郫县豆瓣酱是一种传统调味料，在中国已有几百年的历史，在川渝地区被人们称之为“川菜之魂”[1]。传统郫县豆瓣酱仅使用四川、贵州等地的二荆条辣椒，而且整个发酵周期较长，导致产量较低，无法满足火锅、菜肴烹饪等产业的需求[2]。因此原料多样、发酵周期较短的新型豆瓣酱（俗称红油豆瓣、火锅豆瓣）应运而生，但不同品种辣椒原料的品质差异较大[3-4]，导致豆瓣酱的品质不稳定。
目前对豆瓣酱的研究主要集中在工艺条件[5]、内源性危害物[6]、菌种筛选[2]、特征风味[7]等领域，而对不同品种辣椒发酵豆瓣酱的研究鲜有报道。近年来，品种适应性研究已在其他体系中有所报道。叶子等[8]比较云南9个品种小米椒的品质特性筛选出了最具适应性的加工辣椒品种，有助于发酵小米椒品质的改善。孙小静等[9]研究贵州6种辣椒的各项指标在发酵中的变化情况，选出了最适合辣椒酱发酵的优质辣椒品种。李信等[10]比较不同大米酿造香醋的有机酸、氨基酸和挥发性物质含量后发现糯米酿造的香醋风味品质更佳。
本研究以常用的三种辣椒品种（二荆条、美国红和千斤红）为原料，采用分光光度法、反相色谱法、气相色谱-质谱法和阳离子交换色谱法分别考察了相同的工艺条件下制备新型豆瓣酱发酵前后的色泽、辣度、挥发性物质、有机酸、辣椒碱、氨基酸和辣椒红素等品质指标的变化。基于高效液相色谱、气相色谱-质谱联用和光谱等技术解析辣椒品种对豆瓣酱品质的影响规律，为规范生产奠定技术基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
辣椒醅：自然发酵3个月的二荆条、美国红和千斤红椒醅；蚕豆瓣：保温发酵3个月的瓣醅；均由四川省郫县豆瓣股份有限公司提供。
辣椒红色素标准品（纯度＞95%）：法国Extrasynthese公司；辣椒素、二氢辣椒素、草酸、柠檬酸、酒石酸、L-苹果酸、琥珀酸、乳酸、L-焦谷氨酸、辛酸甲酯（纯度均＞95%）：美国Sigma公司。
1.2 仪器与设备
Trace 1300-TSQ 9000气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）仪（配备VF-WAX-MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国Thermo Fisher Electron公司；1260高效液相色谱仪（配备UV/Vis 检测器和反向C18柱（150 mm×4.6 mm×5 μm）以及Alltech OA-1000有机酸柱（300 mm×7.8 mm））：美国Agilent 公司；A300氨基酸分析仪：德国membraPure GmbH公司；TU-1901紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；CM-5分光测色计：日本konicaminotia公司；C18固相萃取柱（solidphaseextraction，SPE）：成都思为科学仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 豆瓣酱的制备
辣椒采集后经清洗、切割、拌盐后，置于条池中自然发酵，前一个月每1 d翻醅一次，后两个月每3 d翻醅一次，发酵3个月即可得到辣椒醅（混椒醅以1∶1比例混合）；蚕豆瓣经98 ℃漂烫2～3 min，沥干冷却后，拌入小麦粉和米曲霉3.042，加入盐水后，置于40～45 ℃保温池发酵，类似于瓣子的翻醅工艺，发酵3个月后得到瓣醅。辣椒醅与瓣醅以4∶1混合均匀，将混合醅置于40 kg不锈钢桶中进行后发酵，装入40 kg的不锈钢桶，采用传统日晒夜露的发酵工艺，前期（1个月）每3 d翻坯1次，后期隔15 d翻坯1次，发酵期间维持水分＞51%，发酵5个月得到成熟豆瓣酱[7，11]。样品信息及编号如表1所示。
表1 样品信息及编号
Table 1 Information and number of samples
1.3.2 分析检测
（1）理化指标
氨基酸态氮（amino nitrogen，AN）、总酸（total acid，TA）：参照FENG J等[12]所述方法测定；水分含量：采用国标GB/T 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》第一法中的直接干燥法测定；氯化物含量：采用硝酸银滴定法[13]。
