郫县豆瓣是以蚕豆、鲜辣椒、面粉等为原料的半开放式传统发酵调味品，是中国地理标志产品，是川菜特色调味料，其制作技艺获国家级非物质文化遗产名录。郫县豆瓣的制作需要通过制曲、甜瓣子发酵、辣椒盐渍发酵、后发酵等关键工艺过程[1-2]，其中利用蚕豆和面粉制作甜瓣子是豆瓣生产的关键工艺，决定产品的氨基酸态氮含量、风味及色泽，是影响豆瓣品质的关键因素。豆瓣曲发酵好后，加入盐水进行发酵，在发酵过程中酱醪产生甜香气息和味道，当地人称其为甜瓣子。目前，郫县豆瓣甜瓣子的制作大部分采用米曲霉（Aspergillus oryzae）Q3.042制曲，然后以14%～16%的盐分进行保温发酵的单菌种高盐分发酵工艺，存在滋味咸鲜单薄，色泽偏暗的问题[3-4]。目前对郫县豆瓣品质的研究主要集中在挥发性成分方面，雷丹等[5]研究不同原料预处理对品质的影响、胡延等[6]通过添加酵母强化甜瓣子的研究都着重在工艺对豆瓣挥发性成分影响方面的研究；在制曲方面的研究有陈延延等[7]采用米曲霉和黑曲霉共同培养制曲提高成曲酶活力、孟甜等[8]在郫县豆瓣制曲生化变化进行发酵机理的研究，但在理化指标与品质的关系及影响方面研究较少。本研究从郫县豆瓣生产过程中筛选出的性能优良菌株米曲霉（Aspergillus oryzae）SICC3.1083和SICC3.930进行种曲制作，然后按不同比例混合后进行豆瓣制曲和甜瓣子发酵，通过对甜瓣子的理化指标还原糖、总酸、氨基酸态氮、红色指数与甜瓣子品质指标中的色、香、味之间的关系进行分析研究。以感官评价为响应值，在单因素试验的基础上，采用统计软件Design-Expert 10.0.4中响应面法的Box-Behnken试验设计[9-10]，对种曲比例、甜瓣子发酵温度、盐分等发酵条件进行优化，改善豆瓣曲酶系的均衡性，提高甜瓣子还原糖、氨基酸态氮和红色指数等理化指标，使甜瓣子滋味甜鲜醇厚协调，色泽红亮达到提高甜瓣子品质目的[7-8]，为郫县豆瓣新产品开发和后发酵提供优质的甜瓣子，为提高郫县豆瓣品质提供理论和数据支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种
菌株米曲霉（Aspergillus oryzae）SICC3.556、SICC3.930、SICC3.800、SICC3.1083、黑曲霉（Aspergillusniger）SICC3.318、米根霉（Rhizopus oryzae）SICC3.622和对照菌株米曲霉（Aspergillus oryzae）Q3.042：四川省微生物资源平台菌种保藏管理中心。
1.1.2 试剂
福林酚试剂、3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）试剂（均为分析纯）：北京索莱宝科技有限公司。
1.1.3 培养基
斜面培养基均采用马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：北京索莱宝科技有限公司。121 ℃灭菌20 min。
种曲培养基：将麸皮按料液比1.0∶0.9（g∶mL）加水，混匀后装入300 mL三角瓶，每三角瓶装料20 g，用纱布、牛皮纸包好后，121 ℃灭菌40 min。
固态发酵培养基：蚕豆于沸水中漂烫2～3 min冷却后，添加20%～25%面粉混匀。
1.2 仪器与设备
ME204E电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；PhS-5酸度计：上海虹益仪器仪表有限公司；TU-1810紫外分光光度计：普析通用仪器有限责任公司；SPX-250B-Z型生化培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备部；85-2磁力搅拌器：常州越新仪器制造有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品处理
将试验用菌株分别接入PDA斜面于28～30 ℃恒温活化培养96～120 h，斜面长满孢子后放置于冰箱冷藏备用。
1.3.2 甜瓣子加工工艺流程及操作要点
操作要点：
种曲制备：将活化好的菌种SICC3.556、SICC3.930、SICC3.800、SICC3.1083、SICC3.318、SICC3.622和对照菌株Q3.042接入已灭菌的种曲培养基中，置28～30 ℃恒温培养箱培养，待麸皮长满白色菌丝后扣瓶继续培养，培养120 h待麸皮长满黄绿色孢子后，种曲培养结束，置于45 ℃干燥箱中干燥备用。
