鸡腿菇（Coprinus comatus）学名毛头鬼伞，其肉质细腻可口，营养丰富，具有低脂、低糖、高蛋白的特性。鸡腿菇还属药食同源类食用菌，具有抗氧化、降血糖、降血脂、提高免疫力等功效[1-2]。利用鸡腿菇的营养功能进行产品开发，提供消费者欢迎的鸡腿菇系列功能性产品，有重要的实践意义。
目前，国内外对于鸡腿菇的研究主要集中在栽培方式[3-4]、多糖的液态发酵工艺[5-6]以及多糖的分离纯化[7-8]等方面。为了满足人们对健康营养的饮食要求，科研人员对鸡腿菇深加工产品进行了研究，如王林山[9]利用乳杆菌和链球菌对鸡腿菇进行发酵制成鸡腿菇酸奶；邵伟等[10]以马铃薯为主要原料，经过鸡腿菇发酵、酒精发酵和醋酸发酵等多步生产出鸡腿菇醋；兰蓉等[11]以鸡腿菇为主要原料，采用发酵法生产鸡腿菇酒。上述研究都仅对工艺进行探讨，但对产品的功效鲜有报道。
本研究以鸡腿菇鲜品为主要原料，基于山西老陈醋基本工艺酿制鸡腿菇醋，对鸡腿菇醋酿制过程中多糖、总黄酮和总酚的动态变化进行研究，通过测定各阶段样品对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率进行体外降血糖能力的评价，揭示鸡腿菇醋发酵过程中功效成分及其体外降血糖功效的动态变化，为改进酿制工艺、提高醋品质提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鸡腿菇：山西晋中市太谷县；高粱、大曲和谷糠：山西省晋中市榆次区某醋厂；麸皮、稻壳：安徽省寿县；安琪酿酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；芦丁标准品（纯度＞98%）、福林酚试剂（分析纯）：北京索莱宝生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶（酶活100 U/g）、α-淀粉酶（酶活3 700 U/g）和4-对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）：上海伊卡生物技术有限公司；NaCl（分析纯）、可溶性淀粉、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）、没食子酸（分析纯）、无水碳酸钠（分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylicacid，DNS）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
SpectraMax i3x酶标仪：美谷分子仪器（上海）有限公司；722可见光分光光度计、FA224电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；Starter 2C pH计：奥豪斯仪器（上海）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 鸡腿菇醋加工工艺流程
1.3.2 操作要点
鸡腿菇浆的制备：挑选品质良好的新鲜鸡腿菇，清洗干净并切片，放入打浆机中打浆，加入纤维素酶（酶用量为2 800 U/g）和蛋白酶（酶用量为3 200 U/g）进行酶解处理得到鸡腿菇浆。
高粱润料：称取高粱和鸡腿菇，两者质量比为7∶3。将高粱浸于水（高粱质量的60%）中12 h，使得高粱充分吸水，利于后期蒸煮糊化。
高粱糊化、液化：润料结束后加入高粱质量的3.4倍水开始升温糊化，升温至60 ℃时加入耐高温α-淀粉酶（用量为900 U/g），目的是水解高粱中淀粉内部的α-1,4葡萄糖苷键，使得胶状高粱淀粉溶液的黏度迅速下降，产生糊精。继续升温至沸腾10 min后停止加热。
高粱糖化：待温度降至60 ℃时加入糖化酶（酶用量为3 200 U/g），它能水解α-1,4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解α-1,6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖，同时也能水解糊精释放葡萄糖。温度降至30 ℃时加入大曲，用量为高粱质量的62.5%。
酒化发酵：将酵母菌接入高粱糖化醪中，接种量为5%，前3 d敞口发酵，早晚各搅拌一次，3 d后加入鸡腿菇浆混合均匀封口进行无氧发酵，每天测定酒精度，酒化时间约8～9 d酒精度升至7%vol～9%vol且不再升高时酒化结束。
