过程进行了研究，结果发现发酵参数为初始糖度22%、初始酸度3.6 g/L、酵母接种量0.02%、发酵温度20 ℃，浸渍48 h，所酿制的枸杞果酒表现出最佳的枸杞果香和感官特征。汪琢等[8]研究了枸杞蓝莓酒的酿造工艺，结果表明在发酵温度24 ℃、二氧化硫添加量40 mg/L、酵母接种量0.08%、发酵时间8 d的最佳发酵参数下，得到一款枸杞蓝莓果酒。董赛君等[9]对枸杞果酒低温发酵工艺进行研究，其最佳发酵参数为初始pH值6.0、初始糖度16%、接种量0.7%、发酵温度18 ℃时，枸杞果酒酒体呈金黄色且酸甜可口。目前枸杞果酒的酿造主要集中于干枸杞及相关复合原料的工艺研究，而有关新鲜枸杞果酒工艺及营养功能成分报道还相对较少。
本研究选用宁夏中宁新鲜枸杞为主要原料，制备枸杞果酒，通过单因素试验和响应面分析优化枸杞果酒的发酵工艺参数，并对枸杞果酒的营养与功能成分进行分析，以期提高枸杞的附加值，推动枸杞深加工产品的开发与创新。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
枸杞（特级，固酸比为6.84，总糖为155.83 g/L）：宁夏中宁县；酿酒活性干酵母（RW）：安琪酵母股份有限公司；白砂糖、柠檬酸（均为食品级）：日照金禾博源生化有限公司；果胶酶（酶活4 000 U/g）：宁夏和氏璧生物技术有限公司；福林酚（分析纯）：索莱宝生物科技有限公司；没食子酸标准品（纯度≥98%）：上海哈灵生物科技有限公司；芦丁标准品（纯度≥98%）：西安森卓生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
ZWF-110X50水浴锅：上海智城分析仪器制造有限公司；JD-322榨汁机：浙江金达电热电器有限公司；JHGXT-4582ATC手持糖度折光仪：池州九华光学仪器有限公司；FA-A分析天平：北京世纪科信科学仪器有限公司；LHS-150生化培养箱：莱特（南通）科学仪器有限公司；Sense酶标仪：东乐自然基因生命科学公司；DKZ-1恒温水浴锅：济南来宝医疗器械有限公司；UV-765分光光度计、DL7M-12L离心机：渡扬精密仪器（上海）有限公司；1260-Infinity高效液相色谱仪：安捷伦科技有限公司；S-433D氨基酸自动分析仪：赛卡姆（北京）科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 枸杞果酒加工工艺流程及操作要点
枸杞→破碎匀浆→酶解→成分调整→灭菌→酵母活化→酒精发酵→过滤→陈酿→成品
破碎匀浆：将新鲜无病害的枸杞放入榨汁机中，按质量比加入5倍的纯净水进行破碎，得到枸杞果浆。
酶解：在枸杞果浆中按质量比加入0.02%的果胶酶，于45 ℃水浴锅中保温4 h，充分酶解，随后升温至85 ℃灭酶10 min。
成分调整：用白砂糖调整枸杞果浆的初始糖度为试验设定值，并用柠檬酸调整pH值为6。
酵母活化：称取酿酒活性干酵母，按质量比加入9倍的无菌水，在37 ℃水浴锅中活化20 min，制备酵母活化液。
酒精发酵：在调整好成分的枸杞果浆中接种酵母活化液于22 ℃恒温培养箱中发酵5 d，每天同一时间取样，测定酒精度，直至酒精度不再增加，结束发酵。
陈酿：将发酵酒液转移到储酒罐中，置于4 ℃储存28 d，使枸杞果酒味道协调，风味更加突出，得到枸杞果酒。
1.3.2 发酵工艺优化单因素试验
初始糖度分别为23°Bx、25°Bx、27°Bx、29°Bx、31°Bx的枸杞果浆经巴氏灭菌（65 ℃，30 min）后，分别接种0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%（V/V）的酵母活化液进行发酵，控制发酵温度分别为16 ℃、19 ℃、22 ℃、25 ℃、28 ℃，初始pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，发酵时间为5 d。分别考察初始糖度、酵母菌接种量、发酵温度、初始pH值对枸杞果酒品质的影响。
1.3.3 发酵工艺优化响应面试验设计
在单因素试验结果基础上，选取初始糖度（A）、酵母菌接种量（B）、发酵温度（C）、初始pH值（D）4个影响因素，以感官评分（Y）为响应值，进行4因素3水平的Box-Behnken试验设计，随后通过响应面分析确定枸杞果酒发酵的最优工艺参数。Box-Behnken试验设计因素与水平见表1。
表1 Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests design
1.3.4 分析检测
（1）理化指标的测定
蛋白质测定：采用国标GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法；脂肪测定：采用国标GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》中索氏抽提法；总糖测定：采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中直接滴定法；还原糖测定：采用国标GB 5009.7—2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》中直接滴定法；初始糖度测定：采用手持折光仪测定；酒精度测定：采用国标GB 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》中酒精计法。
