发酵是最常见的传统食品加工和保存方式之一，至今有着几千年的历史[1]。发酵不仅可以延长食品的保质期，还能增加其营养价值和风味特性。发酵蔬菜是我国传统的蔬菜加工品，因其独特的风味而在我国具有广阔的消费市场[2]。酸菜是我国传统发酵蔬菜，通常是以大白菜为原料在低盐浸渍下经过微生物自然发酵而制成[3-4]。现在，酸菜已经成为我国东北地区冬季的必备食品。酸菜在市场上的供应越来越多，其生产规模也正在扩大[5]。酸菜发酵过程中会发生许多物理和化学变化，这些变化会直接影响产品的品质[6-7]。酸菜在加工工程中因其原料、产地、加工工艺等不同，故发酵周期、产品品质及挥发性风味成分也不同。因此，对于酸菜的商业化生产，控制发酵品质是必要且重要的。
乳酸菌是酸菜发酵过程中活跃的主要微生物。多项研究表明，在酸菜发酵过程中，乳酸菌的种类是多样的，且不同发酵时期的生物量也存在显著差异，主要有肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）、发酵乳杆菌（Lactobacilus fermentum）、清酒乳杆菌（Lactobacillus sake）、弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）、棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）、寡发酵乳杆菌（Lactobacillus oligofermentum）及一些肠球菌属（Enterococcus）和魏斯氏菌属（Weissella）[8-11]。而这些微生物的新陈代谢会影响酸菜的口感和风味。酸、酯、醇和含硫化合物是酸菜发酵过程中的主要挥发性风味化合物，还有一些萜、醛和酮可能会对酸菜风味的形成起重要影响[12]。不同乳酸菌对酸菜发酵的作用效果皆不同[13]，尤其是对风味物质的影响尚不明确。本研究以白菜为原料，采用植物乳杆菌（L.plantarum）、干酪乳杆菌（L.casei）和肠膜明串珠菌（L.mesenteroides）作为发酵剂制作酸菜，通过生理生化指标和风味物质成分探索不同乳酸菌对酸菜发酵效果的影响，并对挥发性风味物质进行主成分分析（principal component analysis，PCA），揭示其在提高酸菜品质和风味方面的潜在应用，旨在为酸菜发酵的强化技术和工业化加工提供理论和数据基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料
白菜、食盐：市售；植物乳杆菌（L.plantarum）、干酪乳杆菌（L.casei）和肠膜明串珠菌（L.mesenteroides）：上海润盈生物工程有限公司。
1.1.2 化学试剂
3,5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）、乙酸锌、亚铁氰化钾、葡萄糖、酒石酸钾钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；酒石酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸、乙酸、草酸、琥珀酸（均为色谱纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.1.3 培养基
MRS肉汤培养基：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
BBS-DDC无菌操作台：苏州安康空气技术有限公司；PB-10型pH计：德国Sartorius公司；UV1800型紫外可见光分光光度计：日本岛津公司；1260型高效液相色谱仪、7890A气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪：美国Agilent公司；573000-U型固相微萃取手柄、固相微萃取探头（50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头）：美国Supelco公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌悬液制备
