葡萄酒香气主要来源于葡萄原料、发酵过程及葡萄酒陈酿阶段[1-2]。在葡萄酒发酵过程中，酵母发挥了重要作用，主要体现在酵母能将葡萄汁中的糖转化成酒精和二氧化碳，促进高级醇、甘油、醛、酯等代谢物质大量产生，从而决定了葡萄酒的色泽、香气、口感，对其品质具有重要影响[3-4]。不同酵母代谢产物存在差异，从而赋予葡萄酒不同的风味特征[5-6]。张美枝等[7]用酵母EC1118、Str和CEC01发酵霞多丽干白葡萄酒发现，在发酵过程中，EC1118有较高的产酸能力，而CEC01导致总酸、总酚含量下降，表现出较高的降酸能力。余欢等[8]用7株酵母发酵桂葡3号干白葡萄酒发现，汉逊酵母属的Hanseniaspora thailandica MSF1-4有较高的产辛酸乙酯能力，根据香气物质的总量和香气活力值（odor activity value，OAV）表明，毕赤酵母属的Pichia pastoris MG1产香能力最好。目前针对不同酵母对发酵结束后的香气变化研究较多，但对发酵过程中香气的变化研究报道较少。
因此，本试验以霞多丽葡萄为原料，选用两种不同酿酒酵母进行干白葡萄酒发酵试验，采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱法（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）研 究不同酵母对发酵过程中的香气物质变化，并运用主成分分析法对发酵过程不同阶段的香气进行分析，以期为探究发酵过程中葡萄酒风味特征的变化提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
供试葡萄原料（霞多丽糖度167.50 g/L（以葡萄糖计），酸度3.90 g/kg（以酒石酸计））：2019年采自张家口；LA DELICIEUSE（简称LA-DE）、LA PERSANE（简称LA-PE）酿酒酵母：烟台帝伯仕啤酒技术有限公司。
果胶酶（60 000 U/mL）、偏重亚硫酸钾（食用级）：国药集团化学试剂有限公司。C8～C30正构烷烃标准品、2-辛醇标准品（色谱纯）：美国Sigma-Aldrich 公司。
1.2 仪器与设备
50/30μmSPEM萃取头（DVB/CAR/PDMS）：美国SupeLco公司；Agilent 7890B/5977A 型气相色谱-质谱联用仪、HP-5毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国Agilent公司；PAL RSI 85多功能气相色谱自动进样装置：瑞士CTC公司；FC5718R高速台式冷冻离心机：美国Ohaus公司；ME104E电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 干白葡萄酒发酵工艺流程
1.3.2 测定方法
（1）基本理化指标
参照GB/T 1503—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[9]中的方法进行。所有指标均重复3次，并取其平均值。
（2）香气物质分析[10-11]
样品预处理：取适量不同发酵时期干白葡萄酒发酵液，12 000 r/min离心处理10 min，取上清液待测。
HS-SPME条件：准确量取8mL上清液加入含有2.4gNaCl的20 mL进样瓶中，再加入8 μL 2-辛醇内标（1 000 μg/L）溶液。迅速密封后置于磁力搅拌加热台上，在50 ℃条件下保持30 min，然后将已经活化或热解吸后的SPME萃取头插入样品瓶的顶空部分。吸附饱和后的萃取头插入气相色谱进样口，于250 ℃解吸5 min，进行气相色谱-质谱（GC-MS）检测分析。
GC-MS测定条件：所用载气为高纯氦气（He），载气流速为1 mL/min；固相微萃取自动进样，采用不分流模式；控制进样口温度为250 ℃，热解吸5 min；升温程序为50 ℃保持5 min，然后以5 ℃/min升温至220 ℃，保持5 min。质谱接口温度为250 ℃，离子源温度为230 ℃，电离方式为电子电离源（electron ionization，EI），电子能量为70 eV，质量扫描范围为30～350 m/z。
定性方法[11-12]：待测香气采用质谱（mass spectrometry，MS）法和保留指数（retention index，RI）法进行定性分析。MS法：通过美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）14.L标准谱库对待测组分进行检索匹配，其匹配率均大于80%；RI法：测得C8～C30正构烷烃标样和发酵样品中各香气物质色谱峰的保留时间（retention time，RT），计算其保留指数，并结合数据库中的保留指数和查阅相关文献进行物质定性[10-11]。