（2）功能成分的测定
总多酚含量的测定[10]：在波长765 nm处测定吸光度值（A765nm），以没食子酸含量（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制没食子酸标准曲线，可得回归方程：y=0.007 7x+0.081 5（相关系数R2=0.995 5）。利用标准曲线回归方程计算样品中总多酚含量，结果以mg没食子酸当量（gallic acid equivalent，GAE）/mL表示。
总黄酮含量的测定[11]：在波长510 nm处测定吸光度值（A510nm），以芦丁含量（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制芦丁标准曲线，可得回归方程：y=0.248 9x+0.044 4（相关系数R2=0.999 6）。利用标准曲线回归方程计算样品中总黄酮含量，结果以mg芦丁当量（rutin equivalen，RE）/mL表示。
多糖含量的测定[12]：取适量枸杞果酒样品经40 ℃旋蒸后，加入4倍体积的无水乙醇，静置12 h，随后以8 000 r/min离心10 min，收集沉淀物，加入蒸馏水复溶，向复溶液中加入Sevage试剂（三氯甲烷与正丁醇按照4∶1的体积比例混合而成），振荡搅拌，8 000 r/min离心10 min，收集上清液，重复6～7遍，直至蛋白质去除干净，最后一次上清液经截留分子质量为8～14 kDa的透析袋在流水中透析72 h，收集袋内溶液，待测。葡萄糖标准曲线的绘制[13]：在波长490 nm处测定吸光度值（A490nm），以葡萄糖含量（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，可得回归方程：y=3.537 5x+0.103 9（相关系数R2=0.993 0）。利用标准曲线回归方程计算样品中多糖含量，结果以mg/mL表示。
甜菜碱含量的测定：采用农业行业标准NY/T 2947—2016《枸杞中甜菜碱含量的测定》中高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定。
氨基酸的测定：采用国标GB 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》。
（3）微生物指标的测定
菌落总数、大肠杆菌和致病菌分别按照国标GB4789.2—2016《食品安全国家标准菌落总数测定》、GB 4789.3—2016《食品安全国家标准大肠菌群计数》和GB 29921—2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》测定。
（4）感官评价
邀请10名专业品酒师组成一个枸杞果酒感官评定小组，依据国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的标准对本试验的枸杞果酒的色泽（1～15分）、澄清度（1～15分）、香气（1～30分）和滋味（1～40分）4个方面进行感官评定，果酒样品总分为4项得分之和，满分100分，枸杞果酒感官评价标准见表2。
表2 枸杞果酒感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of wolfberry fruit wine
1.3.5 数据处理与统计分析
采用GraphPad Prism 8.0.1进行数据处理和制图，采用DesignExpert8.0.6进行Box-Behnken试验设计和响应面分析。
2 结果与分析
2.1 发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 初始糖度对枸杞果酒酒精度和感官评分的影响
发酵液中初始糖度与发酵结束后酒精度的高低以及感官评价的好坏有密切的联系。初始糖度对枸杞果酒的影响结果如图1所示，随着发酵液中初始糖度在23～31°Bx范围内的增加，酒精度不断增加，感官评分却呈先上升后下降趋势。当初始糖度在23～27°Bx时，酒精度和感官评分不断增加；当初始糖度为27°Bx时，感官评分达到最大值，为90分，酒精度为12.12%vol；当初始糖度＞27°Bx之后，感官评分下降，这主要是因为发酵液中的初始糖度过高，发酵液的渗透压增大，造成酵母活力下降，不利于其生长与发酵。虽然酵母在初始糖度27～31°Bx范围内仍能利用糖生成酒精，但是效率降低，导致发酵不彻底，残糖含量过高，口感下降[14-15]。综合考虑，选择最适初始糖度为27°Bx。
图1 初始糖度对枸杞果酒酒精度和感官评分的影响
Fig.1 Effect of initial sugar content on alcohol content and sensory score of wolfberry fruit wine
