冠突散囊菌（Eurotiunm cristatum）属于发菌科散囊菌属，长期以来一直被认定为评价茯砖茶品质的标准。与其他种类的茶相比，以冠突散囊菌为主要微生物的茯砖茶具有更多独特的风味和功效[1-2]。除茯砖茶外，冠突散囊菌广泛存在于康砖茶、绿茶、六宝茶、虫草、土壤和木片[3-4]。
冠突散囊菌多糖和次生代谢产物具有良好的免疫增强活性、抗氧化活性和抗肿瘤活性[5]。由于具有易于培养和快速繁殖的特性，冠突散囊菌已成为重要的益生菌。近年来，冠突散囊菌的潜在药用和抗菌特性已成为研究热点。为了进一步开发冠突散囊菌的生物活性，冠突散囊菌与其他菌种共同发酵产物的研究也得到进一步研究。研究表明，混合发酵体系可以产生丰富的次级代谢产物，增加产物香气，而这些代谢产物很难通过单一真菌发酵获得[6-7]。冠突散囊菌与黑曲霉（Aspergillus niger）共同发酵可显着改善绿茶的品质[8]，与金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）共同发酵产生的次生代谢产物可显著抑制肝癌细胞和乳腺癌细胞的生长[9]。
因此，本研究将冠突散囊菌与木霉混合发酵，通过不同体积分数的乙醇对混合发酵液化学活性部位进行追踪，并结合液质联用技术对活性部位化合物组成进行分析，通过四氮甲基唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法、中性红吞噬实验及酶联免疫吸附测定方法分别研究冠突散囊菌与木霉混合发酵液活性部位对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖、吞噬以及分泌细胞因子的能力的影响，评价其是否具有良好的免疫调节功能。为进一步挖掘冠突散囊菌的生物活性，制备安全价格低廉的免疫调节剂提供了参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株与试剂
冠突散囊菌（Eurotiunm cristatum）、木霉菌株（Tricho derma sp.）：清华大学工程物理系粒子技术与辐射成像教育部重点实验室；小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞株：国家实验细胞资源共享平台；胎牛血清：以色列BI公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、MTT、脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）（源自大肠杆菌）、芦丁、没食子酸、福林酚、碳酸钠、无水葡萄糖、硫酸、苯酚：美国Sigma公司；二辛可宁酸（bicinchonininc acid，BCA）试剂盒、一氧化氮（NO）检测试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司；内毒素检测试剂盒、小鼠白细胞介素6酶联免疫吸附检测试剂盒（mouse interleukin-6 enzyme-linked immunosorbent assaykit，Mouse IL-6 ELISA Kit）、小鼠肿瘤坏死因子-α酶联免疫吸附检测试剂盒（mouse tumor necrosis factor-α enzyme-linked immunosorbent assay kit，Mouse TNF-α ELISA Kit）。所用试剂均为分析纯。
1.1.2 培养基
杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）：以色列BI公司。
液体发酵培养基[10]：葡萄糖50 g/L、蛋白胨2.5 g/L、KH2PO4 3 g/L、MgSO4·7H2O 0.15 g/L、FeSO4·7H2O 0.25 g/L、维生素B 0.11 g/L，调节液体发酵培养基的pH值至6.0，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。
1.2 仪器与设备
Varioskan Flash多功能酶标仪、HERAcell细胞培养箱：美国Thermo公司；Venticell强对流精密烘箱：德国MMM公司；HZQ-F100恒温振荡培养箱：北京天林恒泰科技有限公司；UV-1780紫外可见分光光度计：日本岛津公司；TH4-200型倒置显微镜：美国OLYMPUS公司；SVE-4A1垂直流超净工作台：新加坡ESCO公司；Ultimate 3000/Q-Exactive超高效液相色谱-质谱联用（ultra-high performance liquid chromatographymass spectrum，UHPLC-MS）仪：美国Thermo Fisher公司。