豆瓣制曲：称取适量蚕豆瓣，在沸水中漂烫2～3 min，冷却后拌入20%～25%的面粉，将种曲预先拌入面粉中，种曲量按原料的5‰加入，拌合均匀置恒温培养箱中培养，培养温度28～30 ℃，相对湿度90%，曲料中心温度达37 ℃翻曲，待蚕豆瓣长满黄绿色孢子后收曲，制曲时间96 h。
发酵：将发酵成熟的豆瓣曲称质量，按照料液比1.0∶1.0（g∶mL）添加热盐水，发酵盐分14%，保温45 ℃发酵35 d结束发酵，得到甜瓣子。
1.3.3 复合种曲筛选试验
将活化好的菌种分别制作种曲，然后制备豆瓣曲并进行甜瓣子发酵，检测豆瓣曲蛋白酶、淀粉酶、糖化酶活力及甜瓣子理化指标并进行感官评价；然后分别将种曲按质量比1.0∶1.0（g∶g）混合进行豆瓣制曲及甜瓣子发酵，检测豆瓣曲蛋白酶、淀粉酶、糖化酶活力及甜瓣子理化指标并进行感官评价，筛选出性能优良的复合种曲。
1.3.4 甜瓣子发酵工艺条件优化
（1）单因素试验
将米曲霉种曲按比例混合，以5‰接种量接入蚕豆固体培养基中，28～30 ℃恒温培养制曲96 h，按照料液比1.0∶1.0（g∶mL）添加热盐水，发酵盐分14%，保温45 ℃发酵35 d结束发酵。分别进行甜瓣子感官评价和还原糖、红色指数、总酸、氨基酸态氮含量的检测，确定最佳发酵工艺条件。单因素试验因素与水平见表1。
表1 甜瓣子工艺条件优化单因素试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of single factor experiments for process conditions optimization of sweet bean petals
（2）响应面法试验设计
根据发酵过程中各单因素对甜瓣子品质影响结果分析，选取对感官评价影响较大的3个因素种曲比例（A）、发酵温度（B）、盐分（C）为自变量，以感官评价（Y）为响应值，采用Box-Behnken响应面设计试验，试验因素及水平见表2。
表2 Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 2 Factor and levels of Box-Behnken experiments design
1.3.5 分析检测
（1）种曲酶活力检测
蛋白酶活力参照GB/T 23527—2009《蛋白酶制剂》[11]；淀粉酶活力、糖化酶活力参照GB 1886.174—2016《食品工业酶制剂》[12]。
（2）甜瓣子理化指标检测
总酸、氨基酸态氮、盐分参照GB/T 20560—2006《地理标志产品郫县豆瓣》[13]。还原糖参照食品中还原糖的测定[14]。
（3）甜瓣子红色指数检测
红色指数：采用比色法测定。取剁碎样品5 g加入50 mL蒸馏水，浸泡30 min定容至100 mL后离心，取上清液于波长610 nm处测其光密度值（OD610nm）标为D1，于波长510 nm处测光密度值（OD510nm）标为D2，红色指数计算公式如下[15]：
式中：x为红色指数；D1为波长610 nm条件下的光密度值；D2为波长510 nm条件下的光密度值。
（4）感官评价
参照郫县豆瓣和甜面酱的感官要求[16]，结合甜瓣子的特性进行制定试验甜瓣子的评价标准。选取10位有经验的调味品品评员，从色泽、香味、滋味、体态四个方面进行评分，评分标准见表3。
表3 甜瓣子感官评价标准
Table 3 Sensory evaluation standards of sweet bean petals
1.3.6 数据处理方法
采用Design Expert 10.0.4软件中的Box-Behnken试验设计进行响应面分析，试验均重复3次，取平均值。
2 结果与分析
2.1 种曲菌株筛选
2.1.1 不同菌株种曲制备豆瓣曲的各种酶活力
为了更好的利用微生物资源，试验菌株采用米曲霉、黑曲霉和米根霉进行研究，其中SICC3.318为黑曲霉，SICC3.622为米根霉，SICC3.556、SICC3.930、SICC3.800和SICC3.1083为米曲霉。不同菌株种曲制备豆瓣曲的蛋白酶、淀粉酶、糖化酶酶活力测定结果见图1。
图1 不同菌株种曲制备甜瓣子各种酶类酶活力比较
Fig.1 Comparison of enzyme activities of various kinds of enzyme of sweet bean petals prepared by different strains koji