2.1.2 酵母菌接种量对枸杞果酒酒精度和感官评分的影响
酵母接种量对枸杞果酒的影响如图2所示，随着酵母接种量在0.10%～0.30%范围内的增加，酒精度和感官评分呈先上升后下降趋势。当酵母接种量为0.10%～0.20%时，酒精度和感官评分随之增高；当酵母接种量为0.20%时，枸杞果酒的酒精度和感官评分达到了最大值，分别为12.14%vol，91分；当酵母接种量＞0.20%之后，枸杞果酒的酒精度和感官评分降低，其原因是发酵液中酵母菌在发酵前期大量繁殖，消耗了大量营养物质，产生抑制酵母菌的代谢废物，导致酒精度和口感降低[16]。综合考虑，选择最适酵母接种量为0.20%。
图2 酵母接种量对枸杞果酒酒精度和感官评分的影响
Fig.2 Effect of yeast inoculum on alcohol content and sensory score of wolfberry fruit wine
2.1.3 发酵温度对枸杞果酒酒精度和感官评分的影响
发酵温度对枸杞果酒的影响如图3所示，随着发酵温度在16～28 ℃范围内的升高，酒精度和感官评分均呈先上升后下降趋势。当发酵温度为16～22 ℃时，酒精度和感官评分随之提高；当发酵温度为22 ℃时，酒精度和感官评分达到最大值，分别为12.08%vol，90分；当发酵温度高于22 ℃之后，酒精度和感官评分随之下降。发酵温度过低时，酵母菌繁殖速率和活性都会降低，发酵产生的酒精会减少，导致酒体寡淡无味，口感不足。而发酵温度过高时，也不利于酵母的生长繁殖以及代谢，生成的酒精含量不足，还会导致酒体成分的挥发和损失，风味口感欠佳。因此，选择最适发酵温度为22 ℃。
图3 发酵温度对枸杞果酒酒精度和感官评分的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcohol content and sensory score of wolfberry fruit wine
2.1.4 初始pH值对枸杞果酒酒精度和感官评分的影响
酵母菌在不同的初始pH值条件下，其酶促反应速率和对营养物质的吸收及菌体代谢能力是不一样的，因此发酵产生酒精的能力也会改变[17]。初始pH值对枸杞果酒的影响如图4所示，随着初始pH值在4.0～6.0范围内的增加，酒精度和感官评分先上升后下降。当初始pH值为4.0～5.0时，酒精度和感官评分随之提高；当初始pH值为5.0时，酒精度和感官评分达到最大值，分别为12.22%vol，91分；当初始pH值＞5.0之后，酒精度和感官评分随之下降。初始pH值＜5.0时，酵母菌繁殖速率和活性都会降低，产生的酒精就会减少，导致酒体寡淡，口感不足。而发酵液中初始pH值＞5.0之后，酵母菌代谢过于旺盛，生长繁殖速率加快，发酵液中的大量糖分被消耗，最后生成的酒精含量不足，影响口感[18]。因此，选择最适初始pH值为5.0。
图4 初始pH值对枸杞果酒酒精度和感官评分的影响
Fig.4 Effect of initial pH on alcohol content and sensory score of wolfberry fruit wine
2.2 发酵工艺优化响应面试验
2.2.1 响应面试验结果及方差分析
基于以上单因素试验结果，选取初始糖度（A）、酵母接种量（B）、发酵温度（C）和初始pH值（D）的优选水平进行Box-Behnken试验设计与响应面分析，以感官评分（Y）作为响应值，运用多元二次回归方程模拟最佳发酵工艺参数[19-20]，Box-Behnken试验设计及结果见表3，回归模型方差分析结果见表4。
表3 Box-Behnken试验设计及结果
Table 3 Design and results of Box-Behnken tests
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of the regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
将表3的数据运用Design-Expert 8.0.6软件进行拟合分析，得到各个单因素与响应值感官评分（Y）之间的二次回归方程：
由表4可知，感官评分（Y）回归模型极显著（P＜0.000 1），失拟性检验结果不显著（P值=0.050 3＞0.05）。此外，决定系数R2=0.932 1，调整决定系数R2adj=0.864 2，说明通过此试验模拟得到的二次回归方程拟合程度高，误差小，能比较准确地预测和分析结果[21]。表4显著性检验结果显示，模型中一次项A、C和二次项A2、B2、C2、D2对感官评分的影响均极显著（P＜0.01），交互项AB、AC、BC影响显著（P＜0.05）。由表4中各因素F值可知，影响感官评分的4个因素顺序为：初始糖度（A）＞发酵温度（C）＞初始pH值（D）＞酵母接种量（B）。
2.2.2 响应面交互作用分析
响应面是对二元回归方程中各影响因素立体三维的形象描绘，响应面的倾斜角度越大、等高线排列越密集，说明两个因素之间的交互作用越显著[22-23]。
