优良的葡萄酿酒酵母应具备起酵快，耐高酒精度、高SO2、高糖、高温、低温等特性，同时还应能促使发酵进行彻底，实现酒体协调、易于长期储存等。
葡萄酒酿造过程中，随着发酵底物中酒精、糖、硫的浓度变化，酵母菌的耐受力会影响其生长及发酵活性。酒精浓度不断增加，酵母的繁殖速度及存活率会急速下降[1]，残糖、酸将会影响酒的品质。已有研究者对外加酒精的培养基进行过酒精耐性对比试验[2-3]。研究表明，酵母细胞内细胞质组成及水分活度会随着高渗透胁迫而发生明显变化，高盐、高糖、高硫等发酵环境，常常会影响酵母菌的生长繁育[4]。因此，在葡萄浓醪发酵过程中，耐高渗酵母可以很好地应用于酿酒工业。
本实验对收集的废酒糟酵母资源[5-6]进行系统实验研究，筛选出耐高渗的酿酒酵母，应用于葡萄酒酿造，并优化发酵工艺，旨在为高酒精度、无防腐剂的葡萄酒酿造选育优良菌株提供理论依据，开辟葡萄酒研发新思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
鲜葡萄酒渣、鲜黄酒糟、鲜酒醅：某葡萄酒、黄酒、白酒生产企业提供；商业酵母BV818：安琪酵母股份有限公司。
1.1.2 主要试剂
葡萄糖、蛋白胨、琼脂、酵母膏、酵母浸粉、蔗糖、麦芽糖、乳糖、硝酸钾、硫酸铵、亚硫酸钠、酒精、氯化钠（均为分析纯或生化试剂）：甘肃省石化物资贸易公司化玻仪器设备分公司。
1.1.3 培养基
富集筛选培养基（1#培养基）：葡萄糖5%，酵母膏0.05%，KH2PO4 0.25%，FeSO4·7H2O 0.01%，MgSO4·7H2O 0.1%，（NH4）2SO4 0.2%，灭菌后加Na2SO3至30 mg/L。
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培养基[7]（2#培养基）：葡萄糖20 g、蛋白胨20 g、牛肉膏10 g、蒸馏水1 000 mL，60 μg/mL链霉素；添加20 g/L琼脂为固体培养基。
WL营养培养基（3#培养基）：酵母浸粉0.4%、胰蛋白胨0.5%、葡萄糖5%、琼脂2%；储液A：KH2PO4 5.5 g，KCl 4.25 g，CaCl2 1.25 g，MgSO4 1.25 g，定容至400 mL，使用时按40 mL/1 000 mL添加[8]；储液B：FeCl3 0.25 g，MnSO4 0.25 g，定容至100 mL，使用时按1 mL/1 000 mL添加，调pH值至6.5，灭菌后加储液C。储液C：0.44 g溴甲酚绿溶于100 mL体积分数50%的酒精溶液中，使用时按1 mL/1 000 mL添加。
发酵培养基[9]（4#培养基）：蔗糖20%，KH2PO4 0.1%，（NH4）2SO4 0.1%，MgSO4·7H2O 0.1%，酵母膏1%。
酵母氮基础培养基及酵母碳基础培养基[10]（5#培养基）：葡萄糖20.0 g，KH2PO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，酵母膏0.2 g，琼脂20.0 g，蒸馏水1 000 mL。
尿素基础培养基（6#培养基）：蛋白胨1.0 g，NaCl 5.0 g，KH2PO42.0g，酚红0.012g，琼脂20.0g，pH6.8，蒸馏水1000mL。
蛋白胨水培养基（7#培养基）：蛋白胨10 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.6。
上述培养基均115 ℃灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-1FD超净工作台：苏净安泰空气技术有限公司；AL204电子天平：德国METTLER TOLEDO公司；LDZX-75-KBS立式不锈钢压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；BK-3300生物显微镜：上海宙山精密光学仪器有限公司；600电热恒温水浴槽：北京科伟永兴仪器有限公司；FDU-1200冷冻干燥机：EYELA東京理化器械株式会社；SHP-250生化培养箱：上海森信实验仪器有限公司；RE-3000 RE-10000旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 酵母菌分离纯化