（2）非挥发性物质
辣椒红素：参照韩晓岚等[14]方法，稍作修改；色度参考叶子等[8]方法检测了豆瓣酱的明亮亮度L*值、红绿度a*值和黄蓝度b*值，并根据L*值、a*值和b*值计算色差ΔE*（ΔE*=
，其中“1”和“0”分别表示发酵前和发酵后的样品。）和代表含色多少的饱和度C值（C=
）；斯科维尔指数（scovill heat units，SHU）、天然辣椒碱、二氢辣椒碱及总辣椒碱含量：参照国标GB/T 21266—2007《辣椒及辣椒制品中辣椒素类物质测定及辣度表示方法》；有机酸含量：参照COCCHI M等[15]所述方法略修改；游离氨基酸（free amino acids，FAA）含量：参考CUI R等[16]所述方法。
（3）挥发性物质
参考ZHANG L等[17]所述方法，稍作修改。称取2.000 g样品置于15 mL萃取瓶中，加入20 μL内标后，放入60 ℃水浴中预热15 min，插入萃取头（50/30 μm DVB/CAR/PDM）留置50 min后，取出插入GC-MS进样口解吸5 min后检测。
GC条件：进样口温度为270 ℃，升温程序：40 ℃保持5 min，以4 ℃/min升至100 ℃，然后6 ℃/min升至230 ℃保持10 min。载气为高纯氦气（He）（纯度≥99.99%），流速为1 mL/min，不分流模式。
质谱条件：离子源温度300 ℃，传输线温度250 ℃；电离方式为电子电离（electronicionization，EI）源，电子能量70 eV，质量扫描范围35～400 u。
定性定量方法：通过将它们的质谱与美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）05文库数据库（Finnigan Co.USA）中的质谱进行比较来鉴定每种挥发性化合物。根据它们的相似性（＞800）来记录化合物。通过GC总离子色谱图上与内标的峰面积比计算挥发物的相对量。
1.3.3 数据处理
数据以平均数±标准偏差的形式表示（n=3）。本研究采用Origin 9.0为作图软件；使用SPSS 24.0软件单因素方差分析（One-way ANOVA）中的Duncan's 功能进行显著性分析（P＜0.05）；使用SIMCA 14.1对多项指标进行偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）。
2 结果与分析
2.1 主要理化指标变化
如表2所示，不同品种辣椒单独、混合制备豆瓣酱的理化指标均符合国标GB/T 20560—2006《地理标志产品郫县豆瓣》。辣椒品种对豆瓣酱的水分和氯化物含量影响不明显，而显著影响TA、AN的含量。美国红豆瓣酱的TA和二荆条豆瓣酱的AN含量突出，且发酵后优势地位不变，分别为（2.41±0.00）g/100 g和（0.68±0.00）g/100 g。并且，发酵过程中因微生物代谢活动以及蛋白质的分解导致豆瓣酱的TA、AN含量增加[18-19]。发酵后，二荆条与美国红混椒豆瓣酱结合了各自单椒的优点，使这两个指标在所有豆瓣酱中含量最高，分别是（2.78±0.01）g/100 g和（0.87±0.00）g/100 g。
表2 不同品种辣椒制备豆瓣酱发酵前后的主要理化指标变化
Table 2 Changes in main physical and chemical indexes of Doubanjiang produced by different varieties of pepper before and after fermentation
注：不同字母代表差异显著（P＜0.05）；理化指标均以干质量计。
2.2 色度及辣度变化