定量方法[11-12]：采用内标法进行半定量分析。
1.3.3 数据分析
使用Agilent ChemStation软件对香气物质进行定性和定量，使用Microsoft Excel 2010对香气物质进行统计分类及绘制相关曲线图，使用SPSS 17.0对香气物质进行主成分分析。
2 结果与分析
2.1 发酵过程中基本理化指标变化
由图1A、图1B可知，不同酵母发酵过程中发酵液还原糖和可溶性固形物的变化均呈逐渐下降的趋势。在发酵第0～2天（发酵前期），还原糖和可溶性固形物含量开始缓慢下降，这是因为发酵前期酵母生长繁殖缓慢，糖消耗速率较慢；第3～7天（发酵中期）继续下降且速率加快，说明酵母代谢比较旺盛，将大量的糖转化为酒精等；发酵第8～9天（发酵后期）持续下降并趋于平稳。第9天酒精发酵结束，糖含量基本稳定降至4 g/L以下。LA-DE酵母发酵液发酵前期、中期消耗速率低于LA-PE酵母发酵液，发酵后期糖含量变化趋于一致，表明LA-PE酵母在发酵过程中酒精发酵启动速度较快。
图1 不同酵母发酵过程中还原糖（A）、可溶性固形物（B）及总酸含量（C）变化
Fig.1 Changes of reducing sugar (A),soluble solid (B) and total acid contents (C) in different yeasts fermentation process
由图1C可知，LA-DE酵母发酵过程中发酵液总酸含量呈逐渐增加的趋势；第9天时达到最大值6.84 g/L，随后终止发酵。LA-PE酵母发酵过程中发酵液总酸含量第0～4天呈现逐渐增加的趋势并在第4天达到最大值6.47 g/L；第5～9天在一定范围内上下波动；第9天时为6.19 g/L。这与赵雪平等[13]的研究结果一致；两种酵母发酵结束后其发酵液总酸含量均大于葡萄汁总酸含量（3.90 g/L），且酵母LA-DE发酵液中总酸含量（6.84g/L）高于酵母LA-PE发酵液（6.19g/L）。
2.2 不同酵母发酵过程中发酵液香气物质的变化
2.2.1 葡萄汁与发酵液中不同香气种类的变化
由表1可知，在两种酵母整个发酵过程中，共检测出68种香气物质，其中酯类32种，醛类4种，醇类3种，酸类7种，萜烯类13种，酚类3种，其他类6种。葡萄汁中香气物质较少，为31种；而LA-DE、LA-PE酵母发酵液中较多，分别为59种和63种。相比于葡萄汁，LA-DE、LA-PE酵母发酵液中酯类、醇类、酚类、萜烯类、酸类物质种类均呈增加趋势，而醛类物质种类略有减少。
表1 两种酵母发酵过程中的香气物质含量
Table 1 Aroma substances contents in two kinds of yeasts fermentation process
续表
注：“-”表示未检测到该物质。
酯类物质是葡萄酒中一类重要的香气，来源于葡萄果实、发酵过程及陈酿过程[16]，赋予葡萄酒果香和花香[17]。LA-DE酵母发酵液中酯类物质总含量为22 787.88 μg/L；LA-PE酵母发酵液中酯类物质总含量为14 569.57 μg/L。其中癸酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯、9-癸烯酸乙酯等含量较高，分别占酯类物质总含量的30.37%、24.23%，19.68%、21.41%，13.69%、11.66%，12.87%、11.23%。醇类物质是由酵母在酒精发酵过程中代谢产生，是构成葡萄酒风味特征的基本香气。两种酵母对发酵液中醇类物质影响较为明显，酵母LA-PE发酵液中醇类含量为2 587.30 μg/L，占总量13.37%，明显高于酵母LA-DE（1 545.53 μg/L）。酸类物质主要来源于发酵副产物和葡萄浆果[19]。LA-DE酵母发酵液中酸类总含量为2 643.42 μg/L，占总量9.57%；LA-PE发酵液中含量为1 595.20 μg/L，占总量8.24%。萜烯类物质作为葡萄酒中一种重要的香气，它感官阈值（OAV）非常低[20]，所以其含量会影响葡萄酒的香气特征[21]。酵母LA-DE发酵液中萜烯类总含量为409.49 μg/L，占总量的1.48%，较高于酵母LA-PE（389.16 μg/L），与葡萄汁相比含量分别增加1.86、1.77倍。酚类物质是葡萄中重要的抗氧化类化合物[22]。酵母LA-DE发酵液中酚类总含量为173.87 μg/L，占总量的0.63%；酵母LA-PE发酵液中其含量为150.85 μg/L，占总量的0.78%。
