当今快节奏的生活方式使得各种压力充斥着人们的生活，会使得人体产生一系列的以疲乏无力、精神不振为主要表现的疲劳症状[1-4]。世界卫生组织调查显示，全球目前有75%的人处于疲劳等“亚健康”状态，其中男性的比例占60%[5-7]。长期处于疲劳状态会逐渐降低人体的免疫能力，甚至导致糖尿病、慢性肝病、肾脏疾病等多种慢性疾病的发生，严重影响人民的生活质量[8-10]。因此抗疲劳、增强免疫力的保健产品逐渐被人们重视。保健酒是指以白酒为酒基，选择有治疗滋补作用的中药或者药食同源物质，经浸提等工艺生产出的具有一定保健功能的酒剂，中医认为白酒具有舒筋活血，温暖脾胃，祛风散寒等作用，而且白酒具有缓和药性，增强药物功效，促进酒中活性成分吸收等功效，因此以白酒作为酒基开发的保健酒产品有着特殊的活性功能[11-14]。
牡蛎俗称海蛎子、生蚝，是一种味道鲜美、营养价值丰富的海洋贝类。研究表明，牡蛎肉中含有丰富的糖原、蛋白质、氨基酸、脂肪、微量元素和维生素等营养物质[15-16]。据联合国粮农组织评定，牡蛎肉中的必需氨基酸组成评分优于人乳和牛乳，因此牡蛎也被称为“海洋牛奶”[17]。牡蛎中还含有丰富的牛磺酸，含量可达到总氨基酸含量的约31%[16，18]。牡蛎作为第一批公布的药食同源食品之一在保健品中到了广泛的应用[19-20]。牡蛎肽是牡蛎经酶解、分离、纯化得到的寡肽混合物，具有显著的抗疲劳和增强免疫力活性[21-22]。吉宏武等[23]的研究结果表明，牡蛎水解物中蛋白质含量丰富，氨基酸组成完善，通过动物实验发现牡蛎原肉和牡蛎水解物均具有抗疲劳作用，且水解物的抗疲劳效果优于原肉。张梅超[24]研究发现，用牡蛎蛋白酶解物制成的运动饮料可以显著地延长小鼠负重力竭游泳的时间，与对照组、阳性对照组相比，在运动前30 min饮用，牡蛎饮料能显著减少血乳酸与骨骼肌丙二醛的产生，显著增加肝糖原与肌糖原的含量，而血尿素氮含量无显著性变化；运动后饮用，30 min内小鼠丙二醛和肝糖原含量可快速恢复到安静状态。陶雅浩等[25]研究发现，补充低剂量和中剂量牡蛎肽能延长小鼠力竭游泳时间，提高小鼠力竭运动时蛋白质分解供能能力，节省力竭运动时肝糖原和肌糖原的使用，减轻力竭运动时骨骼肌损伤程度。许丹等[26]研究表明，牡蛎肽可改善由环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）造成的免疫力低下小鼠的免疫器官结构，恢复小鼠T淋巴细胞比例，增强机体的免疫功能。陈晓文等[27]发现牡蛎肽可有效增强小鼠的体液免疫功能。刘淑集等[28]研究表明，牡蛎肽能提高由CTX造成的免疫力低下小鼠的细胞免疫，体液免疫及非特异性免疫，且对小鼠的肝脏和脾脏无显著影响。蔡冰娜等[29]研究表明，牡蛎肽肠内营养制剂可明显增强小鼠的细胞免疫和自然杀伤（natural killer，NK）细胞活性，并且低剂量组可增强小数的巨噬细胞吞噬功能。
本研究以实验室自制低分子质量牡蛎肽为主要原料，辅以枸杞、黄芪、杜仲和西洋参等传统中药，经浸提、粗滤、调配、冷藏、精滤等步骤研制出一种含有牡蛎肽的新型保健酒（novel health care wine，NHCW），并依据2003版《保健食品检验与评价技术规范》[30]以小鼠为模型开展功能实验，为开发缓解体力疲劳和增强免疫力的保健酒提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
含牡蛎肽的保健酒：选取本地浓香型白酒为酒基，辅以枸杞、黄芪、杜仲、西洋参，料液比1∶10（g∶mL），浸泡酒精度40%vol，浸泡时间为21 d，粗滤后加入牡蛎肽、冰糖溶解，完全溶解后于0 ℃冷库中储藏7 d，经冷冻离心后，过0.45 μm微孔膜过滤后得到自制含牡蛎肽的保健酒。人体推荐摄入量为100 mL/d，每人按60 kg体质量计。
1.1.2 试剂
RPMI1640细胞培养基、小牛血清、β-巯基乙醇、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）、噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、Hank's液、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（pH7.2～7.4）、绵羊红细胞（sheep red blood cell，SRBC）、补体（豚鼠血清）、水杨酸缓冲液（salicylic acid buffer，SA）、Giemsa染液、鸡红细胞、肝糖原测定试剂盒：京索莱宝科技有限公司；都氏试剂：美国Sigma公司；盐酸、异丙醇、丙酮、甲醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；血尿素氮测定试剂盒：南京建成生物工程研究所。