由图1可知，豆瓣曲中性蛋白酶和碱性蛋白酶活力最高的是菌株3.1083，分别为1 982 U/g和1 869 U/g，豆瓣曲酸性蛋白酶最高的是菌株3.318，为1 256 U/g，豆瓣曲淀粉酶和糖化酶活力最高的是菌株3.930，分别为400 U/g和2 036 U/g，其中菌株3.556、3.930、3.1083是豆瓣曲蛋白酶活力较高的菌种，蛋白酶是分解原料中蛋白质形成氨基酸类和多肽类物质是甜瓣子风味物质形成的主要前体物质[17]，菌株3.622和3.800所制豆瓣曲综合酶活都较对照菌株3.042弱。
2.1.2 不同菌株种曲制备甜瓣子的氨基酸态氮含量和感官评价
不同菌株种曲制备甜瓣子的氨基酸态氮含量和感官评价结果见图2。
图2 不同菌株种曲制备甜瓣子感官评价和氨基酸态氮含量的比较
Fig.2 Comparison of sensory evaluation and amino acid nitrogen contents of sweet bean petals prepared by different strains koji
由图2可知，菌株3.318氨基酸态氮含量最高达0.92g/100g，其中菌株3.1083的氨基酸态氮含量达0.80 g/100 g，对照菌株Q3.042氨基酸态氮含量为0.65 g/100 g；在感官评价中菌株3.318的酱醪色泽发黑且没有酱香味，不具备甜瓣子的感官特征，菌株3.1083甜瓣子色泽棕褐色色泽较深，咸鲜味重，菌株3.930甜瓣子色泽红亮甜鲜，菌株3.622在制曲过程中由于生长缓慢感染环境中米曲霉，导致氨基酸态氮含量和感官评价偏低，其他菌株生长速度快，能形成优势菌抵御杂菌感染。
2.1.3 混合菌株种曲制备豆瓣曲的各种酶活力
将各单菌株种曲按1.0∶1.0（g∶g）混合进行豆瓣曲制备，混合种曲制备豆瓣曲其各种酶酶活力测定结果见图3。
图3 不同混合菌株种曲制备甜瓣子各种酶类酶活力比较
Fig.3 Comparison of activities of various kinds of enzyme of sweet bean petals prepared by different mixed strains koji
由图3可知，菌株3.1083与3.556混合发酵的豆瓣曲蛋白酶酶活最高（4 241 U/g），糖化酶活力为1 072 U/g，菌株3.1083与3.930混合发酵的豆瓣曲其蛋白酶活力为3 495 U/g，糖化酶活力达1 635 U/g，糖化酶活力明显提高。
2.1.4 混合菌株种曲制备甜瓣子的氨基酸态氮含量和感官评价
将混合菌株种曲制备豆瓣曲进行甜瓣子发酵，甜瓣子氨基酸态氮含量和感官评价结果见图4。
图4 不同混合菌株种曲制备甜瓣子感官评价和氨基酸态氮含量的比较
Fig.4 Comparison of sensory evaluation and amino acid nitrogen contents of sweet bean petals prepared by different mixed strains koji
由图4可知，菌株3.318与其他米曲霉混合发酵甜瓣子的氨基酸态氮含量都比较高，但是甜瓣子没有酱香味且酱醪色泽黑褐色，黑曲霉在试验中的应用失败还需要进一步的研究；菌株3.1083与3.930混合发酵甜瓣子感官评分为85分，氨基酸态氮含量为0.74 g/100 g，菌株3.1083与3.556混合发酵的甜瓣子氨基酸态氮含量为0.76 g/100 g，感官评价分为80分，在色泽评价中菌株3.1083与3.930混合发酵甜瓣子红润有光泽，菌株3.1083与3.556混合发酵的甜瓣子色泽棕褐色，颜色发暗；在香味评价中菌株3.1083与3.930混合发酵甜瓣子醇香突出，菌株3.1083与3.556混合发酵的甜瓣子酱酯香味突出；在滋味评价中菌株3.1083与3.930混合发酵甜瓣子酱香浓郁甜鲜醇厚，滋味饱满协调，菌株3.1083与3.556混合发酵的甜瓣子酱香浓郁，味鲜美，滋味欠协调；在体态评价中菌株3.1083与3.930混合发酵甜瓣子瓣形完成酱醪浓稠，菌株3.1083与3.556混合发酵的甜瓣子瓣形完整酱醪略显干涩。因此，菌株3.1083与3.930种曲组合可以弥补单一菌种中酶系不均衡，达到提高甜瓣子品质的目的，可进一步优化发酵工艺条件。
2.2 工艺条件优化单因素试验
2.2.1 混合种曲比例对甜瓣子感官评价和还原糖含量的影响