1.3 方法
1.3.1 冠突散囊菌与木霉分别发酵和深层混合发酵
将冠突散囊菌、木霉和混合菌株分别以1×106个/mL接种于液体发酵培养基中，装液量为100 mL，于28 ℃、200 r/min条件下发酵8 d（D8）、10 d（D10）、12 d（D12）及14 d（D14）时收集样品，取1 mL发酵液置于2 mL离心管中，置于55 ℃恒温强对流精密烘箱至干燥，备用。
1.3.2 冠突散囊菌与木霉混合发酵液与单菌发酵液免疫活性比较
将冠突散囊菌与木霉的混合发酵液及单菌发酵液分别用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）稀释至2 mg/mL，采用MTT法[11]检测不同样品对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖率的影响。将小鼠巨噬细胞RAW264.7以1×106个/mL的密度接种于96孔板中，每孔接种200 μL，在37 ℃，5% CO2细胞培养箱中培养24 h。调零组不接种细胞，阴性对照组每孔加PBS溶液20 μL，阳性对照组每孔加2.5 μg/mL LPS，实验组每孔给药质量浓度为200 μg/mL。培养24 h后，每孔加入10 μL质量浓度为5 mg/mL的MTT溶液，置于37 ℃，4 h后弃上清液，并加入100 μL DMSO溶液，振荡5 min后，置于波长570 nm处测定吸光度值，计算细胞增值率，其计算公式如下：
式中：A是实验组或阳性对照组吸光度值；B是阴性对照组吸光度值；C是调0组吸光度值。
1.3.3 冠突散囊菌与木霉混合发酵液免疫活性物质的分离
称取10 g冠突散囊菌与木霉混合发酵液干燥后的粉末以1∶10（g∶mL）的料液比加入水，充分溶解后分别加入体积分数分别为70%和90%的乙醇，充分振荡30 min，分别收集乙醇层样品和不溶于乙醇的沉淀，蒸发干燥。其中由体积分数70%乙醇沉淀的样品标记为ETW1，体积分数90%乙醇沉淀的样品标记为ETW2，体积分数70%乙醇提取的样品标记为ETE1，体积分数90%乙醇提取的样品标记为ETE2。分别取样品ETW1、ETW2、ETE1、ETE2 2 mg加PBS溶液配置成质量浓度为2 mg/mL的溶液。采用MTT法检测不同样品对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖率的影响，对样品的免疫活性进行筛选。
1.3.4 冠突散囊菌与木霉混合发酵液醇提物化学成分分析
总糖含量：采用硫酸-苯酚法检测[12]；总蛋白含量：采用二辛可宁酸（bicinchonininc acid，BCA）试剂盒检测；总多酚含量：采用福林酚比色法检测[13]；总黄酮含量：采用分光光度法检测[14]；活性成分采用UHPLC-MS分析[15]。
1.3.5 冠突散囊菌与木霉混合发酵液醇提物内毒素的检测
为避免热原对结果的影响，通过内毒素检测试剂盒对冠突散囊菌与木霉混合发酵液醇提物及LPS中的热原进行检测。
1.3.6 冠突散囊菌与木霉混合发酵液醇提物对RAW264.7细胞增殖能力的影响
取处于对数生长期、细胞形态呈不规则圆形的RAW264.7细胞，以1×106个/mL的细胞密度，每孔200 μL接种于96孔板上，在37 ℃的细胞培养箱中培养24 h后，分别加入20 mL PBS溶液（阴性对照组），100 μg/mL、300 μg/mL、500 μg/mL的冠突散囊菌与木霉混合发酵液醇提物，2.5 μg/mL LPS（阳性对照组），每组设6个重复。24 h后弃上清液，采用MTT法测定冠突散囊菌与木霉混合发酵液醇提物对RAW264.7细胞增殖能力的影响。
1.3.7 冠突散囊菌与木霉混合发酵液醇提物对RAW264.7细胞吞噬中性红的影响
取处于对数生长期、细胞形态呈不规则圆形的RAW264.7细胞，用吸管将细胞轻轻吹落，以5×105个/mL的细胞密度，每孔100 μL接种于96孔板上，在37 ℃的细胞培养箱中培养24 h后，分别加入20 mL PBS溶液，100 μg/mL、300 μg/mL、500 μg/mL的冠突散囊菌与木霉混合发酵液醇提物，2.5 μg/mL LPS，每组设6个重复。24 h后弃上清液，向每孔中加入100 μL 0.1%的中性红溶液，培养1 h后，弃中性红溶液，PBS缓冲液冲洗3次后，向每孔加入100 μL由无水乙醇和冰醋酸体积比为1∶1配制的细胞裂解液静置1.5 h，在波长540 nm处用酶标仪检测样品吸光度值[16]。