1.1.3 实验动物
BALB/c成年小鼠（无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级，体质量18～22 g，全雄）：济南彭悦实验动物有限公司。
1.2 仪器与设备
Heracell 240i二氧化碳培养箱：美国Thermo Fisher公司；VersaMax酶标仪：美国Molecular Devices公司；UV-5500分光光度计：上海元析仪器有限公司；SW-CJ-2D超净工作台：浙江苏净净化设备有限公司；YXQ-LS-100A高压灭菌锅：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；Centrifuge5418R离心机：德国Eppendorf公司；HWS-26恒温水浴锅：上海一恒科技有限公司；CX31显微镜：日本Olympus公司；BSA224S电子天平：德国Sartorius公司；PB100-SP10手持式匀浆机：英国Prima公司。
1.3 实验方法
1.3.1 动物实验
参照《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）。将实验室自制含牡蛎肽保健酒，按照要求降低乙醇含量至15%。分别设置4个剂量组：阴性对照组（乙醇含量15%的基酒）、低剂量组（人体推荐摄入量的5倍，8.4 mL/kg）、中剂量组（人体推荐摄入量的10倍，16.7 mL/kg）、高剂量组（人体推荐摄入量的20倍，33.4 mL/kg），另外设一个空白对照组（经口灌胃生理盐水），每组BALB/c成年小鼠70只。实验小鼠除每天给予基础饲料和水外，每天经口灌胃相应体积受试样品一次，受试样品给予时间为30 d。
1.3.2 缓解体力疲劳实验
小鼠负重游泳实验：实验前1 h小鼠禁食不禁水，末次给予受试样品30 min后，每组取10只小鼠将尾根部负荷5%体质量铅皮，置于水深不少于30 cm，水温（25±1.0）℃游泳桶内进行负重游泳实验（每次下水的小鼠不超过4只）。记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，即小鼠负重游泳时间。
小鼠运动后血清尿素含量的测定：实验前1 h小鼠禁食不禁水，末次给予受试样品30 min后，每组取10只小鼠置于水深不少于30 cm，水温（25±1.0）℃游泳桶内进行不负重游泳实验（每次下水的小鼠不超过4只）90 min。休息60 min后采血。小鼠拔眼球采全血约0.5 mL（不加抗凝剂）。置于4 ℃冰箱约3 h，血凝固后2 000 r/min离心15 min，取血清备用。血清尿素含量通过二乙酰-肟法测定。测定步骤按血尿素氮含量测定试剂盒操作。
小鼠运动后肝糖原含量的测定：实验前1 h小鼠禁食不禁水，末次给予受试样品30 min后，每组取10只小鼠置于水深不少于30 cm，水温（25±1.0）℃游泳桶内进行不负重游泳实验90 min。游泳结束后颈椎脱臼处死，取新鲜肝脏样品，用生理盐水漂洗后用滤纸吸干，称质量。用手持式匀浆机充分匀浆后，离心取上清，按肝糖原含量测定试剂盒操作进行测定。
1.3.3 增强免疫力实验
对小鼠体质量和脾脏器官的影响：实验前1 h小鼠禁食不禁水，末次给予受试样品30 min后，每组取10只小鼠称质量，颈椎脱臼处死后立即取脾脏和肝脏，去净筋膜，用滤纸吸干表面血污，称量脾脏（肝脏）质量，按照下式计算脾脏（肝脏）指数：
