啤酒与黄酒、葡萄酒并称为世界三大古酒，其生命周期已经延续数千年[1]。随着啤酒工业的发展，现代啤酒因酿造工艺及生产菌株的差异，主要分为Ale啤酒（上面发酵啤酒）和Lager啤酒（下面发酵啤酒）[2]。与Ale啤酒相比，Lager啤酒的发酵温度较低、周期较长；不仅具有绵密丰富的气泡和清爽纯净的风味；而且酒体品质更均一、工业生产成本更低[3]。因此，Lager啤酒以其淡爽的风味和稳定的品质深受消费者的青睐，逐步替代Ale啤酒成为现代工业啤酒的主流产品[4]。啤酒中常见的挥发性风味化合物包括醇类、酯类、醛类、酮类、酸类等，其成分和含量不仅决定了啤酒的风味，一定程度上也影响了啤酒的品质[5]。近年来随着消费者对啤酒品质和风味的要求越来越高，如何保持和改善啤酒的风味，成为诸多生产企业普遍关注的焦点[6]。
大麦是酿造啤酒的主要原料。大麦芽作为“啤酒的骨架”，其品质缺陷会直接造成糖化、过滤的异常，降低生产效率，增加产品成本[7]。因此，麦芽的成分和质量关乎啤酒风味和品质。同时，近年来伴随着中国啤酒产量的显著增加，原产大麦的品质和产量却逐年降低，加剧了国内啤酒行业对高品质原料的需求[8]。而关于麦芽对啤酒品质影响的研究，目前主要集中在β-葡聚糖[9]、蛋白质[10]等成分的分析和浸麦度、发芽温度等制麦工艺的优化[11]等方面，关于酿造原料的比较和选择相对较少。
为从源头监控啤酒生产，通过实验室啤酒模拟体系，探究3种不同种类麦芽的品质及其对啤酒质量和酿造风味的影响。通过测定多种麦芽的浸出率、α-氨基酸态氮、糖化力、库尔巴哈值等品质指标及所酿啤酒的酒精度、原麦汁浓度等理化指标，并采用顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）和气相色谱质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法分析其香气成分的差异性，最终选出适合啤酒发酵的麦芽品种，以期酿造出高品质的Lager啤酒，为其工业化生产提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Lager 497：本实验室保藏。
1.1.2 化学试剂
酵母粉、蛋白胨、琼脂粉（均为生化试剂）：生工生物工程（上海）股份有限公司；无水葡萄糖、碘、碘化钾（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；3-庚酮（色谱纯）：美国Sigma-Aldrich公司；英国麦芽（Eng）、加拿大麦芽（Can）、德国麦芽（Ger）、捷克SAAZ酒花：进口市售。
1.1.3 培养基
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，无水葡萄糖20 g/L，115 ℃灭菌20 min。
麦汁培养基：自制麦汁，105 ℃灭菌10 min。
1.2 仪器与设备
DLEUW22050麦芽粉碎机：瑞士Buhler-Miag公司；BGT-8A协定糖化仪：杭州博日科技股份有限公司；Trace1310-ISQ LT气相色谱质谱联用仪、TG-WAXMS A色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）、TriPlus RSH自动顶空进样器、固相微萃取纤维头（50/30 μm DVB/Carboxen/PDMS）：美国Thermo Scientific公司。
1.3 试验方法
1.3.1 实验室Lager啤酒发酵模拟体系的建立
称量并粉碎适量麦芽，加水糖化，趁热过滤糖化醪。煮沸60 min，期间添加适量啤酒花。二次过滤，调节麦汁浓度，获得澄清麦汁。分装、灭菌备用。将酵母活化扩培后接入无菌麦汁培养基，静置发酵数天。
糖化：45 ℃时，将麦芽粉粒与水按1∶5（g∶mL）混合均匀，置于BGT-8A协定糖化仪。随后，升温至48 ℃，保温30 min；15 min内升温至63 ℃，保温40 min；快速升温至72 ℃，保温20 min；待碘液检验反应液呈黄色，糖化基本接近终点。升温至78℃，保温10 min彻底糖化。趁热过滤糖化醪，获得“头号麦汁”；再用适量78 ℃热水洗涤滤纸，获得“二滤麦汁”[12]。