将三种乳酸菌（植物乳杆菌（L.plantarum）、干酪乳杆菌（L.casei）和肠膜明串珠菌（L.mesenteroides））的保藏培养物分别置于MRS肉体培养基中进行活化复壮，活化复壮后再在MRS肉体培养基中37 ℃培养24 h，然后4 500 r/min离心15 min，用无菌生理盐水清洗沉淀菌落，进而将其溶于蒸馏水中，配制成活菌数为5.6×108 CFU/mL的菌悬液。
1.3.2 酸菜的制备
根据东北地区传统方法进行酸菜的腌制[14]，具体方法如下：挑选优质的大白菜，将其在室外晾晒2～3 d（晒蔫、杀菌、去除一定的水分）后，摘除黄叶、老帮并清洗干净，将整颗大白菜纵劈成两半，浸入沸水煮沸2 min，沥干水分，冷却后整齐摆入10 L的大缸中装满压实并排出空气，用质量分数为1%的无菌食盐水填满密封，接种白菜总质量1%的菌悬液于无菌食盐水中，用塑料布将大缸扎紧，在室温条件下发酵30 d，每个处理设置3个重复。取发酵0、10 d、20 d、30 d的酸菜样品进行理化指标测定。
1.3.3 分析检测
pH值的测定采用pH计；可滴定酸（以乳酸计）含量的测定参考国标GB 5009.239—2016《食品酸度的测定》[15]；还原糖（以葡萄糖计）含量的测定采用DNS法[16]；亚硝酸盐含量的测定采用盐酸萘乙二胺法[17]。
采用高效液相色谱法测定有机酸含量。取适量酸菜样品，加入等体积的硫酸锌和亚铁氰化钾，摇匀，10 000 r/min离心20 min，保留上清液过0.45 μm水系滤膜后待用。色谱条件：进样量10 μL；流动相为0.02 mol/L的NaH2PO4溶液；柱流速0.8 mL/min；检测波长210 nm；柱温30 ℃。
气相色谱-质谱联用（GC-MS）法测定酸菜样品中风味物质成分[12]。
固相微萃取条件：称取绞碎的4 g样品置于20 mL顶空瓶中，加入8 mL去离子水和2 g NaCl，用聚四氟乙烯隔垫密封，在磁力搅拌器中50 ℃平衡15 min。然后将50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头插入顶空瓶中，顶空吸附40 min后，将萃取头插入GC进样，解吸5 min。
气相色谱条件：DBWAX色谱柱（30 m×250μm×0.25μm）；进样口温度250 ℃，不分流进样；载气为高纯度氦气（He）；流速为1.0 mL/min；升温程序：35 ℃维持3 min，然后以6 ℃/min升温至160 ℃，最后以10 ℃/min升温至230 ℃，并维持5 min；质谱条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV；连接口温度250 ℃；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；扫描范围（33 ℃）450 m/z。
定性方法：经美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）08数据库检索定性；定量方法：采用面积归一法。
1.3.4 主成分分析
采用SIMCA 14.2软件对检测到的风味物质进行主成分分析（PCA），并绘制PCA得分图和相应的载荷图。
2 结果与分析
2.1 酸菜发酵过程中pH和可滴定酸度的变化
如图1所示，在整个发酵过程中，酸菜的pH值呈下降趋势；发酵20 d后，酸菜的pH值趋于稳定。其中，肠膜明串珠菌发酵的酸菜的pH值可降低至3.28，而植物乳杆菌发酵的酸菜的pH值却维持在3.38。这表明三种乳酸菌在酸菜发酵过程中均会产酸，其中肠膜明串珠菌发酵产酸能力较强。此外，可滴定酸的变化趋势与pH值变化相反。在发酵0～20 d，三种乳酸菌发酵的酸菜中可滴定酸含量迅速上升；发酵20 d后，可滴定酸含量的增加速率变缓，其中植物乳杆菌和干酪乳杆菌发酵的酸菜中可滴定酸含量无显著差异（P＞0.05），分别可达7.81 g/L和8.12 g/L，而肠膜明串珠菌发酵酸菜中可滴定酸含量却显著高于植物乳杆菌和干酪乳杆菌发酵的酸菜（P＜0.05），其可滴定酸含量可达8.69 g/L。接种三种不同乳酸菌发酵酸菜的可滴定酸含量显著高于之前韩宏娇等[14]报道的自然发酵酸菜在发酵50 d时总酸含量为6.68 g/kg（P＜0.05）。说明接种乳酸菌不仅可以加快发酵进程，还有助于提高可滴定酸含量。
图1 不同乳酸菌发酵酸菜的过程中pH和可滴定酸含量的变化
Fig.1 Changes of pH value and titratable acid contents in the fermentation process of suan-cai by different lactic acid bacteria