拌辅料：称取90%麸皮，46.8%谷糠，23.3%稻壳（以高粱质量为准）且混合均匀，多次少量地拌入酒醪中。
醋化发酵：待醋醅酸度约为5 g/100 mL且不再升高时醋化结束。
熏醅：将60%的醋醅在90 ℃条件下进行熏醅5 d，此时醋醅在高温作用下发生美拉德反应，产生大量的香味物质，其余的白醅压实表面撒食盐，保证其不发生变质。
淋醋：先用高粱质量8倍的热水淋白醅，得到白醋。白醋浸泡熏醅5 h淋出鸡腿菇醋。
澄清：采用硅藻土-壳聚糖（1∶1）复合澄清剂，添加量为0.7 g/100 mL，澄清温度为38 ℃，澄清时间为35 min。
灭菌、灌装：于121 ℃灭菌15min，无菌灌装于玻璃瓶中，得到鸡腿菇醋。
1.3.3 取样
将酵母菌接入高粱糖化醪时计作样品J0；酒化发酵时间为9 d，隔天取样，计作样品J1～J9；将辅料拌入酒化醪时计作样品C0；醋化发酵时间为9 d，隔天取样，计作样品C1～C9；熏醅时间为5 d，隔天取样，计作X1～X5；浸淋得到的鸡腿菇醋计作样品C。
1.3.4 分析检测
（1）理化指标
酒精度：比重计法；还原糖、总酸、总酯、氨基酸态氮、不挥发酸、总黄酮：参照GB/T 19777—2003《地理标志产品山西老陈醋》[12]测定。芦丁标准曲线回归方程为：y=0.246 3x+0.003 8，相关系数R2=0.997 4。按照标准曲线回归方程计算样品中总黄酮含量。
（2）多糖含量
多糖含量测定采用苯酚-硫酸法[13]。取10 mg样品，加100 mL水，85 ℃提取3次，每次5 h。过滤合并滤液浓缩至40 mL，加入4倍体积分数为95%乙醇醇沉过夜。离心过滤取沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，于55 ℃条件下真空干燥，得粗多糖，将其加水溶解至100 mL，用苯酚-硫酸法进行测定多糖含量。
（3）总酚含量
总酚含量测定采用Folin-Ciocalteau法[14]。以没食子酸标准品质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制没食子酸标准曲线，得到回归方程为：y=0.035 8x+0.010 8，相关系数R2=0.998 6。按照标准曲线回归方程计算样品中总酚含量。
（4）α-葡萄糖苷酶抑制率
参照饶炎炎等[15]的方法并加以改进。先将不同阶段的样品进行稀释处理，稀释倍数为20倍。用0.1 mol/L，pH 6.8磷酸盐缓冲溶液配制α-葡萄糖苷酶溶液（1 U/mL）和PNPG溶液（10 mg/mL）。在37 ℃条件下孵育α-葡萄糖苷酶（50 μL）和样品（100 μL）的混合物15 min使酶活化后，加入PNPG溶液50 μL，充分混匀后于37 ℃温育10 min，加入0.1 mol/L的Na2CO3溶液100 μL终止反应，于波长405 nm处测定吸光度值，同时设定相同体系下去离子水代替α-葡萄糖苷酶溶液为样品对照组、去离子水代替样品溶液为空白对照组，α-葡萄糖苷酶的抑制率计算公式如下：
（5）α-淀粉酶抑制率的测定
参照饶炎炎等[15]的方法并加以改进。将不同阶段的样品稀释20倍处理。用0.1 mol/L，pH 6.8磷酸盐缓冲溶液配制α-淀粉酶溶液（1 U/mL）和1.0%的可溶性淀粉溶液。在37 ℃条件下孵育α-淀粉酶溶液（50 μL）和样品（100 μL）的混合物15 min使酶活化后，加入可溶性淀粉溶液50 μL，充分混匀后于37 ℃温育10 min，加入1 mol/L的DNS溶液5 μL显色，沸水浴灭酶10 min后冷却至室温，定容至10 mL后于波长540 nm处测定吸光度值，样品对照组、空白对照组和α-淀粉酶的抑制率按公式均与α-葡萄糖苷酶的测定一致。
1.3.4 数据处理
采用Excel 2019进行录入、计算实验数据，采用Origin 8.0软件作图，SPSS 22.0软件进行数据处理。
2 结果与分析
2.1 鸡腿菇醋发酵过程中降糖因子的动态变化
2.1.1 多糖的变化
多糖广泛存在于动物细胞膜、植物和微生物细胞壁，具有免疫调节和降血糖等功效[16]。对食醋品质如滋味、香味和功效有重要作用[17]。鸡腿菇醋发酵过程中多糖的变化结果见图1。
图1 鸡腿菇醋发酵过程中多糖含量变化
Fig.1 Change of polysaccharide contents in Coprinus comatus vinegar during fermentation process
