温州蜜柑（Citrus unshiu）作为湖北省主栽的一种鲜食水果，营养丰富，具有独特的风味，蜜柑中含有类胡萝卜素、维生素、蛋白质等多种营养物质[1]。由于蜜柑成熟季节相对集中，鲜果贮藏期短，容易腐烂，导致柑农卖果难。同时果品形状、大小等品质不同，占产量20%～30%的非标果也降低了果农的收入。基于蜜柑的加工特点开发高附加值的加工产品是促进柑橘产业健康发展的有效途径。以蜜柑作为酿造调味品和饮料的主要或补充原料，可充分利用蜜柑资源，增加农民的收入，而且蜜柑中的功能成分、芳香成分，赋予产品特殊的营养和风味[2]，可以满足人们更高层次的需求。
食醋是以粮食、水果、酒类等含淀粉、糖类、酒精等物质为原料发酵而成的一种酸性调味品。在数千年的生产过程中，世界各地形成了各具特色的生产工艺和产品。中国的四大名醋（山西陈醋、镇江香醋、福建红曲醋、四川麸曲醋）和日本的黑醋，是以高粱、稻谷、小麦等谷物为原料酿造的。意大利的香醋、西班牙的雪莉醋和美国的苹果醋等是以葡萄、苹果等水果为原料酿造的[3]。按照醋酸发酵方式，可分为固态发酵醋和液态发酵醋。固态醋酸发酵是中国的独特工艺，其产品具有色泽酱红、风味浓郁、口感醇厚、酸味柔和等优点[4]。液态深层发酵食醋具有生产占地面积小、自动化程度高、劳动强度低、产酸快等优点，越来越被国内食醋生产厂家所采用[5]。然而，液态发酵食醋的风味单一、酸味刺激性强，且色泽寡淡，不符合我国消费者的消费习惯[6]。所以目前我国液态发酵生产的食醋主要用作原料，通过与传统固态发酵食醋混合调配，或者添加食品增香剂和着色剂等方式来生产低端的食醋产品[7]。因此提高液态发酵食醋的风味和色泽是我国液态发酵食醋迫切需要解决的问题。
醋酸菌（acetic acid bacteria，AAB）是革兰氏阴性的专性好氧细菌，可将糖（主要是单糖和双糖）、糖醇或其他醇类氧化为相应的有机酸、醛或酮等物质，是食醋酿造的关键微生物[8]。醋酸菌可产生多种有益的次级代谢产物，如葡萄糖酸、二羟基丙酮、维生素C、果聚糖等。陈亨业等[9]分离到一株产棕色素，并且风味优良的醋酸菌—葡糖杆菌（Gluconobacter sp.）FBFS 82菌株，并将其应用于食醋酿造。
本研究以葡糖杆菌FBFS 82发酵柑橘果汁，生产色素发酵液，与液态发酵的原醋进行调配，制作色泽和风味优良、营养丰富的酿造型蜜柑醋。并对产品的稳定性、营养特性进行分析，以期改善液态发酵食醋存在的色泽寡淡、酸味刺激性强等缺陷。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
葡糖杆菌（Gluconobacter sp.）FBFS 82：由本实验室分离、鉴定并保存[9]。
柑桔和液态发酵的原醋：由湖北土老憨生态农业科技股份有限公司提供。
5种液态发酵食醋：市售。
1.2 仪器与设备
UV-1750紫外可见分光光度计：日本岛津公司；GC-2010-DSQ Ⅱ气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）：美国Agilent 公司；BLBio-10SL液态发酵罐：上海百仑生物科技有限公司；Hitachi L-8900氨基酸测定仪：日本日立公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头：美国Supelco公司。
1.3 方法
1.3.1 色素发酵液的制备
柑桔去皮、榨汁，接种10%（V/V）已活化的FBFS 82菌液，于无菌的10 L发酵罐28 ℃发酵6 d，对色素发酵液的总酸、总糖和游离氨基酸进行测定。色素发酵液经多层纱布过滤，于密闭容器中，室温储存。
1.3.2 蜜柑醋的配制
将液态发酵的原醋、色素发酵液和无菌水进行调配，制备蜜柑醋，使其酸度为5 g/100 mL，色素发酵液体积分数分别为10%、15%、20%和25%（以蜜柑醋A、B、C和D表示）。蜜柑醋以封口的透明玻璃瓶盛装，于自然条件下储存。
1.3.3 测定方法
总酸测定：参照参考文献[10]的方法；总糖测定：参照参考文献[11]的方法。
蜜柑醋的感官特性：参考GB/T 18187—2000《酿造食醋》对蜜柑醋的感官特性进行评价[12]。
色泽稳定性：蜜柑醋在自然条件下储存至60 d，每10 d取样一次，检测其色素在波长440 nm处的吸光度值（OD440nm值）[13]，评价色素的稳定性。
游离氨基酸的测定：参考GB/T 30987—2020《植物中游离氨基酸的测定》[14]，对色素发酵液、液态发酵的原醋，以A和C为代表的蜜柑醋进行游离氨基酸的测定。
