随着消费者对健康饮食越来越关注，通过牛奶、谷物、水果和蔬菜发酵制备的益生菌食品正受到科学家和消费者的广泛关注[1]。益生菌具有增加食物消化能力，调节胃肠道菌落，改善胃肠道功能等多种功能和优点。目前，含有益生菌的发酵乳制品已经大量投入市场，最常使用的益生菌有保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和乳双歧杆菌（Bifidobacterium lactis）等，其中保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌是较为常用的2种益生菌，常作为乳制品发酵剂[2]。
黑枣含有丰富的营养成分，是研制多种食品、饮料及保健品的理想原料。黑枣果实含有多种维生素、糖分、蛋白质及大量游离的氨基酸，并含有丰富的多酚和花色苷等生物活性物质[3-5]。近年来，含有植物基质及水果的新型酸奶在乳制品市场备受欢迎。李雅乾等[6]开发了多菌种混合发酵胡萝卜牛乳饮料的新工艺。郑凤锦等[7]对香蕉酸奶的发酵工艺进行了优化，并探究了产品的质构特征。吴倩等[8]发现干酪乳杆菌与嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌联合发酵可增加菌落总数和胞外多糖含量，从而确定这些益生菌存在互利共生关系。但是并不是所有的益生菌之间都是共生关系，也有些菌株表现为相互拮抗[9]。由于不同益生菌组合的相互作用关系仍不明确，因此需要通过实验来验证。酸奶的理化特征是消费者接受的重要因素之一，可以通过添加一些成分来提高酸奶的理化特征，而黑枣就是一种有益的原料，目前还未有黑枣酸奶的相关研究，尤其是不同益生菌组合对酸奶的营养、发酵和质构特性的影响尚不明确。本研究的主要目的是用不同益生菌组合制备黑枣酸奶，并探究不同益生菌组合对酸奶发酵特性和质构特性的影响，为黑枣酸奶的生产工艺优化及品质改善提供理论参考，为益生菌菌种组合的选择提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑枣、纯牛奶、酸奶发酵剂（保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌）：市售；嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和乳双歧杆菌（Bifidobacterium lactis）：上海润盈生物工程有限公司。
MRS培养基：北京索莱宝科技有限公司；苯酚、氢氧化钠、浓硫酸等（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
ZSH-150型生化培养箱：上海喆图科学仪器有限公司；UV1800型紫外可见光分光光度计：日本岛津公司；FE28型pH计：瑞士Mettler-Toledo公司；TA.XTC-18型质构仪：上海保圣实业发酵有限公司；NDJ-1型旋转黏度计：上海衡平仪器仪表厂；CM-800a型折光仪：日本ATAGO公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌悬液制备
将嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和乳双歧杆菌的菌粉分别置于MRS肉体培养基中进行活化复壮，活化复壮后再在MRS肉汤培养基中37℃培养24 h，然后4 500 r/min离心15 min，用无菌生理盐水清洗沉淀菌落，进而将其溶于蒸馏水中，配制成活菌数为2.5×108 CFU/mL左右的菌悬液。
1.3.2 黑枣酸奶的制备
将黑枣去核后加入黑枣质量2倍的纯水，置于破壁机中进行打浆，加入0.3%抗坏血酸和0.4%柠檬酸护色，5 000 r/min离心15 min，即得黑枣汁[10]。将黑枣汁的pH值调至6.00，向纯牛奶中加入质量比为15%的黑枣汁和7%的蔗糖，加热煮沸15 min，移入100 mL酸奶瓶，冷却后，分别接入酸奶发酵剂（接种量为7.11 lg CFU/mL左右）和不同组合益生菌（接种量为7.24 lg CFU/mL左右），混匀后置于37 ℃培养箱中培养8 h[8]。
1.3.3 试验设置