还原糖在甜瓣子的发酵过程中参与色泽和风味物质的形成，是甜瓣子非常重要的指标。在豆瓣制曲过程中米曲霉产生糖化酶和淀粉酶，可将原料中的淀粉分解成糊精和还原糖，还原糖可以被微生物利用形成醇类和酯类等风味物质，醇类物质对甜瓣子香气贡献较大，是醇香的主要来源，也是形成酯类物质的前提；还原糖与氨基酸产生美拉德反应形成色素，丰富的糖类物质与氨基酸均衡使甜瓣子饱满协调滋味丰富[18-19]。
由表4可知，不同比例的混合种曲发酵甜瓣子的还原糖和感官评价不同，还原糖的提高可以形成更多风味物质，改善单一菌种单调的咸鲜，有利于提高郫县豆瓣甜瓣子品质[20-23]。在种曲比例为1.0∶1.0时感官评价最高，为88.5分，且还原糖含量较高7.76%。因此，选择最佳菌株3.1083和3.930质量比为1.0∶1.0。
表4 菌株3.1083和3.930质量比对甜瓣子感官评价和还原糖含量的影响
Table 4 Effect of strain 3.1083 and 3.930 mass ratio on sensory evaluation and reducing sugar content of sweet bean petals
2.2.2 发酵温度对甜瓣子感官评价和红色指数的影响
甜瓣子发酵可采用常温发酵也可采用保温发酵，保温更利于酶的充分作用，提高发酵速度缩短发酵时间[24]；甜瓣子色泽主要来源于发酵过程中，葡萄糖和氨基酸经过一系列反应最终产生呈棕红色的类黑素物质。发酵温度的提高有利于色素的形成，过高的温度会造成甜瓣子焦糊味重风味变差[25]。由表5可知，不同发酵温度对甜瓣子的色泽的影响，随着发酵温度逐渐提高，甜瓣子的色泽逐渐变深褐色，在发酵温度为40 ℃时，甜瓣子的色泽及酱香味等感官评价指标达到最佳，为88.0分；当发酵温度高于45 ℃之后，甜瓣子的香气变弱，由于温度升高导致酶活力降低，微生物作用下降，导致氨基酸损失及色泽变差。因此，选择最佳发酵温度为40 ℃。
表5 发酵温度对甜瓣子感官评价和红色指数的影响
Table 5 Effect of fermentation temperature on sensory evaluation and red index of sweet bean petals
2.2.3 发酵时间对甜瓣子感官评价和总酸含量的影响
甜瓣子总酸在发酵初期增加速度快，之后上升缓慢，与氨基酸态氮变化趋势一致，国外学者在研究韩国黑豆酱发酵过程中理化指标的变化与试验结果一致[26]；随着发酵时间延长，风味物质的积累越丰富。由表6可知，在发酵时间25 d时，甜瓣子酱香浓郁，色泽红亮，滋味甜鲜醇厚，感官评分为88.2分，随着时间延长总酸缓慢增加，过高的酸度会影响发酵辣椒醅的色泽。因此，选择最佳发酵时间为25 d。
表6 发酵时间对甜瓣子感官评价和总酸含量的影响
Table 6 Effect of fermentation time on sensory evaluation and total acid content of sweet bean petals
2.2.4 发酵盐分对甜瓣子感官评价的影响
在发酵食品中，微生物的差异导致发酵成分的差异，在甜瓣子发酵过程中盐水浓度的高低对甜瓣子发酵影响显著，适宜的盐水浓度在甜瓣子发酵过程中起到抑制杂菌感染的目的，过高的盐水浓度也会抑制豆瓣曲中各种酶的活性及微生物作用[27]。由表7可知，8%发酵盐分由于盐分过低导致大量腐败菌繁殖，酱醪酸度迅速上升，且酱醪酸败发酵异常；14%发酵盐分对蛋白酶作用的抑制非常明显，氨基酸态氮下降，过高过低的发酵盐分对甜瓣子风味的影响都不利[28-29]，12%盐分将有利于提高发酵速度，产生更多的氨基酸态氮，提高产品品质。因此，选用最佳盐分为12%。
表7 盐分对甜瓣子感官评价和氨基酸态氮含量的影响
Table 7 Effect of salt content on sensory evaluation and amino acid nitrogen content of sweet bean petals
2.3 响应面试验结果及分析
2.3.1 响应面试验设计及结果
在单因素试验基础上，固定发酵时间为25 d，选取对氨基酸态氮含量影响较大的3个因素菌株3.1083和3.930质量比（A）、发酵温度（B）、盐分（C）为自变量，以感官评价（Y）为响应值，根据Box-Behnken设计方案进行试验，响应面试验结果见表8，方差分析见表9。
表8 Box-Behnken试验设计与结果
Table 8 Design and results of Box-Behnken experiments
