浓香型是白酒基本香型之一。固态浓香型白酒用单粮或多粮作为发酵原料，以大曲作为糖化发酵剂，原料经长期发酵后形成酒醅。酒醅中的挥发性成分在蒸馏过程中被提取、浓缩，进入原酒，因此原酒中的香气物质的种类和含量主要取决于酒醅中挥发性成分的种类和含量[1-3]。
酒醅中挥发性成分主要包括酯类、醇类、酮类、醛类、酸类、醚类、酚类、苯环类、烯烃类化合物[4-5]。出窖酒醅的挥发性成分会受到多种因素的影响。酒醅和窖泥中的微生物会影响出窖酒醅挥发性成分，如谭壹[6]研究发现Geortrichum silvicola和库德里阿兹威氏毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）与持续发酵段乙酸乙酯、己酸乙酯及丁酸乙酯的增加有关；应静[7]研究发现甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）可能参与丁酸乙酯生成；赵东等[8]研究发现，窖泥中的微生物与香气物质不断地与糟醅发生着相互交换。酿造用粮食会影响出窖酒醅的挥发性成分，如刘睿[9]研究发现，原料中的原花青素会对小曲白酒中异丁醇、异戊醇、乙酸、乙醛、糠醛、乙酸乙酯和乳酸乙酯产生影响；闫涵等[10]发现多粮酒醅比单粮酒醅发酵生成更多的乙酸己酯、肉豆蔻酸乙酯、苯甲醇、6-甲基-2-乙基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪。酿造工艺条件会影响出窖酒醅的挥发性成分，如李杰等[11]的研究表明低温入窖有利于酵母菌的生长和发酵产酒，有利于酯类物质的生成。出窖酒醅的挥发性成分还受到窖池空间分布的影响，如雷学俊等[4]研究发现酯类和酸类在窖池中的含量分布规律为下层＞中层≥上层，同层糟醅距离窖壁越近含量越高且呈扩散递减趋势。
入窖酒醅成分也可能对出窖酒醅的挥发性成分产生影响。浓香型白酒多采用续糟混蒸工艺[4，12-13]，入窖酒醅中除了含有粮食、大曲引入的挥发性成分外[10，14-15]，还含有酒醅蒸馏后的残留挥发性成分[13，16]，这些成分都将参与下一轮发酵。有报道表明，入窖酒醅酸度对出窖酒醅香气有显著影响[17]，但入窖酒醅的挥发性成分对出窖酒醅的影响未见报道。本研究采用顶空-气相色谱质谱联用（headspace gas chromatography-mass spectrometry，HS-GC-MS）对不同来源的出窖和入窖酒醅挥发性成分进行分析，比较不同来源的出窖酒醅之间、不同来源的入窖酒醅之间在挥发性成分上的差异，分析入窖酒醅挥发性成分对出窖酒醅挥发性成分可能产生的影响，为控制出窖酒醅质量提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
同种香型白酒酒醅样品：两个白酒生产企业提供，两个企业均采用高粱、玉米、小麦和糯米为酿造原料，以大曲为酿造用曲，采用续糟发酵工艺。出窖酒醅取样时，每个来源选取2个发酵期为60 d的窖池，每个窖池分别取窖池上、中、下层中心处的酒醅，共6个样品。入窖酒醅取样时，每个来源选取两个拌料后料堆，每个料堆分别取堆顶、中心、堆底处的酒醅，共6个样品。所有样品用封口袋密封保存后于-20 ℃冷冻保藏。
1.2 仪器与设备
Scion SQ-451气相-质谱联用仪、SHS-40 SL顶空进样系统、BR-swax毛细管色谱柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）：美国布鲁克道尔顿公司。
1.3 方法
1.3.1 样品预处理
所有样品解冻后，将同一来源的6个出窖/入窖酒醅取等量（10.0 g）混合，然后精确称取混匀后的酒醅5.000 0 g放入20 mL顶空瓶中，加入6 mL蒸馏水、2.2 g NaCl，混匀，压紧瓶盖。来自A企业的出窖/入窖酒醅分别编号为S_1和S_2，来自B企业的出窖/入窖酒醅分别编号为S_3和S_4。
1.3.2 顶空实验条件