设置8种不同的发酵剂分别为接种酸奶发酵剂（C）；强化乳双歧杆菌发酵剂（C+BL）；强化嗜酸乳杆菌发酵剂（C+LA）；强化植物乳杆菌发酵剂（C+LP）；强化乳双歧杆菌和嗜酸乳杆菌发酵剂（C+BL+LA，乳双歧杆菌∶嗜酸乳杆菌为1∶1）；强化乳双歧杆菌和植物乳杆菌发酵剂（C+BL+LP，乳双歧杆菌∶植物乳杆菌为1∶1）；强化嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌发酵剂（C+LA+LP，嗜酸乳杆菌∶植物乳杆菌为1∶1）；强化乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌发酵剂（C+BL+LA+LP，乳双歧杆菌∶嗜酸乳杆菌∶植物乳杆菌为1∶1∶1）。
1.3.4 黑枣酸奶的理化指标测定
pH的测定：采用pH计直接测定；可滴定酸度的测定：使用滴定法测定[11]；可溶性固形物的测定：采用折光仪法测定[12]。
持水力的测定：采用重量示差法测定持水力[13]。称取20 g发酵样品（Y），5 000 r/min离心30 min，收集上清液并称重（S）。持水力的计算公式为：持水力=（Y-W）/Y×100%。
表观黏度的测定：使用旋转黏度计测定黏度。将样品放入不锈钢量筒中，转子浸入样品，以600 r/min的转速进行测量，即得到黏度读数。
胞外多糖的测定：取适量的发酵样品与500 μL三氯乙酸（40%）混合，置于-20 ℃冰箱放置10 min，随后4 ℃静置1 h，12 000 r/min离心5 min，上清液与1 mL已预冷的无水乙醇混合，4 ℃过夜，12 000 r/min离心5 min收集多糖沉淀，用已预冷的体积分数75%乙醇清洗两遍[8]。将提取得到的胞外多糖用蒸馏水溶解，采用苯酚-硫酸法测定胞外多糖含量，以葡萄糖计[14]。
益生菌菌落总数的测定：使用平板涂布法测定益生菌菌落总数[15]。
质构的测定：利用质构仪测定发酵样品的物理特性。将发酵样品置于4℃过夜，待其恢复至室温后进行质构测定。质构仪参数：探头为P50探头，距离为10 mm，触发点为5 g，测前速度为1 mm/s，测中速度为1 mm/s，测后速度为5 mm/s，测试模式为TPA[8]。
2 结果与分析
2.1 不同益生菌组合对黑枣酸奶pH和可滴定酸度的影响
不同益生菌组合对黑枣酸奶pH的影响见图1A。由图1A可知，C组发酵样品的pH为4.52，显著高于其他益生菌组合发酵的样品（P＜0.05）。C+BL、C+LP和C+BL+LP组合发酵样品的pH无显著差异（P＞0.05），其pH在4.44～4.47之间，表明强化乳双歧杆菌和植物乳杆菌可降低酸奶的pH。此外，相比C+BL和C+BL+LP的益生菌组合，C+LA组合可显著降低（P＜0.05）酸奶中的pH，其pH为4.39，表明嗜酸乳杆菌的在酸奶发酵中具有较强产酸能力，使用嗜酸乳杆菌结合保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌发酵可增加酸度。C+LA+BL组合发酵酸奶具有最低的pH，其pH为4.33；而C+LA+BL+LP组合发酵酸奶的pH为4.36。上述结果说明乳双歧杆菌的强化可能会促进嗜酸乳杆菌的产酸，而植物乳杆菌的加入会抑制嗜酸乳杆菌的生长代谢。在酸奶发酵剂中强化乳双歧杆菌和嗜酸乳杆菌会显著降低发酵酸奶的pH[16]。
可滴定酸度可以有效的反映样品中可电离的全部氢离子的含量，因此测定可滴定酸度可更好的揭示不同益生菌组合发酵酸奶的产酸情况，不同益生菌组合对黑枣酸奶可滴定酸度的影响见图1B。由图1B可知，可滴定酸度的结果与pH变化正好相反。C组发酵样品的可滴定酸度显著低于其他益生菌组合发酵的样品（P＜0.05），其可滴定酸度为71°T。C+LA+BL组合发酵酸奶具有最高的可滴定酸度，其可滴定酸度为113°T。C+LA+BL+LP组合发酵酸奶的可滴定酸度为104°T，说明多菌株混合发酵具有比传统酸奶发酵剂发酵更好的产酸能力，从而增加产品的口感[17]。
图1 不同益生菌组合对黑枣酸奶pH值（A）及可滴定酸度（B）的影响
Fig.1 Effect of different combinations of probiotics on pH value (A) and titration acidity (B) of black date yogurt
小写字母不同表示各组数值之间差异显著（P＜0.05），下同。
2.2 不同益生菌组合对黑枣酸奶可溶性固形物的影响
不同益生菌组合对黑枣酸奶可溶性固形物的影响见图2。
图2 不同益生菌组合对黑枣酸奶可溶性固形物的影响
Fig.2 Effect of different combinations of probiotics on soluble solids content of black date yogurt