实线代表pH值，虚线代表可滴定酸，下同。
2.2 酸菜发酵过程中还原糖和亚硝酸盐的变化
还原糖是促进微生物生长代谢的主要能源物质之一。如图2所示，在整个发酵过程中，三种乳酸菌发酵的酸菜中还原糖含量均呈下降趋势，且下降趋势相一致。在发酵0～20 d，三种乳酸菌发酵的酸菜中还原糖含量均下降，这是因为在这个时间内乳酸菌可持续利用发酵液及原料中的还原糖进行生长繁殖，需要消耗大量的糖。发酵20 d后，三种乳酸菌发酵的酸菜中还原糖含量虽继续下降，但下降速率放缓，这可能是因为乳酸菌发酵产酸，使酸菜发酵体系的pH值降低，而较低的pH值会抑制乳酸菌的生长代谢，从而减缓利用还原糖的能力。但发酵30 d时，肠膜明串珠菌发酵的酸菜中还原糖的残留量最低，为2.14 g/L；植物乳杆菌和干酪乳杆菌发酵的酸菜中还原糖的残留量接近，分别为4.73 g/L和4.26 g/L。这表明肠膜明串珠菌消耗糖的能力强于其他两种乳酸菌。
酸菜属于腌制食品，在腌制初期，蔬菜及发酵器具上携带的肠杆菌和黄杆菌属等革兰氏阴性菌会分泌硝酸还原酶，从而将蔬菜中的大量硝酸盐还原为亚硝酸盐[18]。如图2所示，在整个发酵过程中，三种乳酸菌发酵的酸菜中亚硝酸盐含量的变化趋势与还原糖的变化相一致。在发酵0～10 d，三种乳酸菌发酵的酸菜中亚硝酸盐含量均迅速下降；在发酵10 d后，三种乳酸菌发酵的酸菜中亚硝酸盐含量则趋于稳定，且三种乳酸菌发酵的酸菜中亚硝酸含量无显著差异（P＞0.05），其在发酵30 d时亚硝酸含量范围在0.95～0.97 mg/L之间，低于国标规定泡菜中的亚硝酸盐含量为20 mg/kg的限量标准[19]。
图2 不同乳酸菌发酵酸菜的过程中还原糖和亚硝酸盐的变化
Fig.2 Changes in reducing sugar and nitrite in the fermentation of suan-cai by different lactic acid bacteria
2.3 泡菜中有机酸的分析
有机酸时酸菜中重要的呈酸滋味物质。在以前的研究中发现，乳酸在酸菜酸感形成过程中起主导作用，柠檬酸、乙酸、草酸、苹果酸、琥珀酸及酒石酸则起到辅助作用，且这些有机酸含量及比例合适时对酸菜柔和酸感起到促进作用，而含量及比例不合适时会破坏柔和酸感[20]。
表1 酸菜中有机酸物质的种类及含量
Table 1 Types and contents of organic acids in suan-cai
注：同行不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由表1可知，三种乳酸菌发酵的酸菜中草酸、苹果酸、琥珀酸和酒石酸含量无显著差异（P＞0.05），其含量范围分别在641.81～691.35 mg/L、695.17～768.66 mg/L、202.43～221.75 mg/L、和78.69～83.67 mg/L。肠膜明串珠菌发酵的酸菜中乳酸和柠檬酸含量最高，分别可达7 589.68 mg/L和1 836.48 mg/L，显著高于其他两种乳酸菌发酵的酸菜（P＜0.05），而植物乳杆菌和干酪乳杆菌发酵的酸菜中乳酸和柠檬酸含量无显著差异（P＞0.05）。此外，肠膜明串珠菌发酵的酸菜中乙酸含量最低，为307.38 mg/L，显著低于其他两种乳酸菌发酵的酸菜（P＜0.05）；而干酪乳杆菌发酵的酸菜中乙酸含量最高，为486.62 mg/L，分别比植物乳杆菌和肠膜明串珠菌发酵的酸菜提高了24.84%和58.31%。整个有机酸组成以乳酸和柠檬酸为主，其含量分别占整个有机酸比例的65%和15%左右，与马艺荧等[21]报道的自然发酵酸菜中有机酸比例相一致。这表明接种乳酸菌不会影响有机酸比例的变化。
2.4 泡菜中挥发性风味物质的分析
采用GC-MS技术检测不同乳酸菌发酵酸菜中的挥发性风味物质，共检测出65种。其中主要挥发性物质种类和数目如图3所示，酸菜中挥发性成分主要包括7种醇类（异戊醇、乙醇等）、13种醛类（苯甲醛、乙醛等）、12种酸类（乙酸、肉豆蔻酸等）、12种酯类（丁酸丁酯、丁酸乙酯等）、4种酮类（3-戊酮、3-羟基-2-丁酮等）、5种异硫氰酸酯类（异硫氰酸丁酯、异硫氰酸烯丙酯等）和13种其他类（1,4-庚二稀、二甲基二硫醚等）。不同乳酸菌发酵酸菜中醇类、酯类、酮类及异硫氰酸酯物质数目差别不大，肠膜明串珠菌和干酪乳杆菌发酵酸菜中分别具有最多的醛类和酸类物质。郑文迪等[22]测定广西发酵酸菜共有97种挥发性成分，其中醇类和酯类较多。此结果与本研究所测略有不同，可能是受两者地理环境、酿造环境等环境因素，以及原料来源和制作工艺的影响。
