羧肽酶（carboxypeptidases，CPs）是指能专一催化水解多肽链羧基末端氨基酸的一类外肽酶，是一种具有重要应用潜力的工业酶制剂。羧肽酶的应用主要涉及到生物、化学、医学等多个学科领域。在食品和饲料工业，可用于制备高F值寡肽[3]，去除赭曲霉素[4]，多肽脱苦、生物活性多肽的延长或特异性修饰[5]；在生物学领域，可用于多肽的合成[6]及多肽氨基酸序列测定[7]；在医学用途方面，通过体内羧肽酶的检测达到诊断和治疗疾病的目的[8-9]。近几年，羧肽酶的新功能和新用途不断被发现和拓展，使得羧肽酶具有更高的研究价值和更广阔的应用前景。
目前，羧肽酶酶制剂商品供应主要来源于猪胰腺，但价格昂贵[10-11]。因此，利用微生物获得大量的羧肽酶，具有重要的现实意义[12-13]。黑曲霉（Aspergillus niger）是国际上公认的安全发酵微生物，且适合采用固态发酵的方式[14]，而黑曲霉生产羧肽酶发酵工艺条件鲜见报道[15]。本研究是在前期筛选分离纯化获得的羧肽酶活力较高的黑曲霉（Aspergillus niger）H1-6的基础上，利用固态发酵技术，优化其产酶发酵工艺参数，并考察发酵粗酶液在酱油酿造发酵中的应用效果，为实现羧肽酶的规模化生产、降低成本来满足商业化的需要，对推动我国相关产业发展具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
黑曲霉（Aspergillus niger）H1-6：本实验室筛选获得，马铃薯培养基斜面保藏于4 ℃冰箱。
1.1.2 化学试剂
碳源（麸皮、玉米芯粉、甘蔗渣、米糠）、氮源（豆粕、花生粕、菜籽油饼、玉米粉）：市售；羧肽酶底物（N-苄氧羰酰基-L-苯丙氨酰-L-亮氨酸（N-carbobenzyloxy-L-phenylalanyl-L-leucine，N-CBZ-Phe-Leu））：美国Sigma-Aldrich公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基
斜面培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基，称取PDA培养基干粉39 g，加入蒸馏水或去离子水1 000 mL，搅拌加热煮沸至完全溶解，121 ℃高压灭菌15 min。
固体发酵培养基：称取一定量的碳源、氮源和无机盐，加水，121 ℃高压灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-ZFD型双人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司；DHP-9162型电热恒温培养箱：上海博迅实业有限公司；722N型可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌株的活化
将黑曲霉菌株H1-6接种于PDA培养基进行活化，30 ℃培养3～4 d，待长满孢子后备用。
1.3.2 单孢子悬液的制备
取培养好的PDA斜面，加入无菌生理盐水，用接种环刮下黑曲霉菌株H1-6孢子后转移至装有玻璃珠的无菌锥形瓶中，充分摇动使孢子散开，将孢子浓度调整到1×108CFU/mL，备用[16]。
1.3.3 固态发酵培养
500 mL三角瓶装100 g固态发酵培养基，固态培养基的具体配方根据单因素试验和响应面分析试验设计，通过添加1 mol/L HCl或NaOH水溶液来调节培养基的初始pH值，然后121 ℃高压灭菌20 min，待培养基冷却到室温（20～25）℃，按培养基质量的比例接种孢子悬液（1×108CFU/mL），在32 ℃条件下，恒温培养3 d后获得成曲，培养期每天翻曲2次。试验平行3次[17]，结果取平均值。
1.3.4 粗酶液的制备
参考文献[16]，并略作修改。分别称取10 g成曲，研磨后加入100 mL无菌水，40 ℃浸提1 h，期间搅拌2～3次。用中速定性滤纸过滤，滤液即为粗酶液。同时测定曲料水分，酶活力用曲料干基质量表示，即mU/g[18]。