煮沸：煮沸60 min，分批添加酒花（0.25‰）。趁热过滤，阿贝折光仪测定麦汁浓度并调至12°P，获得澄清麦汁。105 ℃灭菌10 min，冷却分装。
酵母活化扩培：挑取单菌落接入1 mL麦汁培养基中，25 ℃，220 r/min培养12 h；将上述菌液转接入9 mL麦汁培养基中，20 ℃、220 r/min培养12 h；再将上述10 mL菌液转接入90 mL麦汁培养基中，15 ℃、220 r/min培养12 h。静置，取酵泥接种于麦汁培养基（1×106 CFU/mL）。摇匀后扣上发酵栓，无菌水密封[13]。
实验室模拟发酵：12 ℃静置培养8 d。当发酵液糖度为4°Bx左右时，前酵结束。4 ℃静置发酵7 d，至酒体中无明显双乙酰气味时，发酵成熟，后酵结束[14]。
1.3.2 麦芽品质指标检测方法
取适量麦芽，依据轻工行业标准QB/T 1686—2008《啤酒麦芽》中分析方法进行浸出率、α-氨基酸态氮、糖化力和库尔巴哈值（又称库值）等麦芽品质指标的测定。
1.3.3 啤酒理化指标检测方法
后酵结束时取样检测，依据国标GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》进行酒精度、原麦汁浓度等啤酒理化指标的测定。
1.3.4 啤酒风味物质气相色谱-质谱检测方法
（1）色谱条件
气相色谱条件：TG-WAXMS A色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），升温程序为40 ℃保持1 min，以3 ℃/min升温至180 ℃，继续以20 ℃/min升温至230 ℃，保持15 min。汽化室温度250 ℃，载气为高纯氦气（纯度＞99.99%），载气流量1.0 mL/min，不分流进样，溶剂延迟时间1 min。质谱条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，电子能量70 eV，发射电流34.6 μA，接口温度280 ℃，质量扫描范围29～500 amu。
（2）样品制备
取7.5 mL啤酒样品于20 mL顶空进样瓶中，加入0.5 mL的3-庚酮内标溶液（0.3 mg/L），加密封垫、铝盖压紧。将固相微萃取手柄插入顶空瓶，伸出萃取头。60 ℃水浴保温，顶空吸附40 min；退回萃取头，插入GC进样口解吸5 min[15]。
（3）定性定量分析
通过GC-MS分析检测得出啤酒风味物质的总离子流图，采用美国国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NIST）2014标准质谱库检索，结合保留指数（retention index，RI）对发酵液中的挥发性风味成分进行定性，采用峰面积归一化法进行定量分析[16]。
2 结果与分析
2.1 不同种类麦芽的主要品质指标
2.1.1 不同种类麦芽的库值
啤酒麦芽的库尔巴哈值主要反映了制麦过程中麦芽蛋白质的溶解程度，保持在40%～45%为佳[17-18]。三种不同种类的麦芽中，麦芽Can和Ger的库值适中，分别为45%和40%；而麦芽Eng的库值含量偏高（50%），三者间均存在显著性差异（P＜0.05）。
图1 不同种类麦芽的库尔巴哈值
Fig.1 Kolbach indexes of different types of malts
不同字母表示不同麦芽之间差异显著（P＜0.05）。下同。
2.1.2 不同种类麦芽的糖化力
糖化力又称淀粉糖化酶活性，淀粉酶活性越大，糖化力值越高，麦芽质量越好[19]。麦芽糖化力是以100 g无水麦芽在20 ℃，pH 4.3条件下分解可溶性淀粉30 min产生1 g麦芽糖为一个唯科（WK）糖化力单位。依据QB/T 1686—2008《啤酒麦芽》中的分析方法，3种麦芽样品的糖化力分别为357 WK、414 WK和392 WK，均显著高于优级标准（＞260 WK），三者无显著性差异（P＞0.05）。
图2 不同种类麦芽的糖化力
Fig.2 Saccharifying power of different types of malts
2.1.3 不同种类麦芽的浸出率及α-氨基酸态氮
