刺梨（Rosa roxburghii）是蔷薇科多年生落叶灌木缫丝花的果实，生长在海拔500 m到2 500 m的地区，分布于陕西、甘肃及西南等地区，其中贵州所产刺梨最为出名[1]。刺梨果肉爽脆，成熟后的刺梨肉质肥厚、味酸甜。刺梨富含维生素C、超氧化歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、胡萝卜素、有机酸等十多种人体所需的微量元素[2]。此外，刺梨果实中还含有很多重要生物活性成分，目前从刺梨中分离得到的活性物质包括：原儿茶酸、刺梨酸、刺梨苷等，分别是黄酮类、有机酸、三萜类化合物[3-4]。
刺梨清甜爽口，具有独特的香气，同时还富含多种人体所需营养成分，具有延缓衰老[5]、提高机体免疫作用[6]、降血糖[7]、降血脂[8]、预防癌症[9]、解毒[10]等多种功效，因此，对刺梨进行研究与利用具有广阔的市场需求和前景。刺梨除了鲜食之外，还能晒干泡水，加工成方便食用与存放的相关产品。其中果酒不仅能够保留果实中原有的营养物质，相比蒸馏酒具有更加高的营养价值，而且具有调节人体新陈代谢、促进微循环等生理保健作用[11]。韦唯等[12-15]比较了刺梨鲜果、无籽刺梨和金刺梨不同加工方式对果酒品质及其相关成分的影响，为刺梨果果实深加工开发提供了新思路。
由于刺梨果实的收获期不足30 d，鲜果供应期短，会在一定程度上限制刺梨果酒产业的发展及市场的扩大。刺梨加工成刺梨果干后更有利于贮藏及运输。本研究探讨了初始糖含量、酵母接种量及发酵时间对刺梨果酒品质的影响，并采用响应面法优化了刺梨果酒发酵工艺，以期为刺梨果酒生产提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
刺梨果干：成都暖民投资管理有限公司；白砂糖：市售；葡萄酒活性干酵母BV818：安琪酵母股份有限公司；果胶酶（食品级，酶活力30 000 U/g）：和氏璧生物科技有限公司；纤维素酶（食品级，酶活力10 000 U/g）：南宁东恒华道生物科技有限责任公司；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
HH4电热恒温水浴锅：邦西仪器科技有限公司；BL-600电子天平：广州市正一有限公司；DHP-9172电热恒温培养箱：广州康恒仪器有限公司；6202高速粉碎机：常州澳华仪器有限公司；722可见光分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。
1.3 试验方法
1.3.1 刺梨果酒发酵工艺流程刺梨果干→粉碎→酶解→过滤→糖酸调整→接种→发酵→过滤→杀菌→果酒样品
1.3.2 主要操作要点
（1）粉碎：将刺梨果干置于高速粉碎机中粉碎，备用。
（2）酶解：向刺梨果粉中加入适量无菌水，搅拌均匀。为加入100 mg/L偏重亚硫酸钾和质量分数0.5%柠檬酸，再加入0.05%的果胶酶与0.1%纤维素酶，50 ℃酶解40 min[16-17]，过滤。
（3）糖酸调整：向果汁中加入适量白砂糖，并调整pH为4.0[18-19]。
（4）接种：称取适量的安琪活性干酵母BV818，加入10倍含4%葡萄糖的无菌水溶液中，混匀，于35 ℃保温20～30 min，期间每10 min振荡一次，至产生大量气泡即可[20]。
（6）发酵：接入适量的扩大培养后的酵母菌，盖上6层纱布于25 ℃的恒温培养箱中进行酒精发酵，待酒液上泡沫下降（约1.5 d）即可换上玻璃塞，进行发酵。
（7）杀菌：将样品置于70 ℃加热20 min[21]。
1.3.3 刺梨果酒感官评价分析
根据GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[22]中有关葡萄酒、果酒的感官评价标准以及其他研究中对刺梨果酒或其他果酒[23]的感官描述，对刺梨果酒的色泽、外观、香气、滋味及典型性各项影响的大小，从而得出刺梨果酒感官评价表如表1，满分100分。选取具有一定果酒品尝能力的10人，通过感官评价对刺梨果酒各项进行评分。
表1 刺梨果酒感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation standards of Rosa roxburghii fruit wine
续表
1.3.4 刺梨果酒酒精度的测定