1.3.5 羧肽酶活力的测定方法
采用镉-茚三酮法测定羧肽酶的活力[19]。羧肽酶酶活定义：在30 ℃，pH 3.7的条件下，每秒钟产生1 mmol的酪氨酸所需的酶量为一个酶活单位（mU）。
1.3.6 羧肽酶粗酶液在酱油酿造中的应用
结合固态发酵培养条件试验结果，添加0～2.5 U/kg成曲羧肽酶，采用高盐稀态发酵法酿造酱油，在成曲加18%盐水前，先将羧肽酶粗酶液溶解到盐水中，发酵后压榨出油检测氨基态氮含量[20]。
1.3.7 产酶条件优化单因素试验
按100 g固体发酵培养基，分别称取45%碳源（麸皮、玉米芯、米糠及甘蔗渣），45%氮源（豆粕、花生粕、玉米粉及油菜籽粉），10%无机盐（K2PO3、MgSO4、MnSO4·H2O、FeCl3·H2O和CaCl2），分别按40%、45%、50%、55%和60%加入蒸馏水，置于500 mL三角瓶，调节培养基的初始pH值分别至5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却，按培养基质量的比例接种黑曲霉菌株H1-6孢子悬液（1×108 CFU/mL）0.5%、1.0%、1.5%和2.0%，在32 ℃条件下，恒温培养3 d获得成曲，成曲按照方法1.3.4提取粗酶液并按照1.3.5方法测定羧肽酶活力。所有的试验平行3次[17]，结果取平均值。
1.3.8 产酶条件优化响应面试验
（1）Plackett-Burman（PB）试验设计
在单因素试验结果的基础上，以羧肽酶酶活为响应值，利用PB试验分析麸皮添加量（X1）、豆粕添加量（X2）、NaCl添加量（X3）、初始pH值（X4）、水分含量（X5）、接种量（X6）等6个因素，每个因素取2个水平，PB试验设计因素与水平见表1。
表1 Plackett-Burman试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman tests design
（2）最陡爬坡试验
依据PB试验结果，以各个显著影响因素效应的大小设定变化步长；依据变化的梯度方向确定爬坡方向，快速逼近最佳值区域；确定主要影响因素为麸皮添加量、水分含量和接种量，将此3个因素进行最陡爬坡试验。
（3）Box-Behnken 试验设计
根据Box-Behnken 试验设计原理（中心组合试验设计原理），进行3因素3水平15个试验组的响应面试验，分析每个因素主效应与交互效应，绘制响应曲面，求出最佳值，获得最佳产酶条件。以羧肽酶酶活力（Y）为响应值，优化麸皮添加量（A）、水分含量（B）和接种量（C），Box-Behnken试验设计因素与水平见表2。
表2 Box-Benhnken试验设计因素及水平
Table 2 Factors and levels of Box-Benhnken tests design
1.3.9 数据处理
所有试验结果以“平均值±标准偏差”形式表示。利用SPSS 22.0软件进行方差分析（analysis of variance，ANONA）检验，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。采用Design-Expert 8.0.7软件进行响应面试验数据分析[21]。
2 结果与分析
2.1 产酶条件优化单因素试验
由表3可知，当碳源为麸皮时，羧肽酶的固态发酵酶活力最高（640±32）mU/g，其他依次为玉米芯粉、米糠和甘蔗渣；当氮源为豆粕时，羧肽酶的酶活力最高（703±11）mU/g，其他依次为花生粕、玉米粉和菜籽油饼；无机盐中的NaCl对羧肽酶的固态发酵酶活力有正相关性，其他的K2PO3、MgSO4、MnSO4·H2O、FeCl3·H2O和CaCl2则没有影响；黑曲霉接种量为1.0%时，羧肽酶的固态发酵酶活力达到最高（746±22）mU/g；初始pH值为6.5时，羧肽酶的固态发酵酶活力最高（773±16）mU/g；水分含量为55%时，羧肽酶的固态发酵酶活力最高（826±23）mU/g。
表3 产酶条件优化单因素试验结果