Con A诱导小鼠脾淋巴细胞转化实验：实验前1 h小鼠禁食不禁水，末次给予受试样品30 min后，每组取10只小鼠无菌取脾。将脾脏去净筋膜后置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，制成细胞悬液，经200目筛网过滤。用Hank's液洗2次，每次用离心机1 000 r/min离心10 min。将细胞悬浮于1 mL完全培养液中，计数活细胞数，用RPMI1640培养液调整其细胞浓度至3×106个/mL。再将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1 mL，在其中一孔加入75 μL ConA液（相当于7.5 μg/mL），另一孔不加作为对照，培养板置于5%CO2条件下37 ℃培养72 h。培养结束前4 h，每孔轻轻吸去上清液0.7 mL，加入1 mL不含小牛血清的RPMI 1640培养液，同时向每孔中加入5 mg/mL的MTT 50 μL，继续培养4 h。培养结束后，每孔加入1 mL酸性异丙醇，吹打均匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个培养孔重复平行3次，使用酶标仪在波长570 nm处测定吸光度值A，参照下式计算淋巴细胞增值能力：
淋巴细胞的增殖能力=ODConA-OD空白
小鼠血清溶血素含量测定：受试样品经口灌胃3 d后每只小鼠经腹腔注射2%（V/V，用生理盐水配制）压积绵羊红细胞（SRBC）0.2 mL进行免疫。连续给药7 d，于末次给予受试样品30 min后，摘除眼球取血于离心管内，4 ℃放置约1 h，使血清充分析出，2 000 r/min 离心10 min，收集血清。取血清用SA缓冲液稀释200倍，取稀释后血清1 mL置于试管内，依次加入0.5 mL用SA缓冲液配制的10%压积SRBC和1 mL补体，混匀。另设不加血清的对照管（以SA缓冲液代替）。置于37 ℃恒温水浴中保温30 min 后，冰浴终止反应。用离心机2 000 r/min 离心10 min，取上清1mL，加都氏试剂3 mL。同时取0.25 mL 10%（V/V）压积SRBC，加入都氏试剂至体积为4 mL于另一试管中，充分混匀，放置10 min 后，于540 nm 处以对照管作空白，分别测定各管吸光度值（A）。以半数溶血值（half value of hemolysin，HC50）表示溶血素水平，按下式计算：
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验：实验前4 d给每只小鼠腹腔注20%的压积鸡红细胞悬液1 mL，间隔30 min，颈椎脱臼处死，仰位固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2 mL，转动鼠板1 min。取腹腔巨噬细胞洗液1 mL，滴于载玻片上，放入垫有湿纱巾的搪瓷盒内，置于37 ℃孵箱温育30 min。孵毕，于生理盐水中漂洗以除去未贴片细胞。晾干，以甲醇∶丙酮（1∶1）固定，4%Giemsa-磷酸缓冲液染色，用蒸馏水漂洗晾干。油镜下每片计数100个巨噬细胞，按下式计算吞噬百分率：
1.3.4 统计分析
采用SPSS 25.0统计软件包中多个样本比较的方法进行统计学分析，计量数均用平均数±标准差（x±s）表示，以P＜0.05为差异具有显著统计学意义。
2 结果与分析
2.1 缓解体力疲劳实验结果
2.1.1 含牡蛎肽保健酒对小鼠负重游泳时间的影响
含牡蛎肽保健酒对小鼠负重游泳时间的影响如图1所示。由图1可知，阴性对照组小鼠负重游泳时间为753 s，与空白对照组相比，无显著差异（P＞0.05）；低剂量组与阴性对照组相比，小鼠负重游泳时间显著提高（P＜0.05），为1415s；中剂量组与阴性对照组相比，小鼠负重游泳时间有所增加，为1 230 s，但是差异并不显著（P＞0.05）；高剂量组与阴性对照组相比，小鼠负重游泳时间有所降低，为736 s，差异不显著（P＞0.05）。综上所述，低剂量含牡蛎肽保健酒可以显著提高小鼠的负重游泳时间，具有缓解体力疲劳的效果。
图1 含牡蛎肽保健酒对小鼠负重游泳时间的影响
Fig.1 Effect of health care wine containing oyster peptide on the swimming periods of loading mice
“*”表示与阴性对照组相比，差异显著（P＜0.05）。下同。
2.1.2 含牡蛎肽保健酒对小鼠血清尿素含量的影响