麦芽浸出率一定程度上反映了大麦籽粒发芽过程中干物质的损耗。依据QB/T 1686—2008《啤酒麦芽》的分析方法，不同种类麦芽的浸出率测定结果见图3。由图3可知，麦芽Ger的浸出率（以干基计）≥79%，属优级淡色麦芽；麦芽Can的浸出率（以干基计）≥77%，属一级；麦芽Eng的浸出率（以干基计）≥75%，属二级。
图3 不同种类麦芽的浸出率及α-氨基酸态氮含量
Fig.3 Extract rate and α-amino acid nitrogen contents of different types of malts
α-氨基酸态氮反映了麦芽中蛋白质的分解程度及蛋白酶活性，决定了制麦过程中啤酒的品质和风味。一般工业生产要求发芽过程中麦汁α-氨基酸态氮的含量应＞160 mg/L，控制在180～220 mg/L左右为宜。由图3可知，不同种类的麦芽样品中，除麦芽Ger的α-氨基酸态氮含量较为适中（186 mg/L），麦芽Eng和Can的α-氨基酸态氮含量均偏低，分别为125 mg/L和118 mg/L。
2.2 麦芽种类对啤酒发酵液理化指标的影响
2.2.1 麦芽种类对啤酒发酵液酒精度及原麦汁浓度的影响
比较3种不同种类麦芽酿造的啤酒酒精度及原麦汁浓度，结果见图4。
图4 麦芽种类对Lager啤酒酒精度及原麦汁浓度的影响
Fig.4 Effect of different types of malts on alcohol content and original wort concentration of Lager beer
啤酒酿造过程中，酵母吸收代谢麦汁中的多种可发酵性糖，最终生成乙醇和CO2[20]。由图4可知，3种麦芽发酵制得的啤酒中，Can麦芽的产酒能力最佳，酒精度达2.97%vol；Eng麦芽次之，酒精度为2.91%vol；酒样Ger的酒精度显著低于Eng和Can酒样的酒精度（2.19%vol）（P＜0.05）。
原麦汁浓度指原麦汁中浸出物的百分含量，啤酒的酒精度越高，原麦汁浓度也越高[21]。由图4可知，酒样Ger的原麦汁浓度偏低（7.56°P），稳定性差，保存期较短；酒样Eng和Can的原麦汁浓度适中（分别为8.55°P和8.63°P），酒体口感浓郁，品质也较好。
2.2.2 麦芽种类对啤酒发酵液浓度及发酵度的影响
啤酒浓度指成品啤酒或发酵液中所含浸出物（糖分、氨基酸及其他可溶性有机物、无机物）的质量百分数，包括外观浓度和实际浓度[22]。其中，外观浓度是指用糖度计直接测定发酵液或啤酒中的浓度，而实际浓度为发酵液蒸馏出酒精后再次测定的浓度。
发酵度是指酵母消耗原麦汁浸出物的所占百分比，作为判断发酵是否异常的重要指标，可分为外观发酵度和真正发酵度。简单来说，采用外观浓度计算所得为外观发酵度，而用实际浓度计算所得为实际发酵度（又称真正发酵度）[23]。一般情况下，外观发酵度高于实际发酵度。比较3种不同种类麦芽酿造的啤酒浓度及发酵度，结果见图5。
图5 麦芽种类对Lager啤酒浓度（A）及发酵度（B）的影响
Fig.5 Effect of different types of malts on the concentration (A) and fermentation degree (B) of Lager beer
由图5A可知，3种麦芽酿造的啤酒中，酒样Ger的实际浓度（3.22%）最高，与酒样Eng和Can均存在显著性差异（P＜0.05），酒样Eng和Can无显著性差异（P＞0.05）。3种麦芽酿造的啤酒中，酒样Ger的外观浓度（1.64%）最高，与酒样Eng无显著性差异（P＞0.05）；酒样Can的外观浓度最低，与其余酒样存在显著性差异（P＜0.05）。相较Eng啤酒和Ger啤酒，Can啤酒中浸出物含量偏低，口感更清爽不甜腻。
由图5B可知，3种麦芽所酿造啤酒中，酒样Eng和Can的实际发酵度相对较高，分别为67.21%和67.97%，二者无显著性差异（P＞0.05）；酒样Ger的实际发酵度最低（57.44%），与其余酒样均存在显著性差异（P＜0.05）。3种麦芽所酿造啤酒中，酒样Can的外观发酵度最高（86.41%），酒样Eng次之（81.21%），酒样Ger最低（78.30%），彼此间均存在显著性差异（P＜0.05）。结果表明，相较Eng麦芽和Ger麦芽，酵母对Can麦芽所制备麦汁中浸出物的利用率较高，利于酵母的生长和乙醇的生成，该现象与上述酒精度的结果一致。