挥发性成分分析：参考杨馥秀等[15]的方法，并略作改动，采用顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用方法（headspace solidphasemicroextraction-gaschromatography-massspectrometry，HS-SPME-GC-MS）分析蜜柑醋中的挥发性成分。
HS-SPME参数条件：取8mL稀释后的蜜柑醋，加入20mL顶空瓶，并加入3.0 g氯化钠，于60 ℃以200 r/min磁力搅拌，平衡15 min。将已活化的萃取头插入顶空瓶中，推出纤维头，吸附40 min。
GC-MS参数及分析条件：GC进样口250 ℃，采用不分流进样，5 min后吹扫流量20 mL/min；载气为高纯氦气，柱流量为1 mL/min；毛细管色谱柱为Agilent HP-5ms（30 m×250 μm×0.25 μm）；离子源温度230 ℃，单四极杆温度150 ℃，离子传输管温度280 ℃，电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV，质量扫描范围35～600 m/z，全扫描模式。优化后的程序升温条件为：初始温度40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min 速率升至120 ℃，保持2 min；以5 ℃/min 升至140 ℃后再以10 ℃/min 升至250 ℃，保持1 min。后运行条件为250 ℃，5 min。
将测得物质谱图与标准谱图库NIST 8（national institute of standards and technology）中进行对比分析，以匹配度大于80确证所检出的各种化学成分。
采用环己酮作为内标物，各化合物峰面积与内标峰面积比计算各化合物的含量。
2 结果与分析
2.1 色素发酵液的理化指标分析
对FBFS 82发酵柑橘汁的色素发酵液的理化指标进行分析，总糖含量为7%，总酸含量为1.23 g/100 mL，pH值为2.45，游离氨基酸含量为3693.43 mg/100 mL，其中γ-氨基丁酸含量为1 769.90 mg/100 mL。
2.2 蜜柑醋的感官特性
由图1可知，液态发酵的原醋为淡黄色，滋味寡淡，有明显的醋酸的刺激性气味。蜜柑醋A为琥珀色，随着色素发酵液含量的增加，颜色逐步加深，蜜柑醋D为红棕色。与市售的5款液态发酵食醋相比，蜜柑醋的色泽有光鲜感，更诱人。同时蜜柑醋的滋味和气味更丰富。蜜柑醋B、C、D均具有明显的酱香味，酸味柔和，所有蜜柑醋均无异味。结果表明随着色素发酵液含量的增加，感官特性明显得到改善。
图1 蜜柑醋与几种市售食醋色泽的比较
Fig.1 Comparison of color between citrus vinegar and several commercial vinegar products
2.3 蜜柑醋的色泽稳定性
由图2可知，在自然条件下储存，蜜柑醋A、B、C和D的OD440nm值均没有明显变化，说明葡糖杆菌FBFS 82的色素稳定，光照、低酸对其色泽无影响。而且蜜柑醋体态透明澄清，仅蜜柑醋D有少量悬浮的颗粒。可能是因为色素发酵液未经过过滤、澄清等处理。
图2 蜜柑醋的色泽稳定性评价
Fig.2 Evaluation of color stability of citrus vinegar
2.4 蜜柑醋的氨基酸种类与含量
对液态发酵的原醋，以蜜柑醋A和C为代表进行氨基酸含量测定，结果见表1。
表1 蜜柑醋游离氨基酸的种类与含量
Table 1 Types and contents of free amino acid in citrus vinegar
续表
注：“ND”表示未检出；“*”表示必需氨基酸。
由表1可知，液态发酵的原醋中检测到12种游离氨基酸（包括7种必需氨基酸），氨基酸总含量为（47.26±6.18）mg/100g。蜜柑醋A和C均含有18种游离氨基酸，组成蛋白质的氨基酸为17种，含量分别为（892.46±19.1）mg/100 g和（1 811.90±22.72）mg/100 g，其中包含人体必需的8种氨基酸。李婷等[16]对我国四大名醋进行分析，氨基酸含量分别为山西老陈醋（227.32～331.15）mg/100 mL、保宁醋（188.27～208.29）mg/100 mL、镇江香醋（127.58～141.44）mg/100 mL，永春老醋（82.95～96.33）mg/100 mL。白烨[17]以巴氏醋杆菌单独发酵，以及巴氏醋杆菌与植物乳杆菌混合发酵柑橘汁制备果醋，其游离氨基酸均为17种，含量分别为314.43 mg/100 g和322.92 mg/100 g。孙晓昕等[18]对市售的27种果醋进行测定，仅4种检测到低含量的游离氨基酸。上述结果表明，蜜柑醋在营养成分——游离氨基酸方面具有明显的优势，而且蜜柑醋A和C（以氨基酸态氮计）分别达到了镇江香醋的一级产品和特级产品的水平[19]。