机体在运动时，体内能量平衡遭到破坏，糖原被消耗，蛋白质及氨基酸的分解代谢被加强。尿素氮是蛋白质代谢的产物，在长时间较大强度的运动时，尿素氮变化范围明显，因此尿素氮与机体运动适应能力、疲劳程度以及负荷量的大小密切相关。含牡蛎肽保健酒对小鼠血清尿素含量的影响见图2。由图2可知，阴性对照组与空白对照组相比，小鼠血清尿素含量稍有增加，为9.53 mmol/L，但差异不显著（P＞0.05）；低剂量组和中剂量组与阴性对照组相比，小鼠血清尿素含量均显著降低（P＜0.05），分别为8.21 mmol/L和8.46 mmol/L；高剂量组与阴性对照组相比，小鼠血清尿素含量略有升高，平均为10.05 mmol/L，但差异不显著（P＞0.05）。综上所述，低剂量和中剂量的含牡蛎肽保健酒能减少疲劳小鼠血清尿素的产生。
图2 含牡蛎肽保健酒对小鼠血清尿素含量的影响
Fig.2 Effect of health care wine containing oyster peptide on blood urea nitrogen concentration in mice
2.1.3 含牡蛎肽保健酒对小鼠肝糖原含量的影响
糖是人体的主要供能物质，人体的糖主要是葡萄糖和糖原。糖原的耗竭会影响脑细胞功能，造成中枢疲劳、运动能力降低等，当体内糖的贮藏量增加，可以延缓上述现象的出现。因此，肝糖原含量是反映疲劳程度的敏感指标。含牡蛎肽保健酒对小鼠肝糖原含量的影响见图3。
图3 含牡蛎肽保健酒对小鼠肝糖原含量的影响
Fig.3 Effect of health care wine containing oyster peptide on liver glycogen concentration in mice
由图3可知，阴性对照组与空白对照组相比，小鼠肝糖原的含量无显著差异（P＞0.05）；低剂量组和中剂量组与阴性对照组相比，小鼠肝糖原的含量均有显著提高（P＜0.05），分别为4.31mg/g和3.62mg/g；高剂量组与阴性对照组相比，小鼠肝糖原的含量显著降低（P＜0.05），为2.91 mg/g。综上所述，低剂量和中剂量的含牡蛎肽保健酒对小鼠肝糖原的储备有促进作用，高剂量的金牡蛎保健酒对小鼠肝糖原的储备有抑制作用。
2.2 增强免疫力实验结果
2.2.1 含牡蛎肽保健酒对小鼠体质量和脏器的影响
含牡蛎肽保健酒对小鼠体质量的影响见图4。由图4可知，实验进行过程中，各剂量组小鼠精神状态良好，未见异常反应。空白对照组，低、中、高各剂量组与阴性对照组相比，小鼠体质量无显著差异（P＞0.05），表明含牡蛎肽保健酒和基酒均对小鼠的体质量无显著影响。
图4 含牡蛎肽保健酒对小鼠体质量的影响
Fig.4 Effect of health care wine containing oyster peptide on mice body mass
脾脏指数是反映机体免疫功能的重要指标。脾脏是最大的外周免疫器官，是B淋巴细胞成熟发育的场所。含牡蛎肽保健酒对小鼠脾脏指数的影响见图5。
图5 含牡蛎肽保健酒对小鼠脾脏指数的影响
Fig.5 Effect of health care wine containing oyster peptide on mice spleen index
由图5可知，阴性对照组与空白对照组相比，小鼠脾脏指数无显著差异（P＞0.05），表明基酒不会对小鼠脾脏产生损害；低剂量组和中剂量组与阴性对照组相比，小鼠的脾脏指数升高，分别为0.005 6和0.005 4，但无显著差异（P＞0.05）；高剂量组与阴性对照组相比，小鼠脾脏指数略有降低，但无显著差异（P＞0.05）。综上所述，低剂量和中剂量的含牡蛎肽保健酒可能对小鼠有提高免疫功能的作用。
肝脏是主要的酒精代谢器官，含牡蛎肽保健酒对小鼠肝脏指数的影响见图6。
图6 含牡蛎肽保健酒对小鼠肝脏指数的影响
Fig.6 Effect of health care wine containing oyster peptide on mice liver index
由图6可知，空白对照组，低、中、高各剂量组与阴性对照组相比，肝脏指数均无显著差异（P＞0.05），综上所述，含牡蛎肽保健酒对小鼠的肝脏无损害。
2.2.2 含牡蛎肽保健酒对小鼠细胞免疫的影响
T淋巴细胞是来源于骨髓多功能干细胞，该细胞进入胸腺以后，胸腺内发育成熟。T细胞受抗原物质刺激后能分化增殖、发生特异性免疫应答，是机体最重要的免疫效应细胞，T淋巴细胞增殖能力是反映机体细胞免疫的重要指标。含牡蛎肽保健酒对小鼠细胞免疫的影响见图7。
图7 含牡蛎肽保健酒对小鼠细胞免疫的影响
Fig.7 Effect of health care wine containing oyster peptide on mice cellular immunity