1.3.8 冠突散囊菌与木霉混合发酵液醇提物对RAW264.7细胞分泌NO、IL-6、TNF-α的影响
取对数生长期、细胞形态呈不规则圆形的RAW264.7细胞，以5×105个/mL的细胞密度接种于96孔板，每孔接种100 μL，在37 ℃的细胞培养箱中培养24 h后，分别加入20 μL PBS溶液，100 μg/mL、300 μg/mL、500 μg/mL的冠突散囊菌与木霉混合发酵液醇提物，2.5 μg/mL LPS，每组设6个重复。24 h后取不同体积的细胞上清液，采用Griess试剂盒[17]和ELISA试剂盒[18]根据试剂盒说明书进行检测。
1.3.9 数据统计与分析
实验结果用“平均值±标准差”表示，数据采用SPSS20.0软件统计分析，显著水平差异表现为P＜0.05，极显著水平差异为P＜0.01。
2 结果与分析
2.1 冠突散囊菌与木霉混合发酵液与单菌发酵液免疫活性
发酵8 d时，冠突散囊菌与木霉混合发酵液与单菌发酵液对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖能力的影响见表1。
由表1可知，与阴性对照组比较，阳性对照组对小鼠RAW264.7细胞的增殖有极显著的促进作用，增殖率达30.60%；发酵8 d时，木霉发酵液对小鼠RAW264.7细胞的增殖具有微弱的促进作用，增殖率达到5.74%；冠突散囊菌发酵液对小鼠RAW264.7细胞也有一定促进作用，增殖率达到17.31%；但两菌混合发酵后其混合发酵液对小鼠RAW264.7细胞增殖效果最好，增殖率达59.51%。
表1 冠突散囊菌与木霉混合发酵液及单菌发酵液对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖能力的影响
Table 1 Effect of Eurotiunm cristatum and Trichoderma sp.co-fermentation liquid and single strain fermentation liquid on the proliferation rate of mouse macrophages RAW264.7
注：与阴性对照组比较，“*”表示差异显著（P＜0.05），“**”表示差异极显著（P＜0.01）。下同。
研究不同发酵时间冠突散囊菌与木霉混合发酵液对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖能力的影响，结果见表2。
表2 不同发酵时间冠突散囊菌与木霉混合发酵液对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖能力的影响
Table 2 Effect of Eurotiunm cristatum and Trichoderma co-fermentation liquid with different fermentation time on the proliferation rate of mouse macrophages RAW264.7
由表2可知，与阴性对照组相比，冠突散囊菌与木霉的混合发酵液对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖有促进作用，且随着发酵时间的延长，小鼠巨噬细胞RAW264.7的增殖率呈下降趋势。当发酵第8天时，小鼠巨噬细胞RAW264.7的增殖率最高，为59.51%，说明冠突散囊菌与木霉混合发酵液对巨噬细胞有激活作用，且发酵第8天时，激活作用最好。
2.2 冠突散囊菌与木霉混合发酵液免疫活性物质的分离与分析
对冠突散囊菌与木霉混合发酵的产物进行免疫活性追踪研究，结果见表3。由表3可知，阳性对照组小鼠巨噬细胞RAW264.7的增殖率为30.60%，冠突散囊菌与木霉混合发酵液各分离组分中，小鼠巨噬细胞RAW264.7的增殖率均显著高于阴性对照组，其中ETE1组，小鼠巨噬细胞RAW264.7的增殖率最高，达到47.39%，说明各分离组分对小鼠巨噬细胞RAW264.7有很好的激活作用，其中体积分数70%乙醇提取物激活细胞作用最好，对其进行进一步研究。
表3 冠突散囊菌与木霉混合发酵液不同体积分数乙醇分离成分对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖率的影响
Table 3 Effect of different volume fraction ethanol isolation components of Eurotiunm cristatum and Trichoderma co-fermentation liquid on proliferation rate of mouse macrophages RAW264.7
