漆酶（Laccase，EC 1.10.3.2）是一种含铜的多酚类氧化还原蛋白，属于铜蓝氧化酶，它最早于1883年在日本的漆树中被发现并分离出来[1-2]，有关漆酶的研究已经持续了100多年。漆酶作为一种生物酶，能够将酚类、胺类、羧酸类等难降解污染物在温和的条件下降解为对环境毒性更弱的小分子物质，有着巨大的应用潜力[3-6]。金地灵芝（川审菌2003008）是四川省农业科学院土壤肥料研究所用赤芝为出发菌株，经过原生质体再生技术选育的灵芝新品种，具有产量高、原基分化早、菌盖分化时间短、成熟周期短、芝形好等特点。在前期研究中发现金地灵芝产漆酶酶活较高。
目前发酵产漆酶的方法主要有液态发酵与固态发酵两种。固态发酵是微生物在没有或基本没有游离水的固态基质上，利用自然底物作为碳源和能源，用一种或多种微生物进行的生物反应过程。与液态发酵相比，固态发酵具有发酵原料易获取、成本较低、发酵易操作且过程中无废水、废气产生等优点[7-8]。三七渣因其含有大量的有机物、矿质元素和一些微量元素[9-10]，适合作为固态发酵基质使用。选择采用金地灵芝固态发酵三七渣产漆酶，既能够实现三七渣的资源化利用，提高其附加值，又能够为漆酶的生产提供一条新的低成本途径。
因此，本研究以漆酶酶活作为评价指标，在单因素试验的基础上，通过正交试验优化金地灵芝固态发酵三七渣生产漆酶的培养基组成条件，以期为工业化利用三七渣固态发酵生产漆酶提供培养基组成的基础数据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
三七渣：来自成都市某中成药厂，中药渣湿物料经晒干、粉碎、过筛后置于干燥器中备用，其主要成分为真蛋白9.97%，粗蛋白12.28%，粗纤维27.45%，还原糖2.19%，总糖48.87%，淀粉30.35%[11]；金地灵芝（川审菌2003008）：四川省农业科学院土壤肥料研究所微生物室提供。
1.1.2 试剂
MgSO4·7H2O、无水乙醇、NaNO3、KH2PO4、葡萄糖（均为分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；2,2'-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2,2'-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid ammonium salt，ABTS）（分析纯）：上海阿拉丁试剂厂。
1.1.3 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：土豆20 g，葡萄糖2.0 g，琼脂粉2.0 g，蒸馏水100 mL，121 ℃灭菌30 min。
种子液培养基：葡萄糖6%，蛋白胨2%，NaNO3 1%，MgSO4·7H2O 0.5%，KH2PO4 1%，自然pH，121 ℃灭菌30 min。
三七渣固体培养基：采用过60目筛的三七渣10.0 g，酵母浸出粉添加量1%，培养基初始水含量60%，磷酸二氢钾添加量0.15%，硫酸铜添加量0.02%，硫酸镁添加量0.2%，pH自然，121 ℃灭菌30 min。
1.2 仪器与设备
SF-130中药分析研磨机：长沙中南制药机械厂；LHS-250HC-II恒温恒湿生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；JHF1-DK-S28电热恒温水浴锅：华西科创（北京）科技有限公司；UV752紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌种扩大培养
使用接种环将试管内保存的斜面菌种取适量接入PDA培养基中，于28 ℃条件下恒温培养5～6 d。
1.3.2 种子液制备
用打孔器在PDA培养基的边缘取0.5 cm2的灵芝菌丝块，接入装有110 mL种子液培养基的250 mL锥形瓶中并放入6～9颗小玻璃珠，置于恒温振荡器中，在150 r/min、28 ℃条件下培养5 d。
1.3.3 三七渣固态发酵产漆酶培养基配方优化
在三七渣固体培养基中接入2 mL的灵芝种子液，于28 ℃条件下恒温培养12 d。