Table 3 Results of single factor tests for optimization of enzymeproduction conditions
因此，选用麸皮为碳源，添加量为45%；豆粕为氮源，添加量为45%；氯化钠为无机盐，添加量为10%，并调节初始pH值为6.5、黑曲霉H1-6接种量为1.0%，水分含量为55%。
2.2 Plackett-Burman试验设计及结果
在上述单因素试验结果的基础上，以羧肽酶酶活为响应值，利用Plackett-Burman试验设计分析麸皮添加量（X1）、豆粕添加量（X2）、NaCl添加量（X3）、初始pH值（X4）、水分含量（X5）、接种量（X6）等6个因素的显著性，每个因素取2个水平，每个试验重复3次。为了估计试验误差，另设3个虚拟变量。PB试验设计及结果见表4，方差分析见表5。
表4 Plackett-Burman 试验设计及结果
Table 4 Design and results of Plackett-Burman tests
表5 Plackett-Burman试验结果方差分析
Table 5 Variance analysis of Plackett-Burman tests results
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
由表5可知，此模型P=0.020 7＜0.05，说明回归方程显著；该模型的决定系数R2为0.9015，调整决定系数R2为0.7833，表明多项式模型拟合较好。影响黑曲霉H1-6固态发酵产羧肽酶的显著因素分别是麸皮添加量X1（P=0.021 5）、水分含量X5（P=0.008 5）和接种量X6（P=0.013 0），P值均＜0.05，可以作为进一步优化的因素，其他因素对结果影响不大，在下一步研究中，取中间值。因此，选用麸皮添加量、水分含量以及黑曲霉H1-6接种量作为最陡爬坡试验因素。
2.3 最陡爬坡试验结果
根据Plackett-Burman试验结果确定的3个主要显著因素，其中麸皮添加量（A）对酶活力表现为正效应，水分含量（B）和黑曲霉H1-6接种量（C）对酶活力表现为负效应，根据这3个显著影响因素效应的大小确定试验的爬坡方向和变化步长，以最快的速度逼近最大响应值（酶活力）的区域[22]。其余因素则依据效应关系，分别选择对应的水平[23]。最陡爬坡试验设计与结果见表6。
表6 最陡爬坡试验设计和结果
Table 6 Design and results of the steepest ascent tests
由表6可知，随着3个主要影响因素含量的变化，羧肽酶活力呈现先升高后降低，羧肽酶活力在试验第5组的条件下，羧肽酶活力最高（867±12）mU/g。因此，选择试验第5组的条件作为响应面设计因素水平的中心点，即麸皮添加量（A）、水分含量（B）和接种量（C）分别为40%、55%和1.2%。
2.4 响应面法优化试验结果
根据Box-Behnken 试验设计原理（中心组合试验设计原理），设计3因素5水平共20个试验点的响应面分析试验，其中有14个析因点，6个零点重复，以羧肽酶酶活力（Y）为响应值，以估计试验误差，分析黑曲霉H1-6固态发酵羧肽酶活力的最佳条件。Box-Behnken试验设计与结果见表7，方差分析结果见表8。
表7 Box-Behnken试验设计与结果
Table 7 Design and results of Box-Behnken tests
续表
表8 回归模型的方差分析
Table 8 Variance analysis of regression model
以羧肽酶活力为响应值，运用Design-Expert 8.0.7软件进行回归拟合，得到酶活力（Y）与麸皮含量（A）、含水量（B）与接种量（C）的二次多项回归方程：
由表7可以看出，在α=0.01水平时，H1-6菌株产羧肽酶响应面试验模型回归极显著（P＜0.000 1），并且失拟项不显著（P=0.285 0＞0.05），表明该方程对试验数据拟合良好。该模型决定系数R2=0.968 4，说明96.84%的试验数据可用该模型解释，调整决定系数R2Adj=0.939 9，证明该模型可以很好的拟合试验数据。根据各因素P值大小，一次项A、B、C，二次项A2、B2、C2对羧肽酶活力影响极显著（P＜0.01）。