癸酸乙酯、苯乙醇、辛酸和正癸酸等香气物质在发酵过程中始终存在，且含量在不同阶段有不同变化；月桂酸乙酯、辛酸乙酯、十六烷酸乙酯和己酸乙酯等香气物质在发酵的过程中逐渐产生，且含量变化显著，这与陈明等[15]的研究相类似。
2.2.2 发酵过程中香气物质主成分分析
对发酵过程中香气物质进行主成分分析，以特征值＞1，累计方差贡献率＞80%，两个指标确定主成分个数为2，其中酵母LA-DE结果中PC1解释了总方差的64.80%，PC2解释了总方差的22.61%；酵母LA-PE结果中PC1解释了总方差的63.53%，PC2解释了总方差的27.17%。主成分分析表明，前2个主成分的累计方差贡献率分别达到87.40%、90.70%，基本包含了重要指标具有的信息，可以用来进行后续分析[24]。
由图2A可知，同一酵母发酵过程发现发酵前3 d香气物质出现明显分化，发酵后期聚集在了一起，说明在发酵初始阶段香气物质变化较为显著，发酵3 d后趋于一个较稳定的状态，香气物质的变化几乎没有影响葡萄酒的主体香气，这与孙佳勰等[12，25]研究结果相一致。不同酵母发酵过程相对比发现，酵母LA-DE和LA-PE发酵过程中第1天、第3天、第9天香气物质出现明显差异，而第5天、第7天差异较小。表明不同酵母发酵过程产生的香气物质变化趋势相似但也存在差异，所以可以通过香气物质的主成分分析区分不同的酿酒酵母。
图2 两种酵母发酵过程中香气物质主成分分析
Fig.2 Principal component analysis of aroma substances in two kinds of yeasts fermentation processes
A：载荷图；B：散点图，B图中序号1～68与表1中香气物质序号1～68对应。
载荷系数反映了发酵过程中各香气物质对主成分的影响，载荷系数绝对值越大，表明该香气物质对主成分的贡献也越大。由图2B可知，酵母LA-DE发酵过程中对第一主成分贡献较大的是（E）-β-大马士酮、正癸酸、邻苯二甲酸二异辛酯、邻苯二甲酸二丁酯、苯乙醇、（E）-2-己酸，而月桂酸乙酯对第一主成分呈负面影响；对第二主成分贡献较大的是癸酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯、正癸酸、苯乙醇、9-癸烯酸乙酯、辛酸。酵母LA-PE发酵过程中对第一主成分贡献较大的是（E）-β-大马士酮、邻苯二甲酸二异辛酯、邻苯二甲酸二丁酯、正癸酸、（E）-2-己酸、2,4-二叔丁基苯酚、苯乙醇；对第二主成分贡献较大的是癸酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸、苯乙醇、辛酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、正癸酸、十六烷酸乙酯。通过主成分分析，揭示了具体香气物质对葡萄酒主体香气的贡献大小，以获得不同酵母关键性香气物质组成。
3 结论
两种酿酒酵母发酵过程中发酵液的还原糖和可溶性固形物均呈下降趋势，总酸含量均大于葡萄汁总酸含量；葡萄汁和发酵液中共检测出68种香气物质。相比于葡萄汁，酵母LA-DE和LA-PE发酵时发酵液中醇类、酯类、酸类、萜烯类和酚类物质含量随发酵时间延长逐渐增加，而醛类物质逐渐减少；其中酯类物质含量增加显著，发酵结束时分别为22 787.88 μg/L和14 569.57 μg/L。主成分分析结果表明，发酵过程中香气物质在前3 d变化较为明显，两种酵母发酵液在第1天、第3天、第9天香气物质差异明显。由此可知，采用不同酵母发酵葡萄酒香气物质种类和含量发生了一定变化，其特征香气物质也因酵母的不同而存在差异，这对生产风味特色鲜明的葡萄酒具有重要的现实意义。鉴于葡萄酒的主体香气还受香气物质自身阈值的影响，因此，在发酵过程中不同酵母对其主体香气的影响还需进一步研究，葡萄酒的感官分析工作将于后期开展，为进一步确定不同酵母发酵葡萄酒的感官特征提供科学依据。
[1]王家梅，张军翔.葡萄酒香气来源和形成研究进展[J].中国酿造，2014，33（5）：5-9.
[2] BAKKER J,CLARKE R J.Wine Flavour Chemistry,Second Edition[M].Oxford:Blackwell Publishing Ltd.,2011:155-231.