发酵前后豆瓣酱的颜色指标如图1a～1c所示，发酵后所有豆瓣酱的L*值和C值均有不同程度的下降使色泽变暗淡，其中二荆条和美国红的ΔE*值高于6.00，呈现肉眼可见的变化，且后者变化最明显[8]。混椒的ΔE*均较低，发酵对色泽的影响相对较小。豆瓣中的红色素主要为辣椒红素[20]。如图1d所示，发酵前单椒的含量差异显著，二荆条的辣椒红素含量最高，颜色最红，发酵后弱化了该指标的差异。千斤红单椒和二荆条与美国红混椒的含量增加可能是类胡萝卜素间的生物合成与降解过程的竞争以及与色素之间的转化反应有关[21-23]。如图1e～1h所示，单椒豆瓣酱间的辣度差异显著，发酵后美国红的总辣椒碱含量显著降低了29.73%，而二荆条和千斤红的含量仅略有变化，总辣椒素含量为二荆条（0.387±0.023）g/kg＞美国红（0.261±0.022）g/kg＞千斤红（0.176±0.01）g/kg。混椒中和了不同品种的辣椒碱，使低辣度增加，高辣度减弱，风味更柔和。混椒的总辣椒碱含量为EM＞EQ＞MQ。
图1 不同品种辣椒制备豆瓣酱发酵前后色度及辣度指标的变化
Fig.1 Changes in chromaticity and pungency degree indexes of Doubanjiang produced by different varieties of pepper before and after fermentation
不同字母代表差异显著（P＜0.05），下同。■初始豆瓣，
发酵豆瓣。
2.3 有机酸和氨基酸
如图2a所示，美国红、千斤红和二荆条初始豆瓣酱，分别以琥珀酸、柠檬酸、乳酸为优势酸。发酵后，有机酸含量增加，千斤红含量最高为（50.12±0.17）g/kg（以干基计），与初始豆瓣酱明显聚为不同两簇，但相应单椒豆瓣酱所属的优势酸未改变。这可能与原料中有机酸的差异有关，也可能是原料差异导致部分微生物代谢差异有关[10]。混椒各有机酸含量介于相应单椒之间，综合了单椒的优势酸。如二荆条与美国红混椒结合了二荆条的乳酸和美国红的琥珀酸，乳酸使豆瓣酱风味柔和，而琥珀酸增加了豆瓣酱的鲜味[20]。混椒豆瓣酱中，二荆条与千斤红混椒的有机酸含量最高。
图2 不同品种辣椒制备豆瓣酱发酵前后有机酸（a）和氨基酸（b）变化
Fig.2 Changes in organic acids (a) and amino acids (b) of Doubanjiang produced by different varieties of pepper before and after fermentation
如图2b所示，美国红和千斤红因脯氨酸、天冬酰胺和苯丙氨酸含量较高，而与二荆条聚在不同亚簇。发酵后，酵母的自溶和蛋白质水解导致FAA（除甲硫氨酸）增加[19]，其中美国红增长至含量最高（37.31±0.45）g/kg，与其他单椒豆瓣酱显著分开。天冬氨酸、天冬酰胺等多种FAA在美国红豆瓣酱中呈现出较高优势，而脯氨酸和谷氨酸在千斤红中较高。谷氨酸和天冬氨酸的风味阈值较低（分别是0.3 mg/g和1.0 mg/g），对风味贡献大[19]，且是豆瓣酱的优势组分，比例为25.58%～28.54%，类似YANG M等[1]研究结果。
混椒中EM-1和EQ-1的FAA含量较高，因脯氨酸的差异分在不同亚簇。MQ-1的FAA含量较低可能是美国红与千斤红的混合影响了微生物群落改变了发酵规律[20]。
2.4 挥发性风味物质
如图3a所示，二荆条、美国红和千斤红的初始豆瓣酱挥发性成分的含量和组分因品种而异，分别是（10.21±1.64）mg/kg（85种）、（12.23±2.51）mg/kg（137种）和（4.20±0.68）mg/kg（142种）。发酵后，美国红含量增加了16.50%，而二荆条和千斤红分别降低了29.44%和13.71%，含量的差异显著增加。单椒豆瓣酱由发酵前的54种共有组分增加到了69种，千斤红的共有组分占总挥发性的比例由发酵前的66.48%增至82.72%，发酵驱动豆瓣酱的风味轮廓更相似。如图3b所示，根据挥发性组分的阈值[1，20]，有13种共有物质香味活性值（odor activity value，OAV）＞1。其中愈创木酚、2-乙酰基吡咯等10种组分在美国红中强度较高，而二荆条和千斤红仅分别以芳樟醇和2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯较为显著。这些组分是传统发酵调味品（如豆瓣酱[7，24]、酱油[18]和香醋[10]等）的特征香气物质。
