发酵豆制品是以大豆为主要原料，经微生物发酵，再经调配而制成的一类大豆食品[1]。腐乳、豆豉、豆酱和酱油历史悠久，被列为我国四大传统发酵豆制品，深受广大消费者的喜爱[2]。近年来，发酵豆制品因其具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、降血压、降血脂等生理功能而备受瞩目[3-5]。在实际生产中，成熟的腐乳、豆豉和豆酱产品经常会出现白点，严重影响成品的外观和质量，而有白点的产品会极大降低消费者的购买欲，消费者往往会拒绝购买有白点的产品，因而给企业造成很大的经济损失[6]。有许多学者针对发酵豆制品中白点问题做了大量研究并取得一定进展，本文从前发酵工艺和后发酵工艺着手，对发酵豆制品中白点防治的方法做了一些综述和探讨，旨在促进深入解决发酵豆制品中的白点问题，并为发酵豆制品的广泛应用及深度开发提供参考。
发酵豆制品中的白点是指在腐乳、豆酱、豆豉等豆制产品成熟后，其表面出现直径为1 mm左右的乳白色硬圆粒状小点或白斑，也有部分会悬浮在酱料汁液中或沉积于容器底部[7]。最初有人推测这些白点可能是草酸钙结晶或是酪氨酸的金属盐，后经一系列研究表明白点是以酪氨酸为主的过饱和氨基酸结晶。如今有研究进一步发现，白点主要是由游离酪氨酸、游离苯丙氨酸以及富含酪氨酸和苯丙氨酸的短肽组成[8]。豆制品在前发酵过程中，接种的毛霉和米曲霉产生蛋白酶，水解蛋白质生成各种游离氨基酸和短肽，从而形成发酵豆制品独特的风味。蛋白水解主要分为两步，首先以内肽酶为主从肽链内部切断肽键将大豆蛋白分解成可溶性短肽，其中包括以酪氨酸为末端的肽链，然后在外切蛋白酶（主要是羧肽酶）水解下形成游离氨基酸[9]。有研究表明[10-12]，毛霉蛋白酶在降解大豆分离蛋白时，由于其酶切位点特性，更倾向于将酪氨酸水解到可溶性肽中，还发现大豆蛋白的苦味与短肽链末端的酪氨酸和苯丙氨酸的数量有关，而羧肽酶能对其水解并有脱苦作用，这些结果表明，大豆蛋白在内外肽酶的共同作用下会优先释放出酪氨酸。此外，制曲时间越长，羧肽酶聚集越多，且后期加入的食盐作为电解质能促进蛋白酶的释放，从而产生过量酪氨酸。酪氨酸溶解度很低，在水中仅为450 mg/L（20 ℃），很容易析出结晶，腐乳中酪氨酸含量超过2 mg/g便会形成白点[13]。白点最初是以微小晶核的形式出现，随着溶液中酪氨酸浓度增大，晶核逐渐变大直至形成白点[14]。
外观上，白点的存在引起消费者对产品安全性的质疑；口感上，酪氨酸和苯丙氨酸作为白点的主要成分会带来苦味和颗粒感，最终影响产品的生产和销售[15]。控制白点本质上是减少酪氨酸的生成，或增加酪氨酸的溶解度。基于此，从发酵工艺条件和原料等方面着手，展开了很多防治白点的研究。
2.1.1 培菌条件
有研究结果表明[16-17]，白点的形成与毛霉的培养条件密切相关，通过控制前期发酵时间、发酵温度、pH值及相对湿度等因素，选择适宜毛霉的生长条件能有效抑制白点的生成，其原理主要是通过限制酶的活性来减少酪氨酸生成。培菌温度过低，不利于菌丝生长，进而阻碍蛋白酶的合成；培菌温度过高，菌丝生长太快则水分流失也越快，易促使蛋白酶的衰退老化[18]。培菌时间过长，蛋白酶系积累越多，酶活也越高，大豆蛋白消化程度越大，最终导致酪氨酸的析出量越大，白点出现的越快，且产品最终的形态很难稳定，极容易被破坏；培菌时间太短，儿茶酚氧化酶和蛋白酶系活力不高，虽能降低白点率，但会直接影响到产品最终的质量，色泽芳香和滋味达不到要求[19]。此外，培菌房的相对湿度、培菌时的pH值等都会影响蛋白酶活性[20]。