样品瓶加热温度：50 ℃；阀和定量环加热温度：120 ℃；传输线温度：120 ℃；样品瓶加热时间：45 min；加热方式：振荡加热；进样体积：0.25 mL，进样时间：1 min。
1.3.3 气相色谱条件
色谱柱：BR-swax毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）进样口温度：250 ℃；升温程序：初始温度35 ℃保持4 min，以3 ℃/min升至150 ℃保持4 min，以5 ℃/min升至220 ℃保持20 min；载气为氦气（He），流速2.0 mL/min，分流比5∶1。
1.3.4 质谱条件
电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV；离子源温度250 ℃；传输线温度250 ℃；质量扫描范围40～350 m/z；数据采集扫描模式：全扫描模式；溶剂延迟时间0.5 min。
1.3.5 数据分析
计算总离子流色谱图中各峰面积的百分比，作为挥发性成分的相对百分含量[18-19]。利用软件R3.6.1进行统计分析和数据可视化。以样本各挥发性成分的相对百分含量为指标计算样本挥发性成分多样性距离矩阵、以样本中各类化合物相对百分含量为指标计算样本挥发性成分类别距离矩阵和香气成分类别距离矩阵，利用vegan包进行主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）[22-23]，展示样本间挥发性成分多样性的差异[20-21]、样本间挥发性成分类别差异以及样本间香气成分类别差异，利用ggplot2包进行可视化。比较相对百分含量＞1%的挥发性成分在各种酒醅中的分布差异，利用Circlize包进行可视化；利用STAT包中t检验函数进行配对样本t检验[24]。
2 结果与分析
2.1 酒醅挥发性成分分析
出窖酒醅和入窖酒醅的挥发性成分总离子流色谱图如图1所示。计算各酒醅样品中的挥发性成分的峰面积相对百分比，为消除含量过低的成分对差异分析的干扰，将相对百分含量≥0.01%的成分作为酒醅中主要挥发性成分，结果见表1。
图1 出窖酒醅和入窖酒醅挥发成分GC-MS分析总离子流色谱图
Fig.1 Total ion chromatogram of volatile compounds in unloading pits and loading pits analyzed by GC-MS
由表1可知，不同来源的出窖和入窖酒醅共检出42种主要挥发性成分，其中醇类6种、酸类4种、醛酮类8 种、酯类23种、醚类1种；出窖酒醅中检出41种，入窖酒醅中检出27种。酯类中乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯的相对百分含量均在2%以上，它们正是浓香型白酒的特征香气成分[3，24-25]。由于己酸乙酯和乳酸乙酯相对于乙酸乙酯和乙醇挥发性低，在蒸馏过程中在酒醅中残留比例高于乙醇，因此在两个来源的入窖酒醅中相对百分含量都增加，这与郎召伟等[5]的报道一致。本实验样品中检出的醛酮类挥发性成分均为五碳以下的醛酮。两个来源的入窖酒醅中乙酸、丁酸、己酸这三种酸的相对含量都增加，这是由于酸类物质的沸点高，在蒸馏后酒醅中积累进入下一轮发酵。
表1 不同来源酒醅主要挥发性成分分析结果
Table 1 Analysis results main volatile compounds in fermented grains from different sources
续表
注：“-”表示未检出。
2.2 不同来源样品间的差异分析
2.2.1 样品挥发性成分多样性差异
由图2可知，不同来源的出窖酒醅距离接近，说明虽然来源不同，但同种香型的出窖酒醅在挥发性成分多样性上的差异远远小于出窖和入窖间的差异。不同来源的入窖酒醅距离较远，说明不同来源入窖酒醅在挥发性成分多样性上存在较大差异，但这种差异要小于出窖酒醅和入窖酒醅在挥发性成分多样性上的差异。入窖酒醅间的差异有可能是由于蒸酒工艺不同、原料配比差异、大曲来源不同等原因造成的。出窖酒醅间的相似性说明出窖酒醅中挥发性成分的多样性不会受到入窖酒醅挥发性成分多样性的干扰。
