壳聚糖酶通常被认为是一类对壳聚糖有专一水解性，以内切方式在部分乙酰化壳聚糖中催化水解β-1,4糖苷键生成壳寡糖的酶。壳寡糖（chitooligosaccharides，COS）是壳聚糖的水解产物，是一种由β-（1,4）-2-氨基-D-氨基葡萄糖和β-（1,4）-2-乙酰氨基-D-氨基葡萄糖单元组成的多聚糖。COS聚合度一般为2～10，易溶于水，黏度低，易被吸收，生物活性丰富，在食品和生物医药领域得到广泛应用[1-3]；具有抗肿瘤、抑菌、杀菌、抗氧化、增强免疫力和吸附重金属等重要机能[4-7]。目前，COS产品制备方法有化学法、酶法、高能冲击和基因工程重组等方法[8-9]。其中酶法具有产物特异性强、安全、环保和副产物少等特点。
壳聚糖酶主要由微生物（真菌、细菌和放线菌）和植物产生，该酶在微生物和植物的对外防御和营养功能上起着重要的作用[10-15]。壳聚糖酶的应用除COS制备，还应用于植物真菌病原菌生防治、真菌原生质体的制备和甲壳类废物的生物转化等。近年来，随着应用加剧使壳聚糖酶的研究备受关注[16-18]。虽已筛选出了大量产壳聚糖酶菌株，但经研究发现，不同壳聚糖酶产生菌降解壳聚糖的产物、降解方式和适宜的酶解条件不尽相同[19-22]，而且野生菌的酶活性普遍较低，难以大规模工业化生产，壳聚糖酶来源有限，使得商品化的壳聚糖酶价格较高，生产成本难以下降，致使酶法制备COS造价较高，限制了该法的推广应用。因此，需要开发更多类型、适应条件广的壳聚糖酶降解菌来满足工业化需求，通过壳聚糖酶产生菌的作用，有助于COS的开发应用。
该试验分离获得一株产壳聚糖酶菌株G10，研究旨在利用紫外和微波复合诱变技术对野生型菌株进行改造，选育壳聚糖酶产量高、酶活性强的突变菌株，并通过正交试验优化酶活发酵工艺条件，以期为壳聚糖酶的进一步研究和应用提供理论基础，为大幅提高COS的应用技术能力提供一些技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 供试菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）G10：河南大学微生物实验室。
1.1.2 试剂
3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析纯）：上海国药试剂集团；壳聚糖（脱乙酰度≥90%）：广州化工集团。
1.1.3 培养基
液体LB培养基[23]：蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH7.2；固体LB培养基：液体LB培养基添加琼脂1.8%。121 ℃灭菌20 min。
液体金氏培养基B（King's B medium，KBM）[24]：蛋白胨2.0%，甘油1.0%，K2HPO4 0.15%，MgSO4·7H2O 0.15%，pH7.2；固体KBM培养基：液体KBM培养基添加琼脂2.0%。121 ℃灭菌20 min。
初筛液体发酵培养基：液体KBM培养基添加0.1%胶体壳聚糖；复筛液体发酵培养基：液体KBM培养基添加0.5%胶体壳聚糖。
1.2 仪器与设备
BIO-RAD iMark酶标仪：美国伯乐公司；5424R高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；QHZ-98A全温度振荡培养箱：上海百典仪器设备公司。
1.3 方法
1.3.1 菌种诱变
菌株的活化：以斜面培养16～18 h的菌株G10为出发菌，接种于LB液体培养基，28 ℃、180 r/min振荡培养16 h，使细胞处于对数生长期；将上述培养物置于4～7 ℃储藏1 h，诱导同步生长，然后冰浴10 min。4 ℃条件下，将菌悬液12 000 r/min离心，去上清，重悬浮菌体细胞，将细胞浓度调整至108 CFU/mL[25]。
紫外诱变：取上述菌液均匀涂布于LB固体培养基平板，使培养皿底部离紫外灯管约30 cm，打开皿盖，分别对平板进行不同时间的紫外照射，照射时间为0、5 s、10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s、70 s、80 s和90 s，照射结束后28 ℃黑暗培养48 h。以不照射的菌液为对照，计算致死率。
微波诱变：对紫外诱变获得的正突变株中遗传稳定的菌株进行微波诱变。取600 μL菌悬液置于1.5 mL离心管中，并将离心管置于装满冷水的烧杯中，微波炉中辐照。辐照档位功率为700 W，脉冲频率2 540 MHz，每隔10 s换水一次，冷却降温。辐照时间为0、10 s、20 s、30 s、50 s、60 s、80 s、90 s、110 s和120 s，辐照结束，将菌液均匀涂布于LB固体培养基平板上，28 ℃培养48 h。以不照射的菌液为对照，计算致死率。
1.3.2 突变菌株的筛选
突变菌株的初筛：根据致死曲线，在最佳紫外和微波时长诱变条件下，挑取诱变后生长速度快的单菌落，接种于LB液体培养基，180 r/min振荡培养，28 ℃恒温培养16 h。然后将菌液分别定量点接于胶体壳聚糖平板上，28 ℃恒温培养72 h。以菌株G10为对照菌株，挑取透明圈相对大的菌落。
