益生菌是一类有益于宿主健康的活性微生物，能够定植在肠道内，具有改善宿主肠道微生态平衡、增强免疫力、延缓衰老及缓解乳糖不耐受等生理功能[1-3]，常见的益生菌有乳杆菌（Lactobacillus）、肠球菌（Enterococcus）和双歧杆菌（Bifidobacterium）等。双歧杆菌（Bifidobacterium sp.）是一类常用于食品添加的益生菌，其中的一些种对胃酸和胆汁盐有较好的耐受性，可有效补充肠道益生菌群，具有维护肠道生态平衡和促进人体健康的作用，被广泛应用于益生菌乳产品、食品添加剂及医药行业中[4]。
随着人们对益生菌的认识和需求的不断提高，学者们越来越关注于对益生菌益生特性的研究。研究结果表明，益生菌具有许多益生作用，如缓解便秘、抗氧化[5-7]、降低血清胆固醇[8-10]、增强人体免疫力[11]、抗糖尿病[12]、辅助缓解乳糖不耐受[13]、抗肥胖[14]、抗抑郁[15]、抗肿瘤[16]等。益生菌的应用对人类的健康具有重要的意义。
乳双歧杆菌具有调节肠道，促进肠道健康，提高免疫力，抑制有害菌生长的多种生理功能[17]，但具有较好的耐酸、耐胆盐等能力是其在肠道内发挥作用的基础。因此，本研究对从婴儿粪便中筛选分离的动物双歧杆菌乳亚种菌株HCS04-002的益生特性进行研究，为其在益生菌产品中的应用提供研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种
动物双歧杆菌乳亚种HCS04-002：筛选自2月龄健康顺产男婴粪便，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏编号为CGMCC No.19509）。
鼠李糖乳杆菌（LGG）、植物乳杆菌（vegestar2.0）：科汉森健康与营养部中国区；罗伊氏乳杆菌（LR92）：北京多爱特生物科技有限公司；乳双歧杆菌（BB-12）：北京中柏创业化工产品有限公司；干酪乳杆菌（LCZ）、瑞士乳杆菌（LH10）：北京柯拓恒通生物技术股份有限公司；嗜酸乳杆菌（NCFM）：上海秘蓝生物科技有限公司；发酵乳杆菌（CECT5716）：百施生物科技有限公司；嗜热链球菌（ST6）、唾液乳杆菌（LS86）：上海交大昂立股份有限公司；德氏乳杆菌保加利亚亚种（LB42）：江苏微康生物科技有限公司。
1.1.2 培养基
MRS液体培养基[18]：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，K2HPO4 2 g，柠檬酸氢二铵2 g，乙酸钠5 g，葡萄糖20 g，吐温80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.2～6.4，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。固体培养基中添加琼脂200 g。
动物双歧杆菌乳亚种固体培养基：酵母蛋白胨30 g/L，酵母粉20 g/L，葡萄糖25 g/L，低聚果糖5 g/L，L-苹果酸5 g/L，琼脂20 g/L，调pH值至7.2，115 ℃高压蒸汽灭菌30 min。液体培养基中不添加琼脂。
动物双歧杆菌乳亚种乳糖液体培养基：酵母蛋白胨30 g/L，酵母粉20 g/L，乳糖20 g/L，L-苹果酸5 g/L，调pH至7.2，115 ℃高压蒸汽灭菌30min。
甘油三酯培养基[19]：将2%的聚乙烯醇水溶液与植物油按体积比3∶1混合，用超声波处理（控制参数每次超声5 s，间隔时间5 s，共超声70次）后混合均匀制成植物油乳化液，作为甘油三酯的来源。将植物油乳化液按5%的比例加入到乳双歧杆菌培养基中，调pH值至7.2±0.2，115 ℃高压蒸汽灭菌30 min。
1.1.3 主要试剂
胆盐（色谱级）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；胃蛋白酶（酶活1 200万U/g）：北京奥博星生物技术有限责任公司；邻硝基酚（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；聚乙烯醇（分析纯）、无水碳酸钠（分析纯）、2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（2-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG）（分析纯）、磷酸二氢钾（分析纯）：中国医药集团总公司；甘油三酯试剂盒：南京建成生物试剂公司。
1.2 仪器与设备
DZKW-S-8电热恒温水浴锅、DHP-360/420电热恒温培养箱：北京市永光明医疗仪器厂；721型可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；XSP-10CA生物显微镜：上海佑科仪器仪表有限公司；SCIENTZ-ⅡD超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技有限公司；Multiskan FC酶标仪：美国赛默飞世尔科技有限公司；TGL-16M低温高速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；LAI-3DT厌氧工作站：上海龙跃仪器设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 耐酸试验