有研究发现，腐乳前期发酵时温度控制在26～28 ℃，室内相对湿度90%以上，前酵时间控制在45 h左右，成品白点率比常规条件生产腐乳的白点率降低94%[16]。氨基酸态氮是判断发酵是否成熟的重要指标，闵世豪等[8]通过模拟豆酱发酵中酪氨酸及氨基酸态氮的含量变化发现，豆酱模拟发酵体系中酪氨酸的积累与蛋白分解程度密切相关，温度是影响酪氨酸含量及蛋白分解程度最重要的因素，在30 ℃、100 g/L盐含量条件下进行发酵，可以保证较高的蛋白质分解程度，并减少了发酵产品中的酪氨酸含量。因此，找到培菌条件的最适平衡值对后续产品中白点的防治至关重要。
2.1.2 菌种选育
选育优良菌株可以提高目标产物的产量和品质，在一定程度上改变产品组分，优化工艺条件，开发出更具特色的产品[21-22]。在发酵豆制品中通常选用菌种驯化来优化菌株，驯化一般是指通过人工措施使微生物逐步适应某一条件，从而实现定向选育微生物的一种方法[23]。通过驯化可以获得具有较高耐受力及活动能力的菌株，其原理主要是通过激活或抑制微生物中某种酶的活性，从而达到控制该酶产代谢产物速率的目的，当向培养基中加入益于微生物生长的营养物质时，微生物生长旺盛，酶的代谢速率相应加快；当向培养基中加入某种酶的代谢产物时，依据酶生物合成产物的阻遏机理，该酶的活性受到抑制，其代谢速率相应降低[23]。基于此，可在培养基中加入一定的酪氨酸以抑制肽酰酪氨酸水解酶的活性，进而降低其产酪氨酸的能力，当菌株长期处于酪氨酸的生长环境时，逐渐淘汰不适应的菌株，适者通过表型适应逐渐演变成进化性适应，逐代升级，最终得到低肽酰酪氨酸水解酶活的菌株，达到驯化目的[24]。
林影等[13]通过对沪酿3.042米曲霉进行驯化，发现经16代驯化的米曲霉菌株制得的豆豉，其酪氨酸含量大大减少而总氨基酸量基本不变，抑制白点生成的同时提高了产品鲜味；而在研究蚕豆酱时，查文龙等[25-26]也对3.042米曲霉进行驯化，前者发现经15代驯化的菌株生产的蚕豆辣酱，5个月发酵后基本上没有出现白点；后者则是筛选出了能稳定产生少量中性蛋白酶和酸性蛋白酶的米曲霉菌株，能有效避免豆酱中产生酪氨酸结晶，保证了产品品质。郑立红等[27]对日本豆酱专用曲进行分离纯化，选育出一株性能良好的米曲霉（编号FNR-01），能有效控制白点生成。江景泉[24]对五通桥毛霉（Mucor wutungkiao）和雅致放射毛霉（Actinomucor elegans）进行驯化，发现五通桥毛霉驯化至15代时的相对蛋白酶活力下降到89.49%，对酪蛋白的水解率下降到74.91%；雅致放射毛霉驯化至13代时的相对蛋白酶活力下降到90.24%，对酪蛋白的水解率下降到72.23%，同时观察发现，腐乳在180 d货架期内，驯化菌种发酵样的白点率远低于普通对照样。因为发酵过程需要一定的蛋白酶活力，若蛋白酶活力太低，则蛋白分解缓慢，从而延长了发酵周期，因而，对菌株进行15代左右的驯化能有效减少酪氨酸的生成[28]。
2.2.1 含盐量及酒精度
豆制品在后酵工艺中大都会进行腌制，加盐可以析出水分，并且在后续制作过程中不会使产品过早酥烂。不仅如此，高浓度盐还抑制了大部分微生物的生长，避免产品腐败变质，同时也大大降低了产酪氨酸、苯丙氨酸的蛋白酶活，因而适当提高盐浓度可以抑制白点的生成[28]。何熙[29]在研究腐乳时发现减小腌制时的用盐量以及减小泡乳盐水浓度都会增加腐乳白点率，可能是在相对较低的盐浓度下，产酪氨酸的酶系活性较高，促进了酪氨酸的生成，进而增加了白点率。雷宏杰[28]研究证实，盐水浓度为21%的豆酱发酵中，酪氨酸和苯丙氨酸含量相比正常发酵（盐水浓度18%），分别降低了约26%和20%。
在腐乳的加工过程中，后酵汤料对腐乳的品质和安全起到了重要的作用，其中的乙醇既能增进产品的风味，又可以和盐协同作用防止腐败变质，同时也在一定程度上抑制了羧肽酶活性，水溶性蛋白质的降解受到限制[30-31]。哈尔乐哈西·布勒斯别克等[32]制作了不同酒精度数的腐乳，后期发酵六个月，随着发酵时间的延长，腐乳中白点数量逐渐增多，酒精度为18%vol和12%vol的腐乳先出现白点，而酒精度为13%vol的腐乳白点出现时间最晩，可能是当酒精度处在一个合适的范围内时可以有效减缓白点生成的速度。朱洪康[17]研究了含盐量及酒精度对腐乳汤汁中毛霉羧肽酶活性的影响，当酒精含量＜5%时，羧肽酶酶活基本不变，＞6%时酶活会逐渐降低；盐浓度介于7.0%～7.5%间酶活略有升高，超过7.5%时酶活则逐渐下降。由此可见，合理调控后酵条件中的含盐量及酒精度，可以有效减少白点生成。