根据Box-Behnken试验结果，应用Design-Expert 8.0.7软件对数据进行分析拟合，得到各因素交互作用对羧肽酶活力影响的响应面及等高线见图1。由图1可知，麸皮添加量（A）、水分含量（B）和接种量（C）3个因素之间互有交互作用，但对结果均无显著影响（P＞0.05）。
图1 麸皮添加量、含水量及接种量对黑曲霉H1-6固态发酵产羧肽酶活力的响应面及等高线
Fig.1 Response surface polts and contour lines for effects of interaction between bran addition,moisture and inoculum on carboxypeptidase activity produced by Aspergillus niger H1-6 with solid-state fermentation
2.5 响应面验证试验
为了验证该模型预测的可靠性与准确性，通过单因素试验与响应面试验最优产酶条件为：得到A=-0.769、B=0.318、C=0.331，即麸皮添加量为36.16%，水分含量为56.59%，接种量为1.27%。此条件下模型预测的羧肽酶活力理论值为950.39 mU/g。考虑到实际操作的便利性，将最优产酶条件修正为：麸皮添加量为36%，含水量为56.6%，接种量为1.3%（即1.3×106 CFU/g）。在此优化条件下，制曲培养3 d，测定成曲中羧肽酶活力，3次平行试验羧肽酶活力实际值为938.33 mU/g，与预测值接近，说明实验值与预测值有较好的拟合性，所得产酶条件可以用于指导实际发酵。
2.6 羧肽酶在酱油酿造中的添加量试验
氨基酸态氮含量指的是以氨基酸形式存在的氮元素的含量，酱油中的香味就是各种氨基酸的自然效果，该指标越高，说明酱油中氨基酸含量越高，鲜味越好[24]。已经证实羧肽酶能够水解多肽和蛋白质C端的氨基酸，应用于氨基酸生产以及食品工业中的脱苦和风味提升等方面[25]。因此，将不同添加量的羧肽酶添加到发酵酱醪中，然后进行发酵、压榨出油检测，不同羧肽酶添加量对酱油中氨基态氮含量的影响结果见图2。
图2 不同羧肽酶添加量对酱油中氨基酸态氮含量的影响
Fig.2 Effect of different carboxypeptidase addition on amino nitrogen contents in soy sauce
由图2可知，与对照样品相比较，添加0～2.5 U/kg成曲的羧肽酶粗酶液后氨基态氮都有所提高，这可能是添加羧肽酶后，酱醪中更多的多肽被水解成氨基酸。此外，随着羧肽酶添加量的增加，氨基态氮含量显著增加，但羧肽酶添加量到一定程度（1.5 U/kg成曲），氨基态氮含量增加不显著。因此建议羧肽酶的添加量控制在1.5 U/kg成曲。
3 结论
本研究考察了不同碳源、氮源、初始pH值、多种无机盐、水分含量及接种量对黑曲霉H1-6固态发酵产羧肽酶的影响。在单因素试验及Plackett-Burman试验的基础上，采用中心组合响应面法对产酶条件进行优化，并建立了酶活力与麸皮、水分含量及接种量之间的二次多项回归模型，得出最优发酵条件为：麸皮添加量36%，豆粕添加量50%、NaCl添加量10%、初始pH值为6.0、含水量56.6%，接种量为1.3%（即1.3×106 CFU/g）。在此优化条件下，羧肽酶的酶活力达到938.33 mU/g。在最优发酵条件下获得的发酵羧肽酶粗酶液添加到酱油酿造中，能有效提高酱油中氨基态氮的含量，进而提高其鲜味，并且最佳添加量为1.5 U/kg成曲。该研究结果为羧肽酶生产应用的研究提供实验基础。下一步研究将继续在合适的生物反应器进行放大试验生产，以促进羧肽酶固态发酵生产实现工业化。
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