根据GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》的酒精计法测定[22]。
1.3.5 刺梨果酒发酵工艺优化单因素试验
采用刺梨果粉添加量为7.5%制得刺梨果汁，分别考察不同初始糖含量（200 g/L、240 g/L、280 g/L、320 g/L、360 g/L）、酵母接种量（4%、5%、6%、7%、8%）、发酵时间（5 d、6 d、7 d、8 d、9 d）对发酵果酒感官评价及酒精度的影响。
1.3.6 刺梨果酒发酵工艺优化响应面试验
在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，设计3因素3水平响应面试验，以初始糖含量（A）、酵母添加量（B）、发酵时间（C）为评价因素，以感官评分（Y）作为响应值，通过建立回归方程预测响应值最大时确认刺梨果酒的酿造工艺，响应面试验因素与水平见表2。
表2 刺梨果酒发酵条件优化响应面试验因素及水平
Table 2 Factors and levels of response surface experiments for Rosa roxburghii fruit wine fermentation conditions optimization
1.3.7 数据处理方法
数据采用SPSS 20.0软件进行处理，响应面分析试验设计及其显著性差异分析采用Design-Expert 8.0.6软件处理。
2 结果与分析
2.1 刺梨果酒发酵条件优化单因素试验
2.1.1 初始糖含量对刺梨果酒品质的影响
如图1所示，随着初始糖含量增加，刺梨果酒逐渐澄清，酒香逐渐浓郁，口感越来越甜。从感官评价这一指标来看，初始糖含量在240 g/L时，分值达到最高。随着发酵初始糖含量增大，酒精度逐渐增大。初始糖度对刺梨果酒酒精度和感官评价影响的变化趋势同柚子果酒工艺报道类似[24]。同时，当发酵初始糖含量较高时，发酵液的渗透压增大，抑制酵母菌的生长繁殖。酵母菌的生长适应期延长时，对刺梨果酒的酒精发酵而言是不利的，酒精度难以上升。而且初始糖含量太高意味着调整糖度时所添加的白砂糖量增多，发酵后酒的果香也会受到影响，同时果酒太甜也会影响刺梨果酒的口感及风味。综上，刺梨果酒的发酵初始糖含量应该选择在240 g/L左右。
图1 初始糖含量对刺梨果酒感官评分和酒精度的影响
Fig.1 Effect of initial sugar concentration on sensory evaluation score and alcohol content of Rosa roxburghii fruit wine
2.1.2 酵母接种量对刺梨果酒品质的影响
如图2所示，酒精度总体上随着酵母接种量的增加而缓慢上升。酵母菌含量增加，其生长繁殖速度加快，无氧呼吸产物酒精增多，消耗的糖也增多。当酵母接种量过多时，发酵果汁中的酵母菌浓度高，酵母数量不断增加，酵母菌所产生的代谢废物也所增加，此时酵母活性降低，影响果酒质量。同时刺梨果酒随着酵母接种量的增加，果酒的色泽由黄棕色逐渐变浅，但沉淀及悬浮物逐渐增多，酒香虽逐渐增加，但“酵母味”也相应增加[25]，刺梨原有的果香味逐渐被掩盖。果酒口感略微下降，苦涩味变重，感官评价得分呈下降趋势。优先考虑到刺梨果酒感官评分结果，因此酵母接种量选择在4%左右。
图2 酵母接种量对刺梨果酒感官评分和酒精度的影响
Fig.2 Effect of yeast inoculum on sensory evaluation score and alcohol content of Rosa roxburghii fruit wine
2.1.3 发酵时间对刺梨果酒品质的影响
如图3所示，发酵时间延长，刺梨果酒酒精度不断增加。当发酵时间＜7 d时，刺梨果酒随着发酵时间的延长，口感愈加醇厚、细腻，酒香愈加浓郁、醇和，果酒独特的风味更加协调、酸甜适中，感官评分随发酵时间的增加不断升高。当发酵时间为7 d时，刺梨果酒的感官指标均处于较高水平。发酵时间＞7 d之后，刺梨果酒酒体逐渐浑浊，酒味变重，与刺梨果香的香气不够协调，且果酒苦涩味增加，感官评分有所回降，这与之前关于无花果山楂复合果酒的酿造工艺报道的趋势类似[26]。由于发酵时间变长，酵母生长旺盛，代谢能力增强，残糖进一步减少，酒精度渐渐增加，而总酸的含量可能升高，因而影响果酒的口感、风味，使得刺梨果酒酸甜不够协调。综上，刺梨果酒的发酵时间应该选在7 d。