（1）样品采集：将从相关企业分别采集的鲜酒醅、酒渣、酒糟，真空密封储存于冰盒中，24 h内送至实验室，备用。
（2）菌株富集培养及分离纯化：将采集到的酒醅、酒渣、鲜酒糟样品分别称取10 g，分别加入90 mL灭菌的1#培养基，28 ℃、160 r/min摇床培养48 h。将培养液用生理盐水进行不同梯度稀释后，涂布于2#培养基上分离，28 ℃培养48 h，转接并经多次划线纯化，获得纯化菌株，接种于试管斜面，依次放入冰箱中，4 ℃保存备用。
（3）将纯化菌株活化后，划线接种于WL培养基上，28 ℃培养5～7d，观察记录菌落的颜色及形态特征，进行分类鉴定。
1.3.2 菌株发酵特性
采用杜氏管法对分离得到的酵母菌进行发酵力测定，挑选发酵速度快、起发时间早及发酵气味好的菌株。
酒精度耐受性测定：用杜氏管发酵法。将筛选出的酵母菌分别接入酒精度分别为12%vol、14%vol、16%vol、18%vol、20%vol的2#液体培养基中，28 ℃静置培养，每12 h观察一次，记录气体充满杜氏管的时间。
糖度耐受性测定：用杜氏管发酵法。将筛选出的酵母菌分别接入葡萄糖含量分别为20%、30%、40%、50%、60%的2#液体培养基中，28 ℃静置培养，每12 h观察一次，记录气体充满杜氏管的时间。
SO2浓度耐受性测定：用杜氏管发酵法。将筛选出的酵母菌分别接入SO2含量为100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L的2#液体培养基中，28 ℃静置培养，每12 h观察一次，记录气体充满杜氏管的时间。
1.3.3 菌株模拟酒精发酵试验
将筛选菌株转接入4#培养基，28 ℃静置发酵，至发酵液重量不再下降时为发酵终点。以商品酵母BV818作对照。
1.3.4 生理生化试验
碳源同化试验：将含有杜氏小管的试管灭菌后加入5#培养基3～4 mL，然后向其中半数的试管分别加入葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、乳糖作为碳源，调整糖浓度达到50mmol/L，灭菌[11]。将所有试管都接入供试菌，以没有加碳源的试管作为对照，28 ℃培养7 d，观察。如果试管出现浑浊为阳性，否则为阴性。
氮源同化试验：将含有杜氏小管的试管灭菌后加入5#培养基3～4 mL，然后向其中半数的试管分别加入硫酸铵、硝酸钾、亚硝酸钠作为氮源，调整氮源浓度达到50 mmol/L，灭菌。将所有试管都接入供试菌，以没有加氮源的试管作为对照。28 ℃恒温培养7 d，观察。以试管中出现浑浊为阳性，否则为为阴性。
水解尿素试验：试管中加入2.7 mL的6#基础培养基，灭菌后，再向每支试管中加0.3 mL无菌水配制的20%已灭菌的尿素溶液，混合后摆斜面。挑取活化的菌株，接种于制好的斜面上，28 ℃培养，每天观察结果，5～7 d后，若斜面呈现淡红色，则说明此菌株能分解尿素。试验重复3次[12]。
1.3.5 葡萄酒发酵试验[13-18]
预试验的结果显示，高泡期流加浓缩汁底物浓度外观糖偏低，以致最终发酵酒精度有所降低，因此调整葡萄酒发酵试验方案为：初始底物浓度外观糖为28%，提高高泡期补料后底物外观糖至34%；接种量为106 CFU/mL；菌株接种方式两种：（1）酿酒酵母和膜醭毕赤氏酵母以70%∶30%、50%∶50%、30%∶70%体积比同时接入浓缩葡萄汁中；（2）发酵初期接种酿酒酵母，高泡期补料后接种膜醭毕赤氏酵母。20 ℃发酵15 d。
1.3.6 测定方法[19-23]
发酵力：采用CO2失质量法；酒精度：采用密度瓶法；还原糖：采用直接滴定法；酸度：采用滴定法；香味：采用感官评定方法。
2 结果与分析
2.1 酵母菌分离纯化
由表1可知，从鲜葡萄酒糟、鲜黄酒糟、鲜酒醅共分离纯化出8株酵母菌，分别编号为A～H。
表1 酵母菌的形态特征
Table 1 Morphological characteristics of yeast
2.2 菌株发酵特性及耐受性结果分析
2.2.1 菌株发酵特性
采用杜氏管法对分离得到的8株酵母菌进行发酵力测定，结果见表2。
表2 优选菌株发酵特性试验结果