2.3 麦芽种类对啤酒发酵液风味物质的影响
香气成分是评判啤酒品质优劣的关键因素。本试验对3种不同种类麦芽发酵的啤酒样品进行GC-MS分析，酒样的香味物质对比结果见表1。
表1 不同种类麦芽酿造啤酒的香气成分含量
Table 1 Aroma components content of beer fermented by different types of malts
续表
续表
注：“-”表示未检出。
由表1可知，3种酒样中的挥发性香气物质成分种类大致相似，共测出82种香气物质，分别为酯类35种、醇类24种、酸类9种、醛类7种、酮类7种。其中，Eng啤酒、Can啤酒和Ger啤酒中分别共检出71、75、73种香气物质，挥发性香气成分总相对含量分别为150.17%、271.82%和195.31%。
2.3.1 醇类物质分析比较
3种啤酒共检测出24种醇类物质。Eng啤酒、Can啤酒和Ger啤酒均检出22种醇类物质，其中共有的醇类为20种；总醇相对含量分别为62.59%、102.91%和77.88%，占对应酒样风味物质总量的41.68%、37.86%和39.88%。其中，主要的醇类物质包括苯乙醇、异戊醇、乙醇、异丁醇等。醇类主要来自于发酵过程中酵母的代谢、其次也来源于糖苷类前体和酯类分解等[24]。不同种类麦芽的发酵结果显示，3种酒样中苯乙醇、异戊醇含量最多，二者的含量占总醇类含量的82.97%～91.16%。
作为啤酒中高级醇的重要成分，苯乙醇和异戊醇赋予酒类具有丰满的香味和口味，并增加酒的协调性，构成了酒体的主要香气。苯乙醇主要由苯丙氨酸在转氨酶、脱羧酶和脱氢酶的作用下经过艾氏途径合成[25]，其来源于麦皮，而非胚乳及整个大麦[26]。三种酒样中，酒样Can中苯乙醇相对含量最高（46.37%），酒样Ger次之（41.07%），酒样Eng最低（35.16%）。高浓度的异丁醇赋予酒体强烈的刺激味[27]，相较其他酒样，Eng酒样中异丁醇的相对含量最低，对啤酒风味影响较小。高级醇是某些酯类物质的前体物质，增加了啤酒后发酵时期形成的酯类种类，对呈香有重要作用，能够提高酒的感官品质[28]。Can酒样的总醇类物质相对含量丰富，加拿大麦芽更适合发酵较高酒度的啤酒。
2.3.2 酯类物质分析比较
适量的挥发性酯类化合物不仅益于啤酒的风味和香气协调性，对啤酒中的老化物质也具有一定的掩蔽效应[29]。3种酒样中共检测出35种酯类物质，主要为辛酸乙酯、正己酸乙酯、乙酸乙酯等。Eng啤酒、Can啤酒和Ger啤酒分别共检出30、34和30种酯类物质，其中共有的酯类有26种；总酯类物质的相对含量分别为42.57%、84.11%和37.89%，占对应酒样风味物质总量的28.35%、30.94%和19.40%。
挥发性酯是啤酒中的重要风味物质，也是啤酒香气的主要载体[30]。适量的酯类赋予啤酒花、果香气，使风味浓郁谐调[31]。其中辛酸乙酯、正己酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸异戊酯等是成品啤酒中典型的酯类物质[32]。Eng啤酒、Can啤酒和Ger啤酒中，辛酸乙酯的相对浓度最高，分别占总酯的48.48%、41.04%和34.34%，赋予酒体清甜的茴香味。同时，具有曲香、菠萝香的正己酸乙酯、香甜的乙酸乙酯和具有香蕉香气的乙酸异戊酯相对含量也很高，使酒香更浓郁[33]。
其中Can酒样中的总酯类物质含量最多，种类最全；同时含有相对浓度较高的乙酸苯乙酯，具有苹果、桃子的果香及威士忌的香韵，可以适当缓解苯乙醇给啤酒带来的闷香感。
醇类和酯类是啤酒香气物质中最主要的组成部分。啤酒中高级醇含量过高或组分失衡，易引起头痛等症状；而酯类可以有效缓解头痛，因而醇酯比是评价啤酒风味特点的重要依据[34]。一般醇酯比在3～4较理想，但目前多数啤酒呈偏低趋势[35]。
3种酒样的醇酯比结果见表2。由表2可知，其中Ger酒样的醇酯比最高，在2～3之间，其余酒样的醇酯比均在1～2之间。由此可见，不同种类麦芽发酵啤酒的醇酯比还是有较大差异的。
表2 麦芽种类对醇酯比的影响
Table 2 Effect of different types of malts on the ratio of alcohols to esters