图3 不同品种辣椒制备豆瓣酱发酵前后挥发性组分含量变化（a）及共有组分（b）
Fig.3 Changes in volatile components contents (a) and common constituents (b) of Doubanjiang produced by different varieties of pepper before and after fermentation
二荆条、美国红和千斤红的特异性检出物质分别有25、18和34种，比例为2.7%、6.02%和9.8%。3-辛酮和戊酸乙酯提高了二荆条豆瓣酱的蘑菇香和果香[1]；糠醇在美国红中检出，可由美拉德反应生成，但因阈值较高，风味贡献度较低[27]。丁酸乙酯赋予了千斤红豆瓣酱水果香味[1]。
混椒豆瓣酱发酵前后的挥发性组分含量介于相应单椒之间。EM-1的含量最高且共有组分与单椒中风味较优的M-1聚为同一亚簇，还富有2-甲基丁酸乙酯和β-紫罗兰酮，因此风味在混椒中最优。混椒豆瓣酱还兼有单椒的风味物质，EM-1、EQ-1和MQ-1分别有18种、24种、26种来自相应单椒的特有组分。如EM-1既有来自二荆条的L-岩藻糖又有美国红的3-辛醇。类似的，EQ-1既有戊酸乙酯又有丁酸乙酯，MQ-1既有β-紫罗兰醇又有β-石竹烯。这些物质使混椒豆瓣酱的香味更加多样。
2.5 多元数据分析
为了综合分析辣椒品种、复配辣椒以及发酵对豆瓣酱品质的影响。联合OAV＞1的香味物质以及其他所有指标建立模型，其中R2X、R2Y和Q2值分别表示PLS-DA模型在X轴和Y轴方向的累积解释率和模型的预测能力，这些指标越接近1表示模型拟合数据效果越好，R2X、R2Y和Q2值分别为0.988、0.966和0.823，表明模型可靠。如图4所示，单椒豆瓣酱中，千斤红与另两者分为不同象限，差异较大。混椒豆瓣酱发酵前后均在对应单椒豆瓣之间，豆瓣酱间的差距缩小，品质差异缩小；其中MQ-1与千斤红较为接近，EM-1与美国红较为接近，品质类似。风味组分（如苯乙醛、2,3-丁二醇和多种游离氨基酸、有机酸）均在发酵后的美国红单椒豆瓣酱以及二荆条与美国红混椒豆瓣酱中明显较高，表明其风味突出。
图4 不同品种辣椒制备豆瓣酱发酵前后品质指标的偏最小二乘法判别分析
Fig.4 Partial least squares-discriminant analysis of quality indexes of Doubanjiang produced by different varieties of pepper before and after fermentation
25种代谢物的变量投影重要性分析值（variable importance for the projection，VIP）＞1,2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、壬醛、正癸醛、愈创木酚和辣椒碱等12个指标集中于发酵前的豆瓣酱中，而4-乙基愈创木酚、2-乙酰基吡咯、β-紫罗兰酮、乳酸、多种氨基酸、氨基酸态氮等13种物质为发酵后豆瓣酱的特征指标。呈香特征由花果香、草木香转变为酱香和紫罗兰花香[7]；在呈味特征趋于圆润及鲜甜味增加[19，24]；并且作为豆瓣酱分级指标（GB/T 20560—2006《地理标志产品郫县豆瓣》）的AN增加，均达到一级水平。
3 结论
从理化指标、色泽、辣度、有机酸、氨基酸和风味组分综合分析了不同辣椒豆瓣酱发酵前后的品质差异。结果表明，辣椒品种对豆瓣酱的品质影响显著。发酵后，豆瓣酱呈味的有机酸和氨基酸增加；色泽变暗、辣度降低、风味相似度增加。多元分析结果表明，发酵减弱了品种带入的品质差异，驱使品质趋于稳定。美国红单椒豆瓣酱的风味较好，二荆条单椒豆瓣酱的辣度和色泽较优。二者的混配综合了单椒豆瓣酱的风味特点，风味多样性增加并且AN和TA较高、色泽变化小、辣度柔和。因此，混椒缩小了豆瓣酱间的差异，该种混合方式更适合新型豆瓣酱的生产。
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