由图2可知，相比C组发酵的样品，C+BL、C+LA及C+LA+BL组合发酵样品中可溶性固形物含量显著降低（P＜0.05），分别降低了14.16%、15.30%和8.92%；而C+LP和C+BL+LP组合却可以显著提高发酵样品中可溶性固形物含量（P＜0.05），分别提高了13.50%和6.87%。该结果表明强化嗜酸乳杆菌和乳双歧杆菌及两者的混合物均会改变产品的理化特性，而强化植物乳杆菌则会显著改善产品的理化特性。保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌协同发酵酸奶中可溶性固形物含量会显著高于嗜酸乳杆菌和双歧杆菌属协同发酵酸奶[18]。此外，C+LA+BL+LP组合发酵样品中可溶性固形物含量可达12.69%，略高于C组发酵样品。多菌株混合发酵（含有植物乳杆菌）具有比嗜酸乳杆菌和动物双歧杆菌组合发酵更高的可溶性固形物含量[19]。
2.3 不同益生菌组合对黑枣酸奶持水力的影响
不同益生菌组合对黑枣酸奶持水力的影响见图3。由图3可知，C组发酵样品的持水力为87.24%，而C+LP组合却可以显著提高发酵样品的持水力（P＜0.05），可提高6.95%，说明强化植物乳杆菌可增加与水结合的能力，从而获得更高持水力的产品。C+BL和C+LA组合均会显著降低（P＜0.05）发酵样品的持水力，可能是乳双歧杆菌和嗜酸乳杆菌均具有较强产酸能力，加速酸奶的酸化，使保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌生长代谢受到抑制。此外，多株益生菌的复合强化对发酵样品持水力的影响也存在差异，只有C+BL+LP和C+LA+BL+LP组合会增加发酵样品的持水力，其持水力分别为92.62%和91.38%，表明多菌株协同发酵必然会存在益生菌之间的互利共生及拮抗竞争关系，而植物乳杆菌的加入会减弱乳双歧杆菌和嗜酸乳杆菌对保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌的生长抑制作用。酸奶持水力与可溶性固形物含量呈正相关，持水力越高说明体系中的大分子可以通过较强的亲水作用力结合更多的水分子，而结合水含量越高，产品的稳定性也越好[20]。
图3 不同益生菌组合对黑枣酸奶持水力的影响
Fig.3 Effect of different combinations of probiotics on water holding capacity of black date yogurt
2.4 不同益生菌组合对黑枣酸奶黏度的影响
黏度是决定酸奶品质重要的指标之一，黏度高的酸奶不仅可以增强酸奶的口感，还可以减少增稠剂的使用。不同益生菌组合对黑枣酸奶黏度的影响见图4，由图4可知，C+LP组合的黏度最高，可达902 mPa·s，C、C+BL+LP、C+LA+LP及C+LA+BL+LP组合的黏度无显著性差异（P＞0.05）。相比C组发酵的样品，C+BL和C+LA组合均会显著降低（P＜0.05）发酵样品的黏度，分别降低了8.66%和20.05%，说明乳双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的加入可能会抑制保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌的生长代谢，改变产品的黏度。有文献表明酸奶的黏度与胞外多糖含量呈正相关。酸羊奶的发酵原料添加杏仁粉和菊粉可显著增加酸羊奶的黏度，并增加酸羊奶的口感及风味[21-22]。
图4 不同益生菌组合对黑枣酸奶黏度的影响
Fig.4 Effect of different combinations of probiotics on viscosity of black date yogurt
2.5 不同益生菌组合对黑枣酸奶胞外多糖的影响
胞外多糖是益生菌在生长代谢过程中分泌至细胞外的一类多糖类化合物的总称，也是表征酸奶品质的指标之一。不同益生菌组合对黑枣酸奶胞外多糖的影响见图5。
图5 不同益生菌组合对黑枣酸奶胞外多糖含量的影响
Fig.5 Effect of different combinations of probiotics on extracellular polysaccharides content of black date yogurt