单因素试验：分别考察三七渣固体培养基中酵母浸出粉添加量（1%、2%、3%、4%、5%）、培养基初始水含量（50%、55%、60%、70%、75%、80%）、硫酸酮添加量（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%）、磷酸二氢钠添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）、硫酸镁添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）对发酵培养物中漆酶酶活的影响。
正交试验：在单因素试验的基础上，选择对发酵结果影响较大的培养基初始水含量、磷酸二氢钠添加量、硫酸铜添加量进行3因素3水平正交试验[12]，优化培养基组成。正交试验因素与水平见表1。
表1 三七渣固体培养基配方优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for Panax notoginseng residues solid medium formula optimization
1.3.4 漆酶粗酶液制备
待固态发酵结束后，用手术剪将发酵培养物剪碎，向锥形瓶中加入150 mL乙酸-乙酸钠缓冲提取液（pH4.8），置于40 ℃条件下恒温水浴1 h，每隔20 min振摇一次，水浴结束后用8层纱布过滤，将滤液于5 000 r/min条件下离心15 min，取上清液即为漆酶粗酶液，置于4 ℃条件下冷藏备用。
1.3.5 测定方法
漆酶酶活：采用ABTS法[13-14]进行测定。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 酵母浸出粉添加量对漆酶酶活的影响
氮是真菌生长所必需的元素，有机氮源有助于灵芝的生长[15-16]，酵母浸出粉添加量对漆酶酶活的影响见图1。
图1 酵母浸出粉添加量对漆酶酶活的影响
Fig.1 Effect of yeast extract powder addition on laccase activity
由图1可知，漆酶酶活先是随着酵母浸出粉添加量的增加逐渐增大，当酵母浸出粉添加量为3%时，漆酶酶活达到最大值2.73 U/g。继续增大其添加量反而会导致漆酶酶活减小，可能是因为酵母浸出粉含量过高，会使培养基黏性增大，影响通透性；此外，培养基氮含量过高会使培养基碳氮比失调，导致灵芝代谢异常，生长缓慢[17]。因此选择酵母浸出粉的最适添加量为3%。
2.1.2 培养基初始水含量对漆酶酶活的影响
真菌从外界获取营养物质的过程中离不开水的参与，许多化学元素只有溶解在水中，才能被真菌利用。水能够从多方面对固态发酵过程产生影响[18]，培养基的含水量对漆酶酶活的影响较大[19]，培养基不同初始水含量对漆酶酶活的影响见图2。
由图2可知，漆酶酶活随着初始水含量的增加呈先增大后减小的趋势，当初始水含量为55%时，漆酶酶活达到最大值5.625 U/g。研究中发现，水含量达到一定值后，固态培养基质在锥形瓶内呈现糊状且分散极为不均，这将影响培养基的通透性，不利于体系热传递以及CO2、O2的交换，不利于灵芝呼吸代谢[20]。因此，选择培养基的最适初始含水量为55%。
图2 初始水含量对漆酶酶活的影响
Fig.2 Effect of initial water content on laccase activity
2.1.3 硫酸铜添加量对漆酶酶活的影响
YOU L F等[22]的研究表明，铜离子可以诱导漆酶基因的表达。硫酸铜添加量对漆酶酶活的影响见图3。
图3 硫酸铜添加量对漆酶酶活的影响
Fig.3 Effect of copper sulfate addition on laccase activity
由图3可知，漆酶酶活随硫酸铜含量的增加呈先增大后减小的趋势。当硫酸铜添加量为0.03%时漆酶酶活达到最大值3.19 U/g，在硫酸铜添加量为0.03%～0.04%时漆酶活性降低较多，该结果说明低浓度铜离子对灵芝产漆酶具有促进作用，而高浓度铜离子则表现为抑制作用。POSTEMSKY P D等[23]添加100 mg/kg Cu（II）作为底物补充物使蘑菇残基中的漆酶活性从150 U/kg提高至267 U/kg底物。一般认为，Cu2+的促进作用可能与漆酶的结构有一定关系[24]。因此，选择硫酸铜的最适添加量为0.03%。
2.1.4 磷酸二氢钾添加量对漆酶酶活的影响
磷与真菌的生长活动密不可分，遗传物质、细胞膜的合成以及能量的转化传递过程都离不开磷。翟双星等[25]发现K+是灵芝菌丝体正常生长的必要条件。磷酸二氢钾添加量对漆酶酶活的影响见图4。