2.3.3 醛类物质分析比较
醛类是啤酒中的主要羰基化合物。新鲜啤酒中的醛类化合物主要形成于麦汁或酿造过程，而随着储藏期的延长，老化醛类化合物的含量逐步增加，最终引起啤酒风味稳定性变差[36]。3种酒样中，共检测出苯甲醛（苦杏仁、樱桃及坚果香）、乙醛（青草味）等7种醛类物质。Eng啤酒、Can啤酒、Ger啤酒中分别共检出5、7、6种醛类物质，其中共有的醛类有4种；总醛类物质相对含量分别为0.44%、1.13%和1.06%，占总香气成分的0.29%、0.42%和0.54%。
苯甲醛是啤酒中含量最高的低挥发性醛类，具有苦杏仁的坚果香气[37]。Can酒样的苯甲醛相对含量（0.43%）显著高于其他酒样。乙醛是啤酒中含量最高的挥发性醛类，含量过高会赋予酒体浓重的青草味、缩短货架期[38]。作为啤酒中显著的香气成分特征，Ger酒样的乙醛含量显著高于其他酒样，形成显著的生酒味。
3种酒样中，Eng酒样中醛类香气物质相对含量较低；Can酒样中醛类香气物质种类最为丰富，总醛含量最高，保留啤酒的典型性的同时，也造成了酒样的老化风味；Ger酒样中醛类香气物质含量虽相较Can酒样偏低，但占该酒样总香气成分的百分比最高。
2.3.4 酮类物质分析比较
3种啤酒共检测出仲辛酮等7种酮类，Eng啤酒、Can啤酒和Ger啤酒分别共检出7、6和6种酮类物质，其中共有的酮类有5种；酮类物质总相对含量分别为0.16%、0.19%和0.36%，占总香气成分的0.11%、0.07%和0.18%。
3种酒样中，Eng酒样的酮类香气物质种类最为丰富，Ger酒样中总酮类香气物质含量最高。虽然丙酮等共有酮类的含量无较大差异；但Ger酒样中仲辛酮的相对含量最高（0.22%），赋予酒样浓烈的霉香、酮香，并伴有牛奶、乳酪、蘑菇的气味，而Can酒样中未检出仲辛酮。
2.3.5 酸类物质分析比较
3种啤酒共检测出辛酸、正癸酸、己酸等9种酸类物质，Eng啤酒、Can啤酒和Ger啤酒分别共检出7、6和9种酸类物质，其中共有的酸类有5种；酸类物质总相对含量分别为44.41%、83.48%和13.78%，占总香气成分的29.56%、30.70%、39.99%。
Eng啤酒、Can啤酒和Ger啤酒中，辛酸的相对含量最高，分别占总酸的72.42%、79.10%和59.18%；癸酸次之，分别占总酸的12.95%、12.59%和29.70%。二者皆是酒体“酸败味”的代表物质。易形成酒体的腐臭味，导致啤酒的品质下降，其中Can酒样中辛酸（66.03%）和Ger酒样中癸酸（23.20%）的相对含量，均显著高于其他酒样。同时，具有雄山羊味的己酸在3种酒体中均被检出，且Can酒样中的相对含量最高（5.04%），易形成酒体的辛基风味，加剧酒体的酸败。Can、Ger酒样的总酸含量趋于Eng酒样的两倍，证明酿造过程中原料的不同，会直接造成成品酒中的游离脂肪酸含量的显著差异。
综合香气成分分析结果，苯乙醇（玫瑰香）、异戊醇（甜味）、辛酸乙酯（茴香味）、正己酸乙酯（菠萝香、曲香）等物质是啤酒酒体香气的主要成分。与其他酒样相比，Can酒样的香味物质种类最多（75种）、相对含量最高（271.82%），香型丰富、香气浓郁饱满。虽然酒体醇酯比偏低，但其总醇、总酯的含量较高，酒体香气复杂、醇厚和谐。进一步证明了加拿大麦芽相较其他麦芽更适合于Lager啤酒酿造。
3 结论
本研究通过对3种不同种类麦芽的浸出物、α-氨基酸态氮、糖化力、库尔巴哈值等品质指标及所酿啤酒的酒精度、原麦汁浓度、实际浓度、外观浓度、实际发酵度、外观发酵度等理化指标检测，同时采用GC-MS分析比较其酒体风味成分差异。结果表明，相较英国麦芽和德国麦芽，加拿大麦芽的库尔巴哈值（45%）和浸出率（≥77%）适中、糖化力较高（414 WK）、α-氨基酸态氮偏低（118 mg/L）；同时，其发酵液酒精度较高（2.97%vol）、原麦汁浓度适中（8.63°P）；啤酒浓度较低（实际浓度2.76%、外观浓度1.17%）、发酵度较高（实际发酵度67.97%、外观发酵度86.41%）。最终确定加拿大麦芽相较其他麦芽更适于实验室模拟体系中Lager啤酒的酿造生产。
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