由图7可知，含牡蛎肽保健酒低剂量和中剂量组均能显著增加小鼠脾淋巴细胞的转化率（P＜0.05），分别为0.325和0.263；高剂量组小鼠脾淋巴细胞有所降低，为0.151，但差异不显著（P＞0.05）。综上所述，低剂量和中剂量的含牡蛎肽保健酒对于小鼠细胞免疫力有一定的提高作用。
2.2.3 含牡蛎肽保健酒对小鼠体液免疫的影响
含牡蛎肽保健酒对小鼠体液免疫的影响见图8。由图8可知，阴性对照组与空白对照组相比，小鼠的半数溶血值（HC50）没有显著差异（P＞0.05），为71.6；低剂量组和中剂量组与阴性对照组相比，均能显著提高小鼠的半数溶血值（P＜0.05），分别为100.2和85.6；高剂量组与阴性对照组相比，显著降低小鼠的半数溶血值（P＜0.05），为68.3。综上所述，低剂量和中剂量的含牡蛎肽保健酒对于小鼠体液免疫力有一定的提高作用，高剂量组对体液免疫有抑制作用。
图8 含牡蛎肽保健酒对小鼠体液免疫的影响
Fig.8 Effect of health care wine containing oyster peptide on mice humoral immunity
2.2.4 含牡蛎肽保健酒对小鼠单核—巨噬细胞的影响
单核—巨噬细胞既是效应细胞，又是免疫调节细胞。它是机体非特异性免疫系统的主要组成部分，当有异体抗原性物质侵入时，可引起巨噬细胞的聚集并吞噬，反映了机体非特异性免疫功能；同时也是特异性免疫系统中极重要的辅佐和效应细胞，在特异性免疫应答中，巨噬细胞可分泌释放多种细胞因子，参与免疫调节。含牡蛎肽保健酒对小鼠单核—巨噬细胞的影响见图9。
图9 含牡蛎肽保健酒对小鼠单核巨噬细胞的影响
Fig.9 Effect of health care wine containing oyster peptide on mice mononuclear macrophage
由图9可知，阴性对照组和空白对照组相比，小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力稍有降低，为31.2%，但无显著性差异（P＞0.05）；低、中剂量组与阴性对照组相比，小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力显著升高（P＜0.05），分别为57.2%和44.7%；高剂量组与阴性对照组相比，小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力显著降低（P＜0.05），为26.5%。综上所述，低剂量和中剂量的金牡蛎保健酒对于小鼠单核—巨噬细胞功能提高有一定作用，高剂量组对单核—巨噬细胞功能有抑制作用。
3 结论
本研究以实验室自制含牡蛎肽的保健酒为原料，依据《保健食品检验与评价技术规范》2003版的要求，对其缓解体力疲劳和增强免疫力两种功能进行评价。缓解体力疲劳功能实验结果显示，低剂量含牡蛎肽保健酒可以显著提高小鼠的负重游泳时间（P＜0.05）；低剂量和中剂量的含牡蛎肽保健酒能显著减少疲劳小鼠血清尿素的产生（P＜0.05）；低剂量和中剂量的含牡蛎肽保健酒对小鼠肝糖原的储备有显著促进作用（P＜0.05），高剂量的金牡蛎保健酒对小鼠肝糖原的储备有显著抑制作用（P＜0.05）。根据具有缓解体力疲劳功能作用的结果判定标准：负重游泳实验结果阳性，且血乳酸、血清尿素、肝糖原/肌糖原三项生化指标中任二项指标阳性，可判定受试具有缓解体力疲劳功能作用。由研究结果可判定含牡蛎肽保健酒具有缓解体力疲劳功能作用。增强免疫力功能试验结果显示，含牡蛎肽保健酒和基酒均对小鼠的体质量无显著影响（P＞0.05）；低剂量组，中剂量组和高剂量组与阴性对照组相比，小鼠的脾脏指数和肝脏指数无显著差异（P＞0.05）；低剂量和中剂量组均能显著增加小鼠脾淋巴细胞的转化率（P＜0.05）；低剂量组和中剂量组与阴性对照组相比均能显著提高小鼠的半数溶血值（P＜0.05），高剂量组显著降低小鼠的半数溶血值（P＜0.05）。根据具有增强免疫力功能作用的结果判定标准，在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有增强免疫力功能作用。由以上研究结果可判定含牡蛎肽保健酒具有增强免疫力功能作用。
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