[3] TESNIÈRE C.Importance and role of lipids in wine yeast fermentation[J].Appl Microbiol Biot,2019,103(20):8293-8300.
[4]COI A L,BIGEY F,MALLETT S,et al.Genomic signatures of adaptation to wine biological aging conditions in biofilm-forming flor yeasts[J].Mol Ecol,2017,26(7):2150-2166.
[5]王可，刘天明，李记明，等.不同酵母菌株共发酵对葡萄酒香气成分的影响[J].酿酒科技，2010（7）：34-38.
[6]蔡坤，吴武阳，林雪.果酒酿造工艺及香气成分研究进展[J].中国酿造，2017，36（11）：20-23.
[7]张美枝，楠极.不同酵母提升霞多丽葡萄酒品质的对比分析[J].现代食品科技，2020，36（8）：234-240，159.
[8]余欢，管敬喜，杨莹，等.7 株野生葡萄酒酵母对‘桂葡3 号’干白葡萄酒香气成分的影响[J].食品科学，2019，40（4）：251-258.
[9]国家质量监督检验检疫总局.GB/T 15038—2006 葡萄酒、果酒通用分析方法[S].北京：中国标准出版社，2006.
[10]BUTKHUP L,JEENPHAKDEE M,JORJONG S,et al.HS-SPME-GC-MS analysis of volatile aromatic compounds in alcohol related beverages made with Mulberry fruits[J].Food Sci Biotech,2011,20(4):1021-1032.
[11]康文怀，崔亥迪，戴柳翔，等.昌黎产区‘胡桑’干白葡萄酒香气成分分析[J].中外葡萄与葡萄酒，2019（3）：9-14.
[12]孙佳勰，康文怀，李慧，等.桑葚果酒发酵过程中的香气成分变化[J].现代食品科技，2020，36（8）：307-316，201.
[13]赵雪平，郑海武，雷蕾，等.本土酿酒酵母发酵梅鹿辄干红动态变化研究[J].食品与发酵工业，2020，46（8）：105-110.
[14]国家质量监督检验检疫总局.GB/T 15037—2006 葡萄酒[S].北京：中国标准出版社，2006.
[15]陈明，高珊，王瑞琦，等.HS-SPME-GC-MS 分析蛇龙珠葡萄酒发酵过程中香气成分变化[J].食品工业，2018，39（9）：164-166.
[16] TAO Y,LI H,WANG H,et al.Volatile compounds of young Cabernet Sauvignon red wine from Changli County(China)[J].J Food Compos Anal,2008,21(8):689-694.
[17]殷俊伟，龚霄，王晓芳，等.红心火龙果果酒挥发性成分分析[J].中国酿造，2016，35（9）：159-162.
[18] UBEDA C,GIL M,BARRIO-GALÁN R D,et al.Influence of maturityand vineyard location on free and bound aroma compounds of grapes from the País cultivar[J].S Afr J Enol Viticult,2017,38(2):201-211.
[19]RODRÍGUEZ-BENCOMO J J,CABRERA-VALIDO H M,PÉREZ-TRUJILLO J P,et al.Bound aroma compounds of Gual and Listán blanco grape varieties and their influence in the elaborated wines[J].Food Chem,2011,127(3):1153-1162.
[20]LAN Y B,QIAN X,YANG Z J,et al.Striking changes in volatile profiles at sub zero temperatures during overripening of 'Beibinghong' grapes in Northeastern China[J].Food Chem,2016,212(12):172-182.
[21] FENG H,SKINKIS P A,QIAN M C.Pinot noir wine volatile and anthocyanin composition under different levels of vine fruit zone leaf removal[J].Food Chem,2017,214:736-744.
[22] NIU Y,ZHANG X,XIAO Z,et al.Characterization of odor-active compounds of various cherry wines by gas chromatography-mass spectrometry,gaschromatography-olfactometryandtheircorrelation with sensoryattributes[J].J Chromatogr B,2011,879(23):2287-2293.
[23] WELKE J E,ZANUS M,LAZZAROTTO M,et al.Quantitative analysis of headspace volatile compounds using comprehensive two-dimensional gas chromatography and their contribution to the aroma of Chardonnay wine[J].Food Res Int,2014,59:85-99.
[24]李宝丽，邓建玲，蔡欣，等.顶空固相微萃取-气质联用结合主成分分析研究纯葡萄汁的香气成分[J].中国食品学报，2016，16（4）：258-270.
[25]唐柯，张小倩，李记明，等.威代尔冰葡萄酒发酵过程中香气动态变化规律[J].食品与发酵工业，2021，47（1）：62-70.