由图1可知，酒化发酵阶段多糖含量呈不断增加的趋势，酒化1～3 d多糖含量增加显著（P＜0.05），酒化结束时多糖含量为（6.77±0.038）mg/mL，多糖主要来源于鸡腿菇、高粱和大曲等原料，酒化第3天加入酶解鸡腿菇浆，鸡腿菇浆多糖含量为6.23 g/100 g，所以此时多糖含量显著上升（P＜0.05），酒化阶段产生的大量乙醇将原料中的多糖物质持续溶解出来[18]。在醋化阶段，醋醅中多糖含量呈缓慢减少的趋势，醋化结束时多糖含量为（4.257±0.025）mg/mL。这是由于多糖在酸性条件下不稳定造成的。熏醅阶段多糖含量稍有回升后趋于平稳，原因在于高温有助于多糖分子的向外扩散，多糖在高温下进一步从物料中溶出[19]。鸡腿菇醋中多糖含量为（5.073±0.090）mg/mL，与刚加入鸡腿菇的酒醪（J3）相比，鸡腿菇醋多糖含量保留了94%。这表明多糖在鸡腿菇醋酿制过程中有一定的损失，但损失量小。
2.1.2 总黄酮的变化
黄酮类物质是一类重要的生物活性物质，具有抗氧化、降血糖、抗菌抗炎等药理作用[20]。鸡腿菇醋发酵过程中总黄酮的变化结果见图2。由图2可知，在酒化发酵阶段，总黄酮含量呈先增加后减少的趋势，在酒化第3天，总黄酮含量最高为（244.51±3.927）mg/100 g。前3 d总黄酮增加的原因是存在于原料中的黄酮物质在酒化发酵进行中随着碳源物质的消耗被释放出来[21]。大曲中的微生物生长代谢产生的代谢物也是使得黄酮增长的原因之一。酒化第4～9天黄酮含量呈减少趋势，这与闫霞等[22]对山西陈醋抗氧化物质含量分析基本一致。酒化前3 d处于发酵的旺盛期，原料中大部分黄酮类物质已基本溶出，后期溶出率降低。黄酮类化合物可能有部分转化为了其他酚类物质，故总黄酮含量有所下降。醋化发酵前3 d总黄酮含量有一定的增长，后期趋于平稳。醋化拌入的麸皮谷糠等辅料中含有黄酮类物质[23]，醋酸菌的生长代谢促使黄酮的释放，使得黄酮含量上升，黄酮类物质得到有效积累。熏醅阶段总黄酮含量呈上升趋势，熏醅结束时其含量为（226.820±0.997）mg/100 g，醋中黄酮含量为（232.923±2.376）mg/100 g。可能是因为熏醅是加热的过程，醋醅中水分会大量蒸发，总黄酮含量得到浓缩；加热过程中微生物破裂溶解，胞内物质也会释放黄酮类物质[24]。总的看来，黄酮物质在鸡腿菇醋的酿制过程中得到有效积累。
图2 鸡腿菇醋发酵过程中总黄酮含量变化
Fig.2 Change of total flavonoids contents in Coprinus comatus vinegar during fermentation process
2.1.3 总酚的变化
酚类物质具有抗氧化和抗诱导有机体突变等作用，可赋予食醋醇厚、丰满的口感，提高醋的抗氧化能力。鸡腿菇醋发酵过程中总酚的变化结果见图3。由图3可知，酒化阶段总酚含量呈逐渐上升的趋势，酒化结束时总酚含量为（0.8±0.017）mg/mL，增量显著（P＜0.05）。原因是在酒化过程中不断产生的酒精和二氧化碳将原料中的酚类物质大量释放出来[25]。醋化阶段总酚呈现先增加后降低并逐渐趋于平稳的趋势，在第3天达到最大值，总酚含量为（1.453±0.015）mg/mL。总酚含量在醋化发酵前3 d有所增加，其原因在于微生物等的生长代谢使得辅料中的酚类物质得到释放[26]，之后总酚含量降低并趋于平稳的原因是有氧发酵过程中多酚发生氧化并且部分多酚与单宁物质结合。熏醅阶段总酚含量呈上升趋势，熏醅结束时其含量为（1.757±0.012）mg/mL，鸡腿菇醋总酚含量为（1.73±0.01）mg/mL。总酚含量在该阶段有所增加的原因在于熏醅阶段温度升高，水分蒸发，总酚得到了浓缩。综上所述，总酚含量在鸡腿菇醋酿制过程中得到了积累。
图3 鸡腿菇醋发酵过程中总酚含量变化
Fig.3 Change of total phenols contents in Coprinus comatus vinegar during fermentation process
2.2 鸡腿菇醋发酵过程中α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率的的动态变化
鸡腿菇醋发酵过程中α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率的变化结果见图4。