分别利用硫酸-苯酚法、BCA法、福林酚法、分光光度法对ETE1分离组分中的总糖、总蛋白、总多酚、总黄酮含量进行检测分析，结果见表4。
表4 ETE1分离组分中化学成分的分析
Table 4 Analysis of chemical compositions in isolation component ETE1
由表4可知，在ETE1分离组分中，总蛋白（0.04 mg/g）和总多酚（31.41 μg/g）含量较高，总黄酮（0.08 μg/g）和总糖（0.13 mg/g）含量较低，黄酮类化合物属于多酚类化合物[19]。由于真菌混合发酵液成分复杂，UHPLC-MS联用技术能够在缺少标准品的条件下，对单组分进行定性分析。因此，采用该技术对真菌混合发酵液进行进一步分析，UHPLC-MS总离子流色谱图见图1。
图1 ETE1分离组分超高液相色谱与质谱联用分析总离子流色谱图
Fig.1 Total ions chromatogram of isolation component ETE1 analyzed by UHPLC-MS
由图1可知，通过UHPLC-MS联用技术检测出了保留时间为1.523min、16.615 min、17.061min、18.547 min、18.904 min、21.733 min、22.06 min、36.194 min、49.649 min的强峰。根据Compound Discover 3.1.0.305和mzcloud和mzVault数据库比对结果分析得到相关化合物信息，结果见表5。由表5可知，从ETE1分离组分中检测出了5-羟甲基糠醛、生物素、麦芽酚、3-羟基苯甲酸、2,6-二甲基-γ-吡喃酮、二苄胺、芥子碱、大黄素、十三吗啉。其中大黄素是常见的中药活性成分，具有广泛的药理作用如抗炎，抗肿瘤，抗细菌等[20]。芥子碱为常见的天然抗氧化剂，具有抗炎的作用，常见于十字花科药用植物[21]。
表5 ETE1分离组分UHPLC-MS分析结果
Table 5 Analysis results of isolation component ETE1 by UHPLC-MS
2.3 ETE1分离组分中内毒素的检测
细菌内毒素存在于革兰氏阴性菌的外壁，主要成分为脂多糖，是菌体中存在的毒性物质，具有致热性也称为“热原”，内毒素能够导致巨噬细胞的激活[22]，如果样品中含有热原，会在一定程度上影响实验结果，为了避免热原对实验结果的影响，本研究利用显色鲎试剂盒对ETE1分离组分中的内毒素含量进行检测，结果见表6。由表6可知，质量浓度为0.01 μg/mL的LPS中内毒素含量为（1.36±0.35）EU/mL，是质量浓度为1000μg/mL的ETE1分离组分[（0.39±0.01）EU/mL]的3倍，由此可知，ETE1分离组分对于巨噬细胞的增殖作用不是因为热原引起的，对小鼠巨噬细胞RAW264.7有良好的激活作用。
表6 ETE1分离组分中内毒素含量检测结果
Table 6 Determination results of endotoxin content in isolation component ETE1
2.4 ETE1分离组分对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖的影响
有关巨噬细胞防御的研究对于先天免疫和适应性免疫很重要。巨噬细胞分布在人体的各个器官和组织上，在人体不同的微环境中显示出明显的功能差异[23]。本实验通过MTT 法研究不同质量浓度ETE1 对小鼠巨噬细胞RAW264.7的增殖作用，结果见图2。由图2可知，与阴性对照组相比，阳性对照组、不同质量浓度的ETE1分离组分对小鼠巨噬细胞RAW264.7的增殖均具有极显著的促进作用（P＜0.01），且随着ETE1质量浓度的升高，促进作用越好。
图2 不同质量浓度的ETE1对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖能力的影响
Fig.2 Effect of different mass concentrations of ETE1 on the proliferation rate of mouse macrophages RAW264.7
2.5 ETE1分离组分对小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬能力的影响