突变菌株的复筛：将初筛的菌株接种于复筛培养基，进行摇瓶培养，28 ℃恒温培养40 h。分别测定不同菌株发酵液壳聚糖酶活，根据酶活大小筛选高产菌株。以菌株G10为对照菌株。
菌株遗传稳定性：经过初筛和复筛后，将待测菌株进行连续10代培养，接种复筛液体培养基振荡培养，分别测定其壳聚糖酶活力。
1.3.3 壳聚糖酶产酶条件优化单因素试验
培养条件的优化：菌体培养条件优化前的培养温度为30 ℃，转速180 r/min，培养基初始pH值7.2，装液量为30 mL/250 mL。以此条件为参照，将活化的菌种接入装有30 mL复筛液体培养基的250 mL三角瓶，分别对培养转速（150 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min和240 r/min）、初始pH值（6.8、7.0、7.2、7.4和7.6）、培养温度（25 ℃、28 ℃、30 ℃、34 ℃和37 ℃）进行优化，培养24 h。利用DNS法测定发酵液壳聚糖酶活。
培养基成分的优化：以加有0.5%胶体壳聚糖的KBM培养基为基础培养基，分别用1%的葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖和甘露醇替代甘油；分别用2%的酵母粉、胰蛋白胨、牛肉膏、NH4Cl和尿素替代蛋白胨；分别用0.3%的FeCl2、K2HPO4、LiSO4、CaCl2、MnSO4和NaCl替代MgSO4·7H2O+K2HPO4；考察不同碳源、氮源、无机盐对壳聚糖酶活的影响。按1.3.2优化后的培养条件培养24 h。分别测定发酵液壳聚糖酶活。
1.3.4 壳聚糖酶产酶培养基优化正交试验
通过单因素试验初步考查MgSO4·7H2O（A）、果糖（B）和酵母粉（C）添加量对菌株W1-32产壳聚糖酶的影响。在单因素试验的基础上，设计L9（34）正交试验，优化菌株W1-32产壳聚糖酶发酵培养基。
1.3.5 壳聚糖酶活力测定
取待测发酵液3mL，于4℃条件下8000r/min离心10min，得上清即为粗酶液。取1 mL粗酶液，加0.1%的胶体壳聚糖1 mL，30 ℃水浴保温15 min；加入2 mol/L的NaOH溶液0.2 mL终止反应，5000r/min离心5min，取上清液1mL与1mL的DNS试剂混合，沸水浴5 min，冷却，加入蒸馏水，定容至10 mL，酶标仪测定OD520nm值。
取粗酶液1 mL与1 mL的DNS试剂混合，沸水浴5 min，冷却后加入蒸馏水，定容至10 mL，酶标仪测定OD520nm值，以此为空白对照。根据氨基葡萄糖标准曲线和酶活力单位定义，计算壳聚糖酶活力[26]。
壳聚糖酶活力单位定义为：在30 ℃条件下，1 mL酶液每分钟产生相当于1 μmol氨基葡萄糖的还原糖所需的酶量为一个壳聚糖酶活力单位（U/mL）。
2 结果与分析
2.1 紫外诱变条件的确定
由图1可知，随着照射时间的延长，菌体致死率逐渐提高，60 s、70 s和80 s照射时间时菌体致死率分别为81.5%、95%和100%。通过对紫外线、微波、烷化剂等诱变剂的诱变结果统计发现，突变株正向突变多出现在菌体致死率为80%～90%时[27]。因此，选择紫外诱变照射时间为60 s。
图1 紫外照射时间对菌体致死率的影响
Fig.1 Effect of UV irradiation time on strain lethality
2.2 微波诱变条件确定
由图2可知，辐射时间为50 s时致死率为83%，辐射时间为60 s时致死率为91%。由于诱变致死率80%～90%之间突变菌株发生正突变概率高[27]。因此，选择微波照射时间为50 s。
图2 微波照射时间对菌体致死率的影响
Fig.2 Effect of microwave irradiation time on strain lethality
2.3 壳聚糖酶高产菌株的初筛及复筛
紫外诱变结果：菌株G10经紫外诱变后，初筛出72株高产壳聚糖酶菌株。利用摇瓶培养法进行高产菌复筛，筛选到一株壳聚糖酶活相对较高的突变菌株，编号为Z1-15。经测定，出发菌株G10产壳聚糖酶酶活为1.72 U/mL，菌株Z1-15产壳聚糖酶酶活为3.35 U/mL。
微波照射诱变结果：对紫外诱变筛选出的壳聚糖酶高产菌Z1-15进行微波照射诱变。筛选出102株突变株，经摇瓶发酵复筛测其壳聚糖酶活，选出一株产壳聚糖酶活较高的菌株W1-32，其产壳聚糖酶酶活为6.53 U/mL。
2.4 菌株W1-32产壳聚糖酶稳定性测定
菌株W1-32经过10次传代和摇瓶培养，对其壳聚糖酶活分别进行测定，结果见表1。由表1可知，该菌株传代10次后产壳聚糖酶酶活为6.531 U/mL，产壳聚糖酶稳定。
表1 菌株W1-32不同传代次数壳聚糖酶活
Table 1 Chitosanase activity of different passages of strain W1-32
2.5 培养条件对菌株W1-32产壳聚糖酶酶活的影响
2.5.1 初始pH对菌株W1-32产壳聚糖酶酶活的影响