由图5可知，不同益生菌组合发酵所产的胞外多糖含量存在显著差异（P＜0.05）。C组发酵样品的胞外多糖含量为8.47 g/L，是C+BL和C+LA组合发酵样品的1.23倍和1.61倍。该结果也进一步说明乳双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的强化会抑制胞外多糖的生成，影响酸奶的黏度。此外，相比C组发酵的样品，C+LP、C+BL+LP和C+LA+BL+LP组合均会显著增加（P＜0.05）发酵样品中胞外多糖含量，分别增加了41.44%、27.15%和12.63%。该结果与吴倩等[8]的研究结果相似，其发现干酪乳杆菌混合保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌联合发酵，可以显著提高胞外多糖的产生量。胞外多糖含量与可溶性固形物和黏度呈正相关，胞外多糖可增加乳制品的黏度、稳定性及保水性，使乳制品具有良好的质地、口感和风味[23]。
2.6 不同益生菌组合对黑枣酸奶乳酸菌总数的影响
良好的生长能力是益生菌发酵的先决条件。不同益生菌组合对黑枣酸奶乳酸菌总数的影响见图6，由图6可知，不同益生菌组合发酵样品中乳酸菌总数同样也存在显著差异（P＜0.05）。多株益生菌的复合强化发酵样品的乳酸菌总数显著高于酸奶发酵剂和强化单株及两株益生菌组合的发酵（P＜0.05），其乳酸菌菌落总数可达9.63 lg CFU/mL，是C组的6.92倍、单菌强化组的4.78倍和双菌强化组的1.58倍，这是由于菌株间的相互作用关系促进样品中益生菌活菌数的增加。同时，C+LP和C+BL+LP组合的乳酸菌总数也显著高于酸奶发酵剂组（P＜0.05），这可能与强化植物乳杆菌可以增加发酵样品中胞外多糖有关，胞外多糖有利于益生菌的增殖，改善酸奶的组织形态，增加酸奶的营养价值[24]。酸奶中乳酸菌活菌数大于6.00 lg CFU/mL才能使乳酸菌在人体肠道中定植，从而发挥其益生功效[8]。
图6 不同益生菌组合对黑枣酸奶乳酸菌总数的影响
Fig.6 Effect of different combinations of probiotics on the total number of colonies of black date yogurt
2.7 不同益生菌组合对黑枣酸奶质构的影响
酸奶的质构特性是评价酸奶品质的主要指标之一。不同益生菌组合对黑枣酸奶质构的影响见表1，根据表1可知，不同益生菌组合发酵样品的流变特性存在显著差异（P＜0.05），其C+LA组合发酵样品具有最高的硬度及最低的弹性、内聚性和回复性，而C+LP组合发酵样品则相反。C+LA+BL+LP组合发酵样品的硬度值为151.24 g，比酸奶发酵剂组降低了10.26%（P＜0.05）；而C+LA+BL+LP组合发酵样品的弹性、内聚性和回复性分别为1.04 mm、0.96 g·s和0.28，比酸奶发酵剂组分别提高了9.47%、9.09%和3.70%。该结果与SETYAWARDANI T等[17]的研究结果相一致，其发现植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌混合发酵制备的奶酪具有比单一菌株更好的质地。此外，酸奶的弹性、内聚性和回复性与胞外多糖呈正相关，而硬度与胞外多糖则呈负相关。胞外多糖的存在可增强酪蛋白大分子的结合能力，形成致密且稳定的网状结构，降低酸奶的硬度，提高体系的凝胶能力，从而增强酸奶的弹性、内聚性及回复性[25-26]。
表1 不同益生菌组合对黑枣酸奶质构的影响
Table 1 Effect of different combinations of probiotics on the texture of black date yogurt
3 结论
本研究探究了不同益生菌组合对黑枣酸奶的发酵和质构特性的影响。研究发现，不同益生菌组合会显著影响黑枣酸奶的理化、营养和质构特性。尽管嗜酸乳杆菌结合保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌发酵的黑枣酸奶具有最高的可滴定酸度和最低的pH；植物乳杆菌结合保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌发酵的黑枣酸奶具有最高的持水力、可溶性固形物含量、黏度、胞外多糖含量、弹性、内聚性和回复性及最低的硬度。但是，综合所有结果，发现强化植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和乳双歧杆菌发酵的黑枣酸奶具有更适宜的理化、营养及质构特性，有利于黑枣酸奶的贮藏，且乳酸菌活菌数最高，更有利于益生菌在人体肠道中存活并发挥对人体的保健作用。因此，多种益生菌混合发酵会改善黑枣酸奶的质地和品质及更优良的益生潜能。本研究有助于乳制品行业开发新的益生菌产品，并为益生菌菌种组合的选择提供依据。
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