图2 不同酒醅挥发性成分多样性主坐标分析结果
Fig.2 Principal coordinates analysis results of volatile compounds diversity of different fermented grains
2.2.2 样品挥发性成分类别差异
将酒醅中的挥发性成分划分为醇类、酸类、醛酮类、酯类和其他类，并计算各类的相对百分含量，对样品挥发性成分的醇类、酸类、醛酮类、酯类和其他类进行主坐标分析（如图3（a）），以展示样品在挥发性成分类别上的差异。除乙醇外酒醅中的挥发性成分可以归结为酒醅香气成分[8]。将酒醅香气成分按官能团分划分为醇类、酸类、醛酮类、酯类和其他类，并计算各类的相对百分含量。对样品香气成分的醇类、酸类、醛酮类、酯类和其他类进行主坐标分析（如图3（b）），以展示样品在香气成分类别上的差异。
由图3（a）可知，不同来源的出窖酒醅间、不同来源的入窖酒醅间的距离与出窖入窖酒醅间距离接近，说明无论出窖入窖、无论哪种来源，样品在挥发性成分分类上不存在明显差异。这主要是由于无论出窖入窖、哪个来源的酒醅，乙醇都是挥发性成分中占比最多的成分，且占比接近，与其他成分的占比存在数量级的差异，因此乙醇掩盖了其他成分给酒醅带来的差异。由图3（b）可知，在仅考虑香气物质时，各样品间的距离有明显区别。不同来源的出窖酒醅几乎重合，不同来源的入窖酒醅距离较远，但小于出窖入窖酒醅的距离。说明不同来源的入窖酒醅在各类香气成分的相对占比上也存在差异，但出窖酒醅的各类香气成分占比不受该差异的影响。
图3 不同酒醅挥发性成分类别主坐标分析结果
Fig.3 Principal coordinates analysis results of volatile compounds classification of different fermented grains
a-挥发性成分，b-香气成分
2.2.3 差异性成分分布
由图4可知，两种来源的出窖酒醅（S_1和S_3）在相对百分含量＞1%的挥发性成分的分布上比较接近，酒醅S_3挥发性成分中由于乙醇占比较高，其他香气成分（除乙酸外）的相对百分含量略低于酒醅S_1，酒醅S_1和S_3的挥发性成分中乙酸的相对百分含量接近。经成对样本t检验可知，酒醅S_1和S_3的主要挥发性成分在分布上差异不显著（P=0.475＞0.05），可见同一香型的白酒出窖酒醅即使来自不同生产企业，在相对百分含量＞1%的挥发性成分分布上也具有相似性。两种来源的入窖酒醅（S_2和S_4）在相对百分含量＞1%的挥发性成分的分布上差异明显，酒醅S_4的主要挥发性成分种类多于S_2。经成对样本t检验可知，酒醅S_2在乙醇、乳酸乙酯和乙酸的分布上显著高于酒醅S_4（P=0.035＜0.05），在其他相对百分含量＞1%的挥发性成分的分布上显著低于酒醅S_4（P=0.028＜0.05），说明不同来源的入窖酒醅在相对百分含量＞1%的挥发性成分上差异显著。可见同种香型的白酒，虽然不同来源的入窖酒醅在挥发性成分分布上有较大差异，但这并不会显著影响出窖酒醅中挥发性成分的分布。
图4 不同酒醅中挥发性成分的分布
Fig.4 Distribution of volatile compounds in different fermented grains
3 结论
浓香型白酒在采用同样的原料、大曲和发酵工艺时，不同来源的出窖酒醅在挥发性成分的多样性、香气成分类别、主要挥发性成分分布上差异均不明显。不同来源的入窖酒醅在挥发性成分多样性上、香气成分类别上有差异，在主要挥发性成分分布上差异显著，但这种差异不足以改变出窖酒醅的挥发性成分。因此可以认为入窖酒醅的挥发性成分对出窖酒醅的挥发性成分不会产生显著影响。本文研究成果能为浓香型白酒固态发酵的工艺控制提供一定参考。
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