图4 鸡腿菇醋发酵过程中α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率变化
Fig.4 Change of inhibition rate of α-glucosidase and α-amylase in Coprinus comatus vinegar during fermentation process
由图4可知，鸡腿菇醋发酵过程中α-葡萄糖苷酶抑制率呈先上升后下降再上升的趋势，α-淀粉酶抑制率呈先上升后趋于平稳的趋势。高粱糖化醪（J0）的α-葡萄糖苷酶抑制率为（72.1±1.3）%。酒化发酵1～3 d，α-葡萄糖苷酶抑制率呈上升趋势，由（82.2±1.2）%上升至（87.9±1.2）%，酒化第3～9天，α-葡萄糖苷酶抑制率逐步降低。α-淀粉酶抑制率在酒化阶段呈上升趋势，由（73.7±1.4）%上升至（74.6±0.6）%。醋化和熏醅阶段，两种酶抑制率均呈上升趋势，这可能与鸡腿菇醋发酵过程中功能成分的消长有相关性。最终形成的鸡腿菇醋α-葡萄糖苷酶抑制率为（95.8±1.0）%；α-淀粉酶抑制率为（94.3±1.4）%。与高粱糖化醪（J0）和刚加入鸡腿菇的酒醪（J3）相比，降血糖功效有一定的提升。
2.3 鸡腿菇醋活性成分与降血糖功效的相关性分析
由表1可知，α-葡萄糖苷酶抑制率与总黄酮极显著相关（P＜0.01），与总酚显著相关（P＜0.05）。α-葡萄糖苷酶抑制率与多糖呈较低的相关性，可能是因为多糖和蛋白质等功能成分都对α-葡萄糖苷酶有抑制性，同时抑制性有协同作用[27]。α-淀粉酶抑制率与总酚极显著相关（P＜0.01），与多糖显著相关（P＜0.05），总黄酮对α-淀粉酶抑制率的贡献率最小。
表1 鸡腿菇醋活性成分与降血糖功效的相关性
Table 1 Correlation between the active components of Coprinus comatus vinegar and its hypoglycemic effect
注：“*”表示显著相关（P＜0.05）；“**”表示极显著相关（P＜0.01）。
2.4 理化指标
对鸡腿菇醋的各项理化指标进行测定，结果见表2。由表2可知，鸡腿菇的各项理化指标均达到国标GB 18187—2000《酿造食醋》[28]的要求。鸡腿菇醋总酯含量为（3.752±0.032）g/100 mL，高于林汲等[29]测定的三种品牌老陈醋总酯含量。氨基酸态氮含量为（0.294±0.012）g/100 mL，说明鸡腿菇的蛋白质和氨基酸有效转移入鸡腿菇醋中，不但增加了鸡腿菇醋的营养，而且起到了提鲜增香的效果。还原糖含量为（2.15±0.015）g/100 mL，糖类物质与食醋的风味和营养价值密切相关，为食醋增甜增鲜[30]。不挥发酸的含量为（1.426±0.011）g/100 mL，不挥发酸可较好地缓解挥发酸带来的刺激性，使得食醋的酸味柔和、绵长，对食醋的风味具有重要意义[31]。
表2 鸡腿菇醋理化指标测定结果
Table 2 Determination results of physicochemical indexes of Coprinus comatus vinegar g/100 mL
3 结论
以鸡腿菇鲜品为主要原料酿制鸡腿菇醋，其各项理化指标均达到GB 18187—2000《酿造食醋》的要求；鸡腿菇醋酿制过程中多糖含量和总黄酮含量呈先上升后下降的趋势，总酚呈逐渐上升的趋势，α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率呈先上升后下降的趋势，其中多糖在酒化结束时达到最大值，含量为（6.77±0.038）mg/mL；总黄酮在醋化第3天达到最大值，含量为（244.51±3.927）mg/100 g；总酚在熏醅结束时达到最大值，含量为（1.757±0.012）mg/mL。α-葡萄糖苷酶抑制率在鸡腿菇醋中达到最大值为（95.8±1.0）%，α-淀粉酶抑制率在醋化结束时达到最大值为（86.4±1.1）%。鸡腿菇醋中多糖、总黄酮、总酚含量分别为（5.073±0.090）mg/mL、（232.92±2.37）mg/100 g、（1.730±0.010）mg/mL，α-淀粉酶抑制率为（84.3±1.4）%。由此看来，以上三种功能成分较好地保留于鸡腿菇醋中，与酶解后的鸡腿菇浆相比降血糖功效有一定的提升。
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