图3 发酵时间对刺梨果酒感官评分和酒精度的影响
Fig.3 Effect of fermentation time on sensory evaluation score and alcohol content of Rosa roxburghii fruit wine
2.2 响应面优化试验结果与分析
2.2.1 响应面设计及结果
由Design-Expert 8.0.6软件将上述3个因素分析后，设计出17组试验方案，根据软件给出的试验顺序进行试验，试验设计及结果见表3。
表3 刺梨果酒发酵工艺优化响应面试验设计与及结果
Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation conditions optimization of Rosa roxburghii fruit wine
续表
利用Design-Expert 8.0.6软件，对表3的数据进行多元回归拟合，得感官评价对初始糖含量、酵母接种量、发酵时间的二次多项回归方程：
2.2.2 方差分析
方差分析结果见表4。由表4可知，模型P=0.0014（P＜0.01），说明模型显著；失拟项P=0.083 7（P＞0.05），不显著。对模型进行回归方程系数显著性检验，一次项A（初始糖含量）及二次项A2、B2对刺梨果酒感官评分的影响极显著（P＜0.01），其余因素对刺梨果酒感官评价影响不显著（P＞0.05）。各因子对刺梨果酒感官评分的影响依次是A（初始糖含量）＞C（发酵时间）＞B（酵母接种量）。
表4 回归模型的方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
2.2.3 因素间交互作用分析
根据响应面及其等高线图可评价试验因素之间的相互作用及其对感官评价的影响，以确定各因素的最佳水平范围，绘制各因素交互作用对结果影响的响应面和等高线见图4。响应面等高线的形状反映了两因素交互效应的强弱，椭圆形说明两因素交互作用显著，圆形则说明两因素交互作用不显著。从响应面图中可直观看出因素对响应值的影响。响应面图及方差分析表明，3个因素对刺梨果酒感官评价的影响大小为初始糖含量＞发酵时间＞酵母接种量。
图4 初始糖含量、酵母添加量及发酵时间交互作用对刺梨果酒感官评价影响的响应面和等高线
Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between initial sugar concertation,yeast inoculum and fermentation time on sensory evaluation of Rosa roxburghii fruit wine
图4（a）显示了初始糖含量和酵母接种量的交互作用，当初始糖含量一定时，随着酵母添加量的增加，感官评分含量先增加后减少。图4（b）显示了初始糖含量和发酵时间的交互作用，发酵时间较少时，初始糖浓度增加，感官评分也随之增加；发酵时间较长时，初始糖含量增加，感官评分先增加后减少。初始糖含量一定时，感官评分随着发酵时间的增加而增加。图4（c）显示了酵母添加量和发酵时间的交互作用。通过对回归模型方程求解，得出刺梨果酒的前发酵酿造工艺为初始糖含量270.69 g/L，酵母接种量4.43%，发酵时间8 d，在此条件下响应值最大为83.52分。
2.2.4 回归模型的验证
通过该回归方程得到优化后的工艺参数，即初始糖含量270.69 g/L，酵母接种量4.43%，发酵时间8 d。为验证模型的可预测性，同时考虑到实际操作中的可行性，将工艺条件调整为：初始糖含量270 g/L，酵母接种量4.5%，发酵时间8 d，在此条件下对刺梨果酒前发酵工艺条件进行验证。结果得出其感官评价得分为83分，酒精度为12%vol，与预测值较为相近，因此运用响应面法优化刺梨果酒酿造工艺的回归模型可行。
3 结论
通过响应面分析试验结果表明刺梨果酒前发酵工艺条件为初始糖含量270 g/L，酵母接种量4.5%，发酵时间8 d。在此条件下酿造的刺梨果酒感官评分最高为83分，苦涩味明显减轻，酒体色泽呈浅棕色，澄清透亮，酒香协调无异味，酸甜适中，酒精度为12%vol。
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