Table 2 Experimental results of fermentation characteristics of the preferred yeast strains
注：“+”表示发酵产气，“+”越多表示发酵速度越快。
由表2可知，菌株A、B、C发酵速度最快；菌株A起发时间最短，为2 h，发酵具有浓郁的酒香味。
2.2.2 优选酵母菌株的酒精、葡萄糖及SO2耐受性
由表3可知，酵母菌的生长繁殖随着酒精含量的增高而受到抑制，酒精含量越高，酵母菌的生长繁殖越弱。菌株A、B对酒精的耐受度比较好，其中菌株B耐受20%vol酒精21.3 h，仍可以启动发酵。
表3 酵母菌株酒精耐受性试验结果
Table 3 Alcohol tolerance test results of yeast
注：“+”表示杜氏小管中产气，“+”越多表示产气越多。下同。
由表4可知，菌株A、B和D对于糖具有较好的耐受性，均可在耐受60%糖浓度的情况下21.5 h后可以启动发酵。
表4 酵母菌株葡萄糖耐受性试验结果
Table 4 Glucose tolerance test results of yeast strains
由表5可知，菌株A、B、D表现出较强的SO2耐受性，均可在耐受300 mg/L SO2的情况下6.7 h后可以启动发酵。综合耐受性试验结果，选择菌株A、菌株B进行模拟酒精发酵试验。
表5 酵母菌株SO2耐受性试验结果
Table 5 Sulfur dioxide tolerance test results of yeast strains
2.3 优良菌株发酵试验结果分析
由表6可知，菌株A产酒精度为10.8%vol，高于商品酵母BV818所产酒精度（9.2%vol），且产酒香气较好，可作为优良菌株保存；菌株B产酒精度9.2%vol与商业酵母BV818所产酒精度（9.2%vol）相当，也可作为优良菌株保存。
表6 酵母菌株模拟酒精发酵试验结果
Table 6 Results of simulated alcoholic fermentation of yeast strains
2.4 生理生化鉴定
对菌株A、菌株B进行生理生化鉴定，结果见表7。由生理生化试验结果可以初步鉴定菌株A、菌株B分别为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和膜醭毕赤氏酵母（Pichia membranefaciens）。
表7 菌株生理生化鉴定结果
Table 7 Physiological and biochemical identification results of the strain
注：“+”表示反应结果呈阳性；“-”表示反应结果呈阴性。
2.5 葡萄酒发酵试验结果分析
由表8可知，在浓缩葡萄汁初始糖含量28%条件下接种菌株A，高泡期补料至含糖量34%接种菌株B，20 ℃发酵15 d，得到的葡萄酒酒精度最高，为18.1%vol。
表8 浓缩葡萄汁补料分期接入酵母菌株发酵结果
Table 8 Fermentation results of concentrated grape juice feeding by stages with yeast strains
3 结论
该实验从葡萄酒糟、黄酒糟、酒醅，经过富集筛选分离纯化得到8株酵母菌，经高酒精度、高糖度、高SO2耐受试验后初步筛选出2株菌株，一株耐高糖，在含糖量60%条件下21.5 h仍可启动发酵；一株耐高酒精度，在酒精度20%vol条件下21.3 h仍可启动发酵；2株菌株均可在300 mg/L SO2条件下在6.7 h启动发酵。经生理生化试验初步鉴定两株菌分别为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和膜醭毕赤氏酵母（Pichia membranefaciens）。在浓缩葡萄汁初始糖含量28%条件下接种酿酒酵母，高泡期补料至含糖量34%接种膜醭毕赤氏酵母，20℃发酵15d，得到的葡萄酒酒精度为18.1%vol。通过本试验为西北地区特色葡萄酒酿造提供了前瞻性的发酵菌株和工艺参数，以期为国内特色葡萄酒产业做一些探索性的研究。
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