由图4可知，漆酶酶活随磷酸二氢钾添加量的增加而增加，在磷酸二氢钾含量为0.15%时漆酶酶活达到最大值3.81 U/g。继续增大磷酸二氢钾添加量漆酶酶活反而降低。磷酸二氢钾一方面可以给灵芝同时提供磷、钾两种不同的营养元素，另一方面会影响灵芝生长环境的pH值，从而影响灵芝的生长代谢。因此，选择磷酸二氢钾的最适添加量为0.15%。
图4 磷酸二氢钾添加量对漆酶酶活的影响
Fig.4 Effect of potassium hydrogen phosphate addition on laccase activity
2.1.5 硫酸镁添加量对漆酶酶活的影响
由图5可知，漆酶活性呈先增加后降低的趋势，硫酸镁添加量在0.05%～0.20%时，活性较稳定升高，硫酸镁含量为0.20%时漆酶酶活达到最大值2.53 U/g。硫酸镁添加量超过0.20%后，漆酶活性急剧降低。整体而言，镁离子对漆酶活性的有轻微的促进作用，但效果不如铜离子明显，这与朱显峰等[24]的研究结果一致。漆酶活性的整体趋势也与硫酸铜大体相似，同样在Mg2+浓度过高时可能呈现金属离子对菌体的毒害作用而使漆酶活性降低。因此选择硫酸镁的最适添加量为0.20%。
图5 硫酸镁添加量对漆酶酶活的影响
Fig.5 Effect of magnesium sulfate addition on laccase activity
2.2 正交试验设计与结果
在单因素试验基础上，以初始水含量、磷酸二氢钾以及硫酸铜为影响因素，以漆酶酶活力为评价指标，采用L9（33）正交设计，正交试验结果及方差分析分别见表2和表3。
表2 三七渣固体培养基配方优化正交试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for Panax notoginseng residues solid medium formula optimization
表3 正交试验方差分析结果
Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment results
由表2可知，最优培养基配方组合为A2B3C1，即磷酸二氢钾添加量0.15%，初始水含量60%，硫酸铜添加量0.02%。在此优化条件下，漆酶酶活可达8.69 U/g。由表3可知，磷酸二氢钾添加量对漆酶活性影响显著（P＜0.05），培养基初始水含量及硫酸铜添加量对漆酶活性影响极显著（P＜0.01）。
3 结论
灵芝固态发酵三七渣产漆酶为三七渣的资源化利用提供了一条新的途径。本次研究可以为工业化利用三七渣固态发酵生产漆酶提供培养基组成的基础数据。本次研究结果表明，优化后的三七渣培养基组成为：采用过60目筛的三七渣10 g，酵母浸出粉添加量3%，磷酸二氢钾添加量0.15%，硫酸铜添加量0.02%，硫酸镁添加量0.2%，培养基初始水含量60%，pH自然。在此优化条件下，灵芝固态发酵三七渣产生的漆酶活性可达8.69 U/g。
[1]窦欣，田乔鹏，王琦，等.Ganoderma sp.SYBC L48 漆酶酶学性质及其对酸性红1 的脱色性能[J].环境工程学报，2019，13（4）：856-864.
[2]刘卉娟，敖新宇，洪海迪，等.20 株木腐菌高产漆酶菌株的筛选[J].湖北农业科学，2015，54（12）：2858-2862.
[3]韩业昊.灵芝漆酶降解几种染料与氯酚类污染物研究[D].合肥：安徽理工大学，2015.
[4]ZHANG Y,LV Z Y,ZHOU J,et al.Application of eukaryotic and prokaryotic laccases in biosensor and biofuel cells:recent advances and electrochemical aspects[J].Appl Microbiol Biot,2018,102:10409-10423.
[5]BABADOSTU A,GULDU O K,DEMIRKOL D O,et al.Affinity based laccase immobilization on modified magnetic nanoparticles:biosensing plat-form for the monitoring of phenolic compounds[J].Int J Polym Mater Polym Biomater,2015,64(5):260-266.