由图5可知，随着初始糖度（A）、酵母接种量（B）和发酵温度（C）之间交互变化时，感官评分呈现出相应的变化趋势。此外，初始糖度和酵母接种量之间、初始糖度和发酵温度以及发酵温度和酵母接种量之间的响应面结果显示有倾斜度，等高线排列较密集，说明每两组参数之间的交互作用对感官评分有影响，而且交互作用大小排序为AC＞BC＞AB。这说明初始糖度和发酵温度的交互作用对枸杞果酒的感官影响最为显著，初始糖度和酵母接种量的交互作用对枸杞果酒的感官影响相对较弱
图5 初始糖度、酵母接种量、发酵温度交互作用对枸杞果酒感官评分影响的响应曲面及等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between initial sugar content,yeast inoculum and fermentation temperature on sensory score of wolfberry fruit wine
2.3 发酵工艺参数优化和验证试验
由Box-Behnken试验设计结果可知，枸杞果酒发酵最佳工艺参数为初始糖度27.39°Bx，酵母接种量0.19%，发酵温度22.47 ℃，初始pH值4.97。在此条件下，感官评分理论值为92.14分。根据响应面优化结果，结合实际情况，将枸杞果酒发酵工艺调整为初始糖度27°Bx，酵母菌接种量0.20%，发酵温度22 ℃，初始pH值5.0。根据各因素优选结果进行3组平行验证试验，在此优化条件下，酿造的枸杞果酒酒精度为（12.24±0.43）%vol，感官评分实际值为（91.80±0.63）分，与预测结果接近，说明该试验回归模型预测结果准确可靠。
2.4 枸杞果酒指标检测结果
2.4.1 营养成分指标
枸杞果酒营养成分检测结果见表5。由表5可知，还原糖含量为（1.31±0.14）g/100 mL，总糖为（2.27±0.16）g/100 mL，蛋白质为（0.62±0.04）g/100 mL，脂肪含量较低，仅为（0.10±0.01）g/100 mL。
表5 枸杞果酒营养成分
Table 5 Nutritional ingredients of wolfberry fruit wine
2.4.2 功能成分指标
枸杞果酒功能成分检测结果见表6。
表6 枸杞果酒功能成分
Table 6 Functional ingredients of wolfberry fruit wine
由表6可知，该枸杞果酒含有丰富的功能成分，如总多酚、总黄酮、多糖和甜菜碱。其中多糖含量最高，可达到（7.17±0.01）mg/mL；总多酚含量为（1.88±0.06）mg GAE/mL；总黄酮含量为（1.63±0.03）mg RE/mL；甜菜碱含量为（2.55±0.04）mg/mL。此外，据先前文献报道[24]，葡萄酒中的多糖含量范围为0.282～1.600 mg/mL，与葡萄酒相比，该枸杞酒的多糖含量更高，是其4.5～25.4倍。这些活性功能成分具有抗自由基和抗氧化，提高机体免疫机能，促进机体健康等功效，这为枸杞果酒良好的保健功能和开发前景提供了数据支撑。
2.4.3 微生物指标
菌落总数≤50 CFU/mL，大肠菌群≤3 MPN/100 mL，致病菌：未检出，各项微生物指标均符合相关国家标准[25]。
2.4.4 枸杞果酒中氨基酸含量
由表7可知，在枸杞果酒样中共检测到14种氨基酸，总含量高达（588.12±10.23）mg/100mL。其中6种必需氨基酸，即苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸，占总氨基酸含量的26.87%。与李沁娅等[26]测定的11种保健酒必需氨基酸种类6种、总氨基酸含量3.21～179.91mg/100 mL，唐柯等[27]测定的47款中国产地葡萄酒中氨基酸含量44.71～135.91 mg/100 mL，沈颖等[28]测定的不同发酵温度下的荔枝酒氨基酸含量为34.10～41.21 mg/100 mL等相比，该枸杞果酒氨基酸含量更高。
表7 枸杞果酒中氨基酸种类及含量
Table 7 Types and contents of amino acids in wolfberry fruit wine
注：“*”表示必需氨基酸。
3 结论
枸杞果酒最佳发酵工艺条件为初始糖度27°Bx、酵母菌接种量0.20%、发酵温度22 ℃、初始pH值5.0。在此优化条件下，枸杞果酒感官评分为91.80分，表现出均匀的橙红色，酒香优雅，酒体协调，具有枸杞典型风味。表明该模型拟合程度良好，能用此模型对枸杞果酒感官评分进行分析和预测。枸杞果酒的酒精度为12.24%vol，枸杞果酒中的营养成分中总糖、蛋白质、氨基酸的含量分别为（2.27±0.16）g/100 mL、（0.62±0.04）g/100 mL、（588.12±10.23）mg/100 mL；功能成分中总多酚、总黄酮、多糖和甜菜碱的含量分别为（1.88±0.06）mgGAE/mL、（1.63±0.03）mgRE/mL、（7.17±0.01）mg/mL和（2.55±0.04）mg/mL。本试验优化的枸杞果酒发酵工艺参数具有一定的实用价值，既能保留果酒风味，又能提高功能成分含量，可为枸杞果酒的进一步研究提供理论依据。
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