以pH为6.2～6.4的MRS液体培养基为空白对照，将传代三次的菌液（109 CFU/mL）按照10%（V/V）的接种量分别接种于pH分别为2.0、3.0的MRS液体培养基和空白对照培养基中，39 ℃条件下静置培养17 h，取样。用灭菌的生理盐水进行10倍系列稀释，分别取适宜稀释度的菌液1 000 μL移入无菌空平皿中，将冷却至48 ℃的MRS固体培养基倾注入平皿约15 mL，转动平皿使其混合均匀。每个稀释度2次重复，39 ℃静置培养48～72 h后，按照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》中的方法进行菌落计数，并计算存活率，其计算公式如下：
式中：N′为不同pH条件下的活菌数，CFU/mL；N0为空白对照的活菌数，CFU/mL。
1.3.2 耐胆盐试验
以不含牛胆盐的的MRS液体培养基为空白对照，将传代三次的菌液按照10%（V/V）的接种量分别接种于含有0.3%、0.5%、1.0%和1.5%牛胆盐的MRS液体培养基中，39 ℃条件下静置培养17 h，取样，测定活菌数，并计算存活率，其计算公式如下：
式中：N″为不同胆盐含量下的活菌数，CFU/mL；N0为空白对照的活菌数，CFU/mL。
1.3.3 模拟胃液试验
将传代三次的菌液振荡摇匀，取菌悬液10 mL离心（5 000×g、4 ℃、10 min）获得菌泥，用磷酸缓冲盐（phosphate buffer saline，PBS）溶液冲洗2次，获得的菌泥重悬于10 mL模拟胃液中，39 ℃条件下消化3 h，分别于0 h、3 h取样测活菌数，并计算存活率，其计算公式如下：
式中：N为在模拟胃液中消化0 h的活菌数，CFU/mL；N#为在模拟胃液中消化3 h后的活菌数，CFU/mL。
1.3.4 模拟肠液试验
将传代三次的菌液振荡摇匀，取菌悬液10 mL离心（5 000×g、5 ℃、10 min）获得菌泥，用PBS缓冲液冲洗2次，获得的菌泥重悬于10 mL人工肠液中，39 ℃条件下培养4 h，于0 h、2 h、4 h分别取样测活菌数，并计算存活率，其计算公式如下：
式中：N为在模拟肠液中消化0 h的活菌数，CFU/mL；N*为在模拟肠液中培养2 h、4 h后的活菌数，CFU/mL。
1.3.5 缓解乳糖不耐受功能试验
一级培养：取1环菌液于动物双歧杆菌乳亚种固体培养基平板划线，39 ℃条件下厌氧、静置培养48 h。
二级培养：将一级培养结束的单菌落接种至5 mL动物双歧杆菌乳亚种乳糖液体培养基中，39 ℃条件下厌氧、静置培养20 h。
三级培养：按照5%（V/V）的接种量，将二级培养结束的菌悬液接种至100 mL动物双歧杆菌乳亚种乳糖液体培养基中，39 ℃条件下厌氧、静置培养20 h。采用ONPG法测定β-半乳糖苷酶活力[20]。
β-半乳糖苷酶活力单位定义：在30 ℃每分钟水解释放1 μmol ONP所需的酶量为一个酶活力单位（U/mL）。
1.3.6 降甘油三酯体外试验
一级培养：取1环菌液于动物双歧杆菌乳亚种固体培养基平板划线，39 ℃条件下厌氧、静置培养48 h。
二级培养：将一级培养结束的单菌落接种至10 mL动物双歧杆菌乳亚种液体培养基中，39 ℃条件下厌氧、静置培养20 h。
三级培养：取10 mL二级种子液接种至200 mL动物双歧杆菌乳亚种液体培养基中，39 ℃条件下厌氧、静置培养17 h。
将三级培养的菌液以3%的接种量接种于100 mL甘油三酯培养基中，39 ℃条件下厌氧、静置培养24 h，采用甘油三酯试剂盒测定甘油三酯（triglyceride，TG）含量[21-22]。同时，以未接种菌液的甘油三酯培养基的TG含量为空白对照，计算菌株HCS04-002的TG降解率。
2 结果与分析
2.1 菌株HCS04-002的耐酸试验结果
菌株HCS04-002在pH 2.0和3.0条件下培养17 h后的活菌数及存活率见表1。
表1 菌株HCS04-002的耐酸试验结果
Table 1 Results of acid tolerance tests of strain HCS04-002
由表1可知，菌株HCS04-002在pH 3.0、39 ℃条件下培养17 h，活菌数相对于空白对照虽有下降，但活菌对数值仍维持在5.6以上，存活率达61.76%；在pH 2.0、39 ℃条件下培养17 h，活菌数相对于pH 3.0略有下降，活菌对数值降至5.47，存活率仍能达到60.11%。说明该菌株对酸环境具有一定的耐受能力。
2.2 菌株HCS04-002的耐胆盐试验结果
菌株HCS04-002经0.3%、0.5%、1.0%和1.5%牛胆盐处理17 h后的活菌数及存活率见表2。
表2 菌株HCS04-002的耐胆盐试验结果
Table 2 Results of bile salt tolerance tests of strain HCS04-002