图3 不同乳酸菌发酵酸菜中主要挥发性物质数量
Fig.3 Number of main volatile substances in the fermentation process of suan-cai by different lactic acid bacteria
2.5 酸菜挥发性成分的主成分分析
对不同乳酸菌发酵酸菜样品进行挥发性成分的PCA分析，结果见图4。由图4a可知，同一发酵剂发酵酸菜聚类明显，不同发酵剂发酵酸菜样品之间差异显著。由图4b可知，通过载荷图中不同化合物与原点之间距离的正负确定其与各个主成分之间的相关性，因其含量的数据，可进一步判断出不同乳酸菌发酵酸菜挥发性含量的差异程度[23]。故根据主成分分析，可以较好区分不同乳酸菌发酵酸菜的风味含量差异。
图4 不同乳酸菌发酵酸菜挥发性化合物主成分分析得分图（a）和载荷图（b）
Fig.4 Principal component analysis score plot (a) and loading diagram(b) of volatile substances in suan-cai by different lactic acid bacteria
2.6 醇类和酸类
醇类物质具有令人愉悦的香气，但其气味阈值较大，对发酵蔬菜特征性气味的影响不明显。酸菜中含量最高的醇类物质为乙醇，其植物乳杆菌发酵酸菜中乙醇含量显著高于其他两种乳酸菌发酵酸菜（P＜0.05）。而肠膜明串珠菌发酵酸菜中异戊醇含量显著高于其他两种乳酸菌发酵酸菜（P＜0.05）。异戊醇具有杂气息和辣味，并带有醚香和焦香。酸类物质的种类最多，其总含量范围在4.89%～6.00%，含量最高的为肉豆蔻酸。此外，三种乳酸菌发酵酸菜中乙酸的含量与液相检测结果相一致。
2.7 醛类和酯类
大部分的醛类物质的气味阈值均较低，对酸菜风味的形成具有较为重要的影响，且可赋予酸菜清香、果香和坚果香[3]。酸菜中含量前三的醛类物质为苯甲醛、2,4-二甲基苯甲醛和乙醛。苯甲醛具有特殊的杏仁气味，而乙醛具有强烈的刺激性气味。酯类物质是发酵蔬菜呈现香味的主要特征性风味物质之一。三种乳酸菌发酵酸菜中共检测出12种酯类物质，其中含量较高的酯类物质有：γ-十二内酯、丁酸乙酯、丙酸乙酯和乙酸丁丁酯，其中丙酸乙酯具有强烈的菠萝香气。乙酸丁酯等酯类对酸菜醇香具有一定的贡献。
2.8 酮类和异硫氰酸酯类
在不同乳酸菌发酵酸菜中共检测到4种酮类物质，分别为2-庚酮、3-羟基-2-丁酮、2-壬酮和3-戊酮。这些化合物是由脂肪酸β-氧化产生的，可为酸菜提供草药香、水果香和花香[24]。酸菜中含量最高的酮类物质为3-羟基-2-丁酮，其含量范围为0.34%～0.57%，其中肠膜明串珠菌发酵的酸菜中3-羟基-2-丁酮含量要显著高于其他两种乳酸菌发酵酸菜（P＜0.05）。乳酸菌能够利用柠檬酸盐和丙酮酸盐作为底物生产-羟基-2-丁酮[8]。
异硫氰酸酯类被认为是十字花科植物及其发酵成品特有的风味物质，具有芳香味[22]，可使蔬菜呈鲜美风味。在本研究中共检测到5种异硫氰酸酯类物质，分别为异硫氰酸丁酯、4-戊烯基异硫氰酸酯、2-苯基乙基异硫氰酸酯、异硫氰酸丁烯酯和异硫氰酸烯丙酯，其中异硫氰酸丁酯含量最高，含量范围为0.30%～0.34%，具有强烈的辛辣味，为酸菜的独特风味提供贡献。
3 结论
本研究以酸菜为研究对象，探究了不同乳酸菌发酵剂对酸菜的风味物质和感官指标的影响。不同乳酸菌发酵酸菜的理化性质差异显著，其中肠膜明串珠菌发酵酸菜中pH值和还原糖含量最低，总酸含量最高，但亚硝酸盐含量无显著差异。此外，肠膜明串珠菌发酵的酸菜中乳酸和柠檬酸含量最高，分别为7.59 g/L和1.84/L，且乳酸占整个有机酸比例的65%左右。采用气相色谱-质谱联用测定其挥发性成分，共检测出65种，其中醛类13种、酯类12种、酸类12种、醇类7种、异硫氰酸酯类5种和酮类4种。PCA 结果表明，不同乳酸菌发酵酸菜的挥发性物质的种类和含量均差异显著。本研究结果可为筛选符合不同发酵目的的发酵剂提供技术参考。
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