2.2.2 调酸发酵
酪氨酸等电点为5.66，在pH＜5.66的溶液中，酸性条件降低了蛋白酶的活力，从而抑制酪氨酸的产生[17]。CHIOU R Y Y等[33]研究了几种微生物生长抑制剂对白点形成的影响，以米曲和米-豆曲作为酶源制作腐乳，并分别加入微生物生长抑制剂对羟基苯甲酸酯、磺胺、四环素、氯霉素和冰醋酸，发酵一年后，发现以米曲作酶源的产品中未出现白点，以米-豆曲作为酶源并在盐溶液中加入10 mL/L冰醋酸的产品也未出现白点。成分分析结果表明，米曲为酶源的腐乳盐溶液的pH、酪氨酸含量以及氨态氮总量均低于米-豆曲为酶源的腐乳盐溶液。由此推论，酸性条件可抑制腐乳白点的形成。
2.2.3 添加剂
凡是溶于水能够显著降低水的表面能的物质称为表面活性剂，由于表面活性剂分子一端为亲水的极性基团，另一端为亲油的非极性基团，具有独特的两亲性，因而在溶液体系中加入表面活性剂能降低表面张力并增强界面的增溶作用[34]。由于一般氨基酸尤其是酪氨酸在常温下溶解度很小，更容易析出，表面活性剂的添加使其不易集结，更多的分散或溶解于溶液中，从而达到减少白点生成的目的[35]。李国基等[36]在研制豆豉酱料时加入0.2%的三种表面活性剂苯乙烯化苯酚（styrenated phenol，SP）、淀粉脂肪酸酯（fatty acid ester of starch，SFE）和蔗糖脂肪酸酯（sucrose esters，SE），观察成熟产品，发现表面白点已明显减少或不再出现，其效果：SFE＞SP＞SE。朱洪康[17]在成熟腐乳汤汁中加入适量的吐温-80，结果发现添加吐温-80的腐乳中的白点比没有添加的减少了50%，这说明表面活性剂能显著改善溶液性质，增加酪氨酸溶解度，降低白点生成率。
雷宏杰[28]研究了抑菌剂对氨基酸含量的影响，在豆酱中分别加入定量的山梨酸钾、苯甲酸钠和冰乙酸，结果发现成品酱中酪氨酸含量、苯丙氨酸、呈味氨基酸的含量均有明显降低，其中冰乙酸降低酪氨酸含量的效果比山梨酸钾和苯甲酸钠更好。因此在豆酱发酵过程中，可以考虑加入适量冰乙酸来抑制微生物的生长，降低酪氨酸的含量。
YANG J等[37]研究表明，在含有白点的腐乳中加入淀粉液化芽孢杆菌的谷氨酰胺酶，谷氨酰胺为供体，白点中的酪氨酸和苯丙氨酸作为受体，在谷氨酰胺酶催化下合成了两种含γ-谷氨酰肽的受体氨基酸。该研究发现，腐乳中60.57%的白点转化为γ-谷氨酰肽，其中酪氨酸和苯丙氨酸的消耗分别为68.5%和70.89%；并且由于合成物中短链γ-谷氨酰肽的存在，产品风味得以提高。这种方法为解决腐乳中白点问题提供了一种新的途径。此外，哈尔乐哈西·布勒斯别克等[32]发现在腐乳后酵中加入大豆异黄酮抗氧化剂也能抑制白点的产生，其原理还有待进一步研究。
2.2.4 热处理
毛霉蛋白酶的化学本质是蛋白质，由于蛋白质的不可逆性，有些腐乳研究利用高温加热钝化酶的活性，甚至使酶完全失活，降低蛋白质过度水解成小分子肽的可能。酶的底物减少，从而游离酪氨酸生成量降低。江景泉[24]将准备后酵的腐乳揭盖后加热蒸煮，再重新密封贮存2个月后观察发现，蒸煮5 min或以上时间的腐乳几乎没有白点产生，但腐乳也失去了特有风味，产品质量得不到保障。朱洪康[17]将毛霉蛋白酶在80 ℃保温15 min，蛋白酶基本失活，将成熟腐乳在此条件下进行加热钝化处理，发现热处理后的腐乳白点生成率降低了8.3%。因此，对成熟腐乳进行适当的热处理，找到合适的处理条件可以降低白点生成率。