由图3可知，随培养基初始pH的升高，菌株W1-32产壳聚糖酶酶活呈先增大后减小的趋势；培养基初始pH值为7.2时，菌株W1-32产壳聚糖酶酶活最高，为6.552 U/mL。因此，选择菌株W1-32产壳聚糖酶培养基的最佳初始pH值为7.2。
图3 初始pH对菌株W1-32产壳聚糖酶酶活的影响
Fig.3 Effect of initial pH on chitosanase activity produced by strain W1-32
小写字母表示差异显著（P＜0.05）；大写字母表示差异极显著（P＜0.01）。下同。
2.5.2 转速对菌株W1-32产壳聚糖酶活的影响
由图4可知，随着培养转速的提高，菌株产壳聚糖酶活呈先升高后下降的趋势；转速为200 r/min时，菌株发酵液相对酶活最高，酶活为6.613 U/mL。因此，选择菌株W1-32产壳聚糖酶培养的最佳转速为200 r/min。
图4 转速对菌株W1-32产壳聚糖酶活的影响
Fig.4 Effect of rotational speed on chitosanase activity produced by strain W1-32
2.5.3 温度对菌株W1-32产壳聚糖酶活的影响
由图5可知，随着培养温度升高，菌株W1-32产壳聚糖酶活呈先升高后降低的趋势；结果表明温度为28 ℃时，菌株W1-32产壳聚糖酶活性最高，酶活为6.530 U/mL。因此，选择菌株W1-32产壳聚糖酶的最佳培养温度为28 ℃。
图5 温度对菌株W1-32产壳聚糖酶活的影响
Fig.5 Effect of temperature on chitosanase activity produced by strain W1-32
2.6 培养基配方优化单因素试验
碳源、氮源、无机盐对菌株W1-32产壳聚糖酶活的影响见图6～图8。
图6 碳源对菌株W1-32产壳聚糖酶活的影响
Fig.6 Effect of carbon source on chitosanase activity produced by strain W1-32
图7 氮源对菌株W1-32产壳聚糖酶活的影响
Fig.7 Effect of nitrogen source on chitosanase activity produced by strain W1-32
图8 无机盐对菌株W1-32产壳聚糖酶活的影响
Fig.8 Effect of inorganic salts on chitosanase activity produced by strain W1-32
由图6可知，不同碳源条件下酶活差异极显著（P＜0.01）；结果显示以果糖为碳源时，该菌株产壳聚糖酶活最高，酶活为6.563 U/mL。因此最佳碳源为果糖。
由图7可知，不同氮源条件下菌株W1-32产壳聚糖酶活差异极显著（P＜0.01）；结果表明以酵母粉为氮源时，菌株W1-32产壳聚糖酶活最高，酶活为6.532 U/mL。因此，选择菌株W1-32产壳聚糖酶的最佳氮源为酵母粉。
由图8可知，不同无机盐条件下菌株W1-32产壳聚糖酶活差异极显著（P＜0.01）；结果显示所选的七种不同的盐中，添加MgSO4·7H2O时，菌株W1-32产壳聚糖酶活最高，酶活为6.612 U/mL。因此，选择菌株W1-32产壳聚糖酶的最佳无机盐为MgSO4·7H2O。
2.7 培养基配方优化正交试验
由表2可知，3个因素对菌株W1-32产壳聚糖酶酶活影响大小顺序为RB＞RC＞RA，即果糖添加量影响最大，酵母粉添加量次之，MgSO4·7H2O添加量影响最小。综合各因素培养基优水平组合为A2B3C2，即MgSO4·7H2O 0.3%，果糖1.3%，酵母粉2.0%。
表2 菌株W1-32产壳聚糖酶培养基配方优化正交试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for medium formula optimization of chitosanase produced by strain W1-32
2.8 优化条件下菌株W1-32的壳聚糖酶活
由图9可知，在优化培养条件及培养基条件下，8 h前酶活增长缓慢；10～18 h酶活快速增长，24 h时酶活达最高11.82 U/mL，超过30 h后，酶活逐渐下降。
图9 菌株W1-32产壳聚糖酶活力曲线
Fig.9 Curve of chitosanase activity produced by strain W1-32
3 结论
以具有产壳聚糖酶能力的枯草芽孢杆菌G10为出发菌株，利用紫外和微波复合诱变法，选育高产壳聚糖酶突变株。筛选出一株酶活相对较高突变菌株W1-32菌株。通过对培养条件的优化，最佳产酶条件为：培养基初始pH值为7.2，最适宜培养转速200 r/min，温度28 ℃，最佳产酶培养基成分为：果糖1.3%、胶体壳聚糖0.5%，酵母粉2.0%、MgSO4·7H2O 0.3%；优化后菌株W1-32产壳聚糖酶酶活为11.82 U/mL，是出发菌株的6.9倍。
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