[6]FANG Z,LI T,WANG Q,et al.A bacterial laccase from marine microbial metagenome exhibiting chloride tolerance and dye decolorization ability[J].Appl Microbiol Biot,2011,89(4):1103-1110.
[7]潘志恒，岳鹍，孙勇民，等.树舌灵芝发酵产漆酶培养基优化[J].保鲜与加工，2016（4）：107-111.
[8]李梅，吴小波，李萌，等.糙皮侧耳以果皮为基质固态发酵产漆酶及其酶学性质的研究[J].食用菌学报，2018，25（1）：60-66.
[9]王小国.中药渣资源化利用现状[J].中国资源综合利用，2019，37（1）：81-84.
[10]陈鑫，安志刚，车树理，等.中药渣的资源化利用[J].中兽医医药杂志，2017（4）：85-87.
[11]谭显东，黄凡，林巧玉，等.培养基特性对三七渣发酵产红曲色素的影响[J].环境工程学报，2017，11（7）：4293-4297.
[12]LI F,REN R,YAO S J.Repeated-batch cultivation of encapsulated Monascus purpureus by pigment production[J].Chinese J Chem Eng,2010,18(6):1013-1017.
[13]DROZD R,RAKOCZY R,WASAK A,et al.The application of magnetically modified bacterial cellulose for immobilization of laccase[J].Int J Biol Macromol,2018,108:462-470.
[14]MA J,XU Z S,WANG F,et al.Isolation,purification and characterization of two laccases from carrot(Daucus carota L.)and their response to abiotic and metal ions stresses[J].Protein J,2015,34(6):444-452.
[15]翟双星，冯杰，冯娜，等.灵芝三萜液态深层发酵的研究进展[J].农学学报，2018（1）：118-124.
[16]HAN J R,AN C H,YUAN J M.Solid-state fermentation of cornmeal with the basidiomycete Ganoderma lucidum for degrading starch and upgrading nutritional value[J].J Appl Microbiol,2005,99:910-915.
[17]MENEZES T A D,BISPO A S D R,KOBLITZ M G B,et al.Production of basidiomata and ligninolytic enzymes by the lingzhi or Reishi medicinal mushroom,Ganoderma lucidum(Agaricomycetes),in licuri(Syagrus coronata)wastes in Brazil[J].Int J Med Mushrooms,2016,18(12):1141-1149.
[18]SHOJAOSADATI S A,FARAIDOUNI R,MADADI-NOUEI A,et al.Protein enrichment of lignocellulosic substrates by solid state fermentation using Neurospora sitophila[J].Resour Conserv and Recy,1999,27(1-2):73-87.
[19]郭良昊，陈海秀，李松，等.Trametes sp.LS-10C 固态发酵产漆酶培养基优化及其对双酚A 的降解[J].菌物学报，2020，39（10）：1948-1959.
[20]YANG H L,MIN W H,BI P Y,et al.Stimulatory effects of Coix lacrymajobi oil on the mycelial growth and metabolites biosynthesis by the submerged culture of Ganoderma lucidum[J].Biochem Eng J,2013,76:77-82.
[21]韩晓磊，严莲荷，周申范.漆酶分泌及其活性影响因素综述[J].化学与生物工程，2005（7）：10-12.
[22]YOU L F,LIU Z M,LIN J F,et al.Molecular cloning of a laccase gene from Ganoderma lucidum,and heterologous expression in Pichia pastoris[J].J Basci Microb,2014,54(S1):S134-S141.
[23]POSTEMSKY P D,DELMASTRO S E,CURVETTO N R.Effect of edible oils and Cu(II)on the biodegradation of rice by-products by Ganoderma lucidum mushroom[J].Int Biodeter Biodegr,2014,93:25-32.
[24]朱显峰，丁涛.常见金属离子对漆酶酶活的影响[J].化学研究，2003，14（3）：50-51.
[25]翟双星，冯杰，冯娜，等.灵芝三萜液态深层发酵的研究进展[J].农学学报，2018（1）：118-124.