然而，传统加热耗时长，只能由外向内进行热量传输。近年来，微波技术因其时间短、效率高、操作简易等优势已广泛应用于食品加工中。其灭酶杀菌的原理，主要是利用微波的热效应、非热致死效应和电磁波的协振效应，在短时间内使酶失活，微生物则因体内活性蛋白质变性而死亡，从而达到灭酶灭菌目的[38]。江景泉[24]将成熟腐乳置于400 W功率的微波下进行不同时间段的处理，贮存2个月后分析理化指标发现，在120 s或更久微波处理后的腐乳样品中，酪氨酸、氨基酸态氮、水溶性蛋白质等含量无明显增加，说明微波能较好的抑制白点产生并改善产品外观品质。
谢显华等[39]运用基因工程手段将产白点腐乳和正常腐乳的微生物基因进行对比测序，发现了与酪氨酸结晶可能有关的微生物，初步推测腐乳中白点生成与红色链孢霉、蜡样芽胞杆菌及苏芸金芽胞杆菌的缺失有关，这为后续研究提供了方向。纪海兵等[40]从腐乳中分离鉴定出一种发酵菌株，命名为雅致放射毛霉（Actinomucor elegans）PEP001，并从该毛霉发酵液中检测到可释放多肽C末端酪氨酸的羧肽酶活性，推测是羧肽酶Y（carboxypeptidase Y，CPY）。经酶学性质分析显示，CPY在腐乳后发酵环境中有较高酶活，它可能在腐乳白点形成过程起着关键作用。通过敲除雅致放射毛霉中编码CPY的基因，研究基因敲除菌的生长代谢情况，并用该菌进行发酵生产，可能会从根本上解决白点问题。
林振佳[41]从成熟后没有产生白点的腐乳中分离出微生物进行培养，将培养好的微生物按10%接种量配制成卤水，罐装于腐乳胚瓶发酵3个月，观察发现没有白点产生，再用此无白点产生的腐乳卤汁以10%比例配制新卤水，灌装入新腐乳胚瓶后发酵3个月，发现白点出现率也只有2%。究其原因可能是腐乳卤汁中所含有的不产白点的微生物数量占优势，抑制了产白点微生物的生长繁殖，从而减少了腐乳白点生成。
传统豆酱以黄豆和面粉为主要原料，在发酵过程中产生白色颗粒状物质，这是由于制曲过程中米曲霉无法分泌足够的蛋白酶和淀粉酶，导致面粉中的蛋白质未完全分解而与酱料中的游离氨基酸聚合形成在豆酱表面和瓶壁上。耿予欢等[42]发现这种白色物质的主要成分为酪氨酸和面筋蛋白，通过增加前期翻酱次数，翻酱均匀、彻底使结团料粉分散可以有效减少白色物质生成。肖霄等[43]在研究豆酱时发现，通过常压蒸煮制曲40 h的豆酱与进行高压蒸煮制曲40 h的豆酱在发酵第5天的时候均有白点出现，但后者产白点数量相对较少。分析认为，豆酱中白点的产生与原料的蒸煮条件和制曲时间没有直接关系，但白点产生的时间和数量有所不同，可能与氨基酸分解速度有关，高压蒸煮能有效减少白点生成。
传统发酵豆制品在国内已有上千年历史，近年来随着其营养功能的不断发掘，发酵豆制品在人们膳食结构中占据愈加重要的地位。虽然丰富的氨基酸赋予了产品独特的风味和营养价值，但随之也带来了过饱和氨基酸结晶的问题，这始终制约着发酵豆制品的发展。为此，广大科研工作者做出了很多努力，如改良菌株、优化工艺等，虽然这些方法确实能有效减少白点生成，但由于错综复杂的微生物参与整个发酵过程，使得实际工作困难重重，很难追根朔源找到彻底解决白点的办法。未来对发酵豆制品的研究应侧重于应用现代分子生物学技术，通过聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳、肠杆菌基因间重复一致序列-聚合酶链反应等手段与传统培养方法相结合，全面了解白点与微生物组成的具体关系，寻找能根除白点的有效方法；其次，还可以研究白点向有益成分进行转化，开发具有特定功能、安全健康的新型食品。尽早解决白点问题，不仅能使具有民族特色的发酵食品市场前景更加广阔，还能进一步弘扬我国传统文化，为世界人民造福。
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