此外，在蜜柑醋A和C中分别检测到（182.27±8.68）mg/100 mL，（383.19±8.27）mg/100 mL的功能成分γ-氨基丁酸，γ-氨基丁酸的含量与色素发酵液的含量呈正比，而液态发酵的原醋中未检测到该组分，说明γ-氨基丁酸来自色素发酵液。
根据游离氨基酸风味强度，将对风味有贡献的氨基酸分为鲜味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸[20]。在检测的蜜柑醋A和C中，甜味氨基酸占比为（与组成蛋白质的氨基酸之比）均为65%；鲜味氨基酸占比分别为的15%和16%；苦味氨基酸的占比分别为18.45%和17.29%。说明蜜柑醋中呈味氨基酸多样化，其滋味丰富。
上述结果充分说明色素发酵液营养丰富，在氨基酸的种类和含量方面具有明显的优势，特别是富含功能成分γ-氨基丁酸。γ-氨基丁酸在神经系统的发育过程中具有营养作用，是一种神经营养因子，同时也是强神经抑制性氨基酸，具有镇静、降血压、降低血氨、提高脑活力、促进乙醇代谢、参与组织再生等多种生理作用[21-23]。本研究制作的酿造型蜜柑醋不仅可以用于饮料和调味料的二次开发，在进一步拓展保健医药作用方面具有良好的前景。
2.5 蜜柑醋挥发性成分测定
以蜜柑醋A和C为代表，采用HS-SPME-GC-MS对其挥发性成分进行分析，经NIST8谱库检索识别，鉴定出的挥发性成分及其含量见表2。
表2 蜜柑醋A和C的挥发性成分及含量
Table 2 Volatile components and contents in citrus vinegar A and C
续表
注：“-”表示未检出。
蜜柑醋A检测到51种挥发性物质，包括酸类6种、酯类13种、醇类4种、醛类7种、酮类6种、酚类3种和其他物质12种。蜜柑醋C检测到60种挥发性物质，包括酸类7种、酯类18种、醇类4种、醛类9种、酮类5种、酚类5种和其他物质12种。随着色素发酵液含量的增加，挥发性香气物质的种类，说明色素发酵液提供了更多的香气成分。
酸味是食醋最基础的味道，酸类也是影响食醋风味和品质的一类化合物[24]。蜜柑醋A和C中，共有的酸味物质主要有醋酸、（-）-乙酰基-l-酒石酸、辛酸等。醋酸是刺激气味强烈的酸，是食醋经典的气味；而辛酸具有奶酪味及少许的涩味。根据其他学者对永春香醋和永春老醋[25]、水塔陈醋[15]等的分析，辛酸与食醋香气有较高的相关性[26]。酯类化合物在香味的组成中占有特别重要的地位，大多具有花香、果香、酒香或蜜香香气，是评价食醋产品的一个主要指标。蜜柑醋A和C中酯类物质的种类和含量在所有挥发性成分中占比最高，特别是乙酸乙酯，乙酸乙酯是引起果醋的发酵风味的物质之一[27]。此外，蜜柑醋中还含有丰富的醇酚类、醛酮类和杂环类等化合物，如乙偶姻、苯乙醇、壬醛、糠醛等，这些化合物共同赋予了蜜柑醋独特的香味与营养[28-29]。其中乙偶姻作为一种食用级的香料，应用广泛[30]；苯乙醇具有独特风味，如玫瑰香、紫罗兰香、茉莉花香等[31]；壬醛等醛类物质具有良好的风味特征，具有玫瑰花香[32]。
3 结论
本研究以葡糖杆菌FBFS82的色素发酵液与液态发酵的原醋调配制备蜜柑醋，结果表明，调配后能显著改善产品的感官特性和营养特性。其中，含10%（V/V）色素发酵液的蜜柑醋A，色泽浓郁，优于市售的5款液态发酵食醋；蜜柑醋A和C的游离氨基酸含量，达到（892.46±19.1）mg/100 g和（1 811.90±22.72）mg/100 g，特别是其富含具有生理活性的成分——γ-氨基丁酸（（182.27±8.68）mg/100 mL和（383.19±8.27）mg/100 mL）；蜜柑醋A和C分别含有51种和60种挥发性物质，包括酸类、酯类、醇类、醛类、酮类、酚类和其他物质，其中赋予香气的酯类成分含量最高。本研究制作的蜜柑醋是色、香、味和营养俱佳的酿造型果醋。
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