巨噬细胞对异物的吞噬能力，也一定程度上反应了巨噬细胞的活力[24]。巨噬细胞在外界异物刺激后进入活化状态，激活的巨噬细胞胞饮作用速度也进一步增加[25]。中性红是一种碱性染色剂，能够被巨噬细胞摄入，通过测量吞噬中性红后裂解的巨噬细胞的吸光度值，对巨噬细胞的吞噬能力进行评价[26]。不同质量浓度的ETE1对吞噬中性红后巨噬细胞RAW264.7形态的影响见图3，对巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红能力的影响见图4。
由图3可知，随着ETE1质量浓度的升高，小鼠RAW264.8细胞的分化程度逐渐加强，形变程度增加。由图4可知，与阴性对照组相比，阳性对照组及不同质量浓度的ETE1（除500 μg/mL）均可显著促进小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红能力（P＜0.05）。且除质量浓度500 μg/mL，随着ETE1质量浓度的升高，促进作用越好。
图3 不同质量浓度的ETE1对吞噬中性红后小鼠巨噬细胞RAW264.7形态的影响
Fig.3 Effect of different concentrations of ETE1 on the morphology of mouse macrophages RAW264.7 after phagocytosis of neutral red
图4 不同质量浓度的ETE1对小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红能力的影响
Fig.4 Effect of different concentrations of ETE1 on the phagocytosis of neutral red in mouse macrophages RAW264.7
2.6 ETE1分离组分对小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌NO、TNF-α及IL-6能力的影响
活化的巨噬细胞能够通过释放一氧化氮（NO）对病原体进行抑制，有一定的杀菌作用[27]。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）TNF-α属于单核因子主要由巨噬细胞产生，对癌变的细胞和被病毒感染的细胞由细胞毒作用，能够正向调节吞噬细胞的吞噬作用，增强巨噬细胞的胞饮能力，能够增强淋巴细胞对外界病原微生物的响应[28]。白介素（interleukin，IL）IL-6）是由多种免疫细胞产生，介导白细胞发挥作用，促进B细胞分化的一类细胞因子[29]。不同质量浓度的ETE1对小鼠巨噬细胞分泌NO、TNF-α及IL-6的影响见图5。由图5可知，与阴性对照组相比，阳性对照组及不同质量浓度的ETE1能显著促进小鼠细胞分泌NO、TNF-α及IL-6的能力（P＜0.01），且随着ETE1质量浓度的升高，NO、TNF-α及IL-6的分泌量越来越高，但均低于阳性对照组。SCHEPETKIN I A等[30]研究发现，具有多重药理活性的杜松能够促进TNF-α、IL-6的分泌，由此推测ETE1也可能具有一定的药理活性。
图5 不同质量浓度的ETE1对小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌NO（A）、TNF-α（B）及IL-6（C）能力的影响
Fig.5 Effect of different concentrations of ETE1 on NO（A），TNF-α（B）and IL-6（C）secretion ability of mouse macrophages RAW 264.7
3 结论
将冠突散囊菌与木霉共同发酵，采用体积分数为70%乙醇提取的部位有较好的免疫活性，通过UHPLC-MS联用技术分析，该部位含有大黄素、芥子碱等生物活性成分。通过四氮甲基唑蓝（MTT）比色法、中性红吞噬实验及酶联免疫吸附测定方法分别研究冠突散囊菌与木霉混合发酵液活性部位对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖、吞噬以及分泌细胞因子的能力的影响。结果表明，与阳性对照组脂多糖相比，500 μg/mL冠突散囊菌与木霉混合发酵液的体积分数70%乙醇提物能够使小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖率提高12%，增强小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红的能力，并能促进NO及细胞因子IL-6、TNF-α的分泌。
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