由表2可知，随着牛胆盐含量的增加，菌株HCS04-002的存活率呈下降趋势，当牛胆盐含量达到1.5%时，存活率仍能达到72.64%，说明该菌株耐胆盐能力较强，有利于其在宿主肠道中的定植。
2.3 菌株HCS04-002的模拟胃液试验结果
菌株HCS04-002经模拟胃液处理3 h后的活菌数及存活率见表3。
表3 菌株HCS04-002模拟胃液试验结果
Table 3 Results of simulated gastric fluid tests of strain HCS04-002
由表3可知，菌株HCS04-002在模拟胃液中的存活能力较强，经模拟胃液处理3 h，存活率高达99.89%。
2.4 菌株HCS04-002的模拟肠液试验结果
菌株HCS04-002经模拟肠液处理一段时间后的活菌数及存活率见表4。
表4 菌株HCS04-002模拟肠液试验结果
Table 4 Results of simulated intestinal fluid tests of strain HCS04-002
由表4可知，随着处理时间的增加，活菌数对数值基本没有下降，存活率几乎达100.00%，说明该菌株在模拟肠液环境中存活能力非常强。
2.5 菌株HCS04-002缓解乳糖不耐受功能试验结果
菌株HCS04-002与部分商业菌株的β-半乳糖苷酶活力测定结果见表5。
β-半乳糖苷酶又称乳糖酶，能够催化β-D-半乳吡喃糖苷水解或者转糖基化[23]，水解乳制品中的乳糖，解决人们在饮用乳制品时出现的乳糖消化吸收差的问题。由表5可知，与现有部分商品菌株对照，菌株HCS04-002的β-半乳糖苷酶活力最高，为0.784 U/mL，比丹麦科汉森的动物双歧杆菌乳亚种BB-12提高了7%，比意大利萨科的罗伊氏乳杆菌LR92提高了57%。说明动物双歧杆菌乳亚种HCS04-002具有较好的乳糖酶活力，对缓解乳糖不耐受具有一定的作用。
表5 菌株HCS04-002的β-半乳糖苷酶活力测定结果
Table 5 Determination results of β-galactosidase activity of strain HCS04-002
2.6 菌株HCS04-002降甘油三酯体外试验结果
菌株HCS04-002与部分商业菌株的甘油三酯降解率测定结果见表6。
表6 菌株HCS04-002甘油三酯降解率测定结果
Table 6 Determination results of triglyceride degradation rate of strain HCS04-002
由表6可知，动物双歧杆菌乳亚种菌株HCS04-002的TG降解率最高，为43.0%，相比对照菌株中甘油三酯降解率最高的动物双歧杆菌乳亚种BB-12菌株，其TG降解率提高9%；相比植物乳杆菌vegestar 2.0，其TG降解率提高20%，说明该菌株具有较好的降解甘油三酯能力。
3 讨论
胃酸和胆盐具有抗菌作用，乳酸菌摄入人体内后，不仅要通过恶劣的胃液，还要抵抗来自胰腺的胆盐，能否耐受胃酸消化作用和胆盐环境并有一定数量活菌进入肠道粘附定植是其发挥益生作用的首要因素。因此，对酸和胆盐及胃肠液的耐受能力是评价益生菌功能性的重要指标。有报道指出，在pH3.0、胆盐0.3%环境下存活能力是衡量菌株耐受胃肠道的标准之一[24]。菌株动物双歧杆菌乳亚种HCS04-002经耐酸耐胆盐试验存活率仍在60%以上，在人工胃液和人工肠液中处理3 h，能保持99%以上的存活率，表明其能够有效穿过胃肠液发挥其益生作用。
乳糖不耐受是一个全球性问题，尤其在中国，是乳糖不耐受的高发地。乳糖在人体内无法被直接吸收，需经乳糖酶消化分解成葡萄糖和半乳糖才能够被人体吸收[25]。人体中乳糖酶的活性和分泌量受多种继发性因素的影响，导致人体无法消化乳制品中的乳糖，部分患者出现腹痛、胀气和腹泻等消化不良症状，因此乳糖酶制剂将不断被乳糖不耐受人群所了解并普及应用。本试验中动物双歧杆菌乳亚种菌株HCS04-002具有0.784 U/mL的β-半乳糖苷酶活力，有望应用于乳糖酶制剂产品中，为解决乳糖不耐受问题提供更多选择。
本试验动物双歧杆菌乳亚种菌株HCS04-002还具有一定的甘油三酯降解能力。世界贸易组织（world trade organization，WTO）预测，到2030年心血管疾病将是导致死亡的主要原因，影响全世界约2.36亿人们的健康[26]。甘油三酯是人体内含量最多的脂类，大部分组织均可以利用甘油三酯分解产物供给能量。但如果甘油三酯过量，则可造成动脉硬化、冠心病、心梗、脑卒等，与正常血脂水平人群相比，高血脂人群具有高出3倍的心脏病诱发风险。利用菌株HCS04-002的甘油三酯降解能力，可应用于降血脂保健药品及功能食品的制备。
4 结论
动物双歧杆菌乳亚种HCS04-002具有良好的耐逆环境能力，能够在pH2.0、胆盐1.5%的严苛条件下保持较高的存活率；能够耐受人工胃液和人工肠液的作用，以较高的存活率进入肠道有效发挥益生作用；具有较高的乳糖酶活力，对乳糖不耐受具有缓解作用；具有甘油三酯降解功能，在降血脂产品方面有一定的应用前景。
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