表9 回归模型方差分析
Table 9 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响差异显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响差异极显著（P＜0.01）。
感官评价对以上因素二次多元回归模型为：
2.3.2 方差分析
回归模型的方差分析如表9所示，模型P＜0.000 1，模型回归极显著，失拟项P=0.137 6＞0.05，差异不显著，说明模型对优化甜瓣子感官评价的发酵工艺是合适的；决定系数R2为0.997 7，模型对感官评价预测值与试验值拟合程度较高，调整决定系数为R2Adj为0.994 6，模型能解释99.4%响应值的变化，因此，可用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析和预测。对模型回归方程系数显著性检验，得到模型一次项A、B、C和二次项A2、B2、C2（P＜0.01）差异性显著；模型所选的3个因素中，根据F值大小其影响的强弱为：菌株3.1083与3.930质量比＞盐分＞发酵温度。
2.3.3 各因素交互作用对氨基酸态氮含量的响应面分析
根据回归方程绘制响应面曲面和等高线，能直观地反映各因素及其交互作用对响应值的影响，结果见图5。
图5 各因素相互作用对感官评价影响的响应面和等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interactions between each factors on sensory evaluation
为了更好地研究各变量之间的关系和进一步确定最优方案，通过Design-Expert10.0.4软件绘制响应面进行可视化分析。响应面的曲线图中，各因素间交互作用越强，曲线走势越陡，其交互作用越显著；等高线的形状也反应交互作用的强弱，椭圆形表示交互作用显著，圆形则交互作用小；由图5可知，种曲比例和盐分的响应面坡度较陡，等高线椭圆度较大，表明两因素交互作用强，对感官评价的影响显著；3个因素对响应面的敏感程度中种曲比例对感官评价作用最显著，其次是盐分，最后是发酵温度，这与方差分析结果一致。
2.3.4 验证实验与结果分析
为验证模型预测的准确性，对响应面优化工艺进行验证，为便于试验实际操作，将参数调整为菌株3.1083和3.930质量比1.0∶1.0，发酵温度40 ℃，盐分12.0%。在此优化工艺条件下进行5次平行试验，所得感官评分平均实际值为88.5分，实际值为与预测值88.2分相近，说明该回归方程能较准确反应各因素对感官评价的影响。
2.4 工艺优化前后甜瓣子理化指标分析及品质评价
优化前后工艺对照见表10，优化前后甜瓣子理化指标和感官评价对照见表11。
表10 优化前后工艺对照
Table 10 Process comparison before and after optimization
表11 甜瓣子品质评价
Table 11 quality evaluation of sweet clovers
由表10、11可知，优化后发酵温度和盐分降低，发酵时间缩短，感官评分提高17%、氨基酸态氮含量提高20%、还原糖含量提高40%、和红色指数提高40%；工艺条件和理化指标都优于传统工艺，感官评分明显提高，甜瓣子色泽红亮醇香鲜甜，滋味较传统工艺丰富协调。将不同性能菌株制作种曲然后按比例混合制豆瓣曲有利于改善豆瓣曲酶系的均衡性，增加风味物质的协调性，可以达到提高甜瓣子品质的目的。
3 结论
良好的品质是理化指标相互作用、相互协调，理化指标是工艺条件的体现。试验筛选出的功能菌种米曲霉SICC3.1083、SICC3.930综合酶活力优于米曲霉Q3.042；利用混合种曲制曲发酵提高甜瓣子品质，采用响应面法优化发酵工艺，得到最佳发酵工艺条件为：混合种曲（米曲霉3.1083和3.930）质量比1.0∶1.0（g∶g），发酵温度40 ℃，盐分12%。在此优化条件下，郫县豆瓣甜瓣子感官评分88分，还原糖含量为7.76 g/100 g，氨基酸态氮含量为0.78 g/100 g，理化指标均优于传统发酵工艺，品质提升显著；有效缩短发酵时间，降低发酵温度，提高生产效率，降低生产能耗，表明菌种SICC3.1083和SICC3.930混合发酵具有应用价值。
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