火腿肠具有适口性好、携带方便等优点，深受消费者青睐。亚硝酸盐在高温肉制品中常用于发色和防腐，但亚硝酸盐具有强致癌性[1]。因此，人们在寻找亚硝酸的替代物以减少亚硝酸的使用量。目前多采用外源添加物[2-4]、发酵[5-6]的方式部分替代亚硝酸盐。众多的研究表明，发酵可显著提高肉制品的品质，其富含的蛋白质、脂肪等经过微生物氧化分解成氨基酸和短肽更易被人体吸收[7]，改善了肉制品的品质，但其发酵工艺受原料及辅料、发酵剂种类[8-9]、发酵时间和温度、添加量[10]等因素的影响较大。郭丹等[11]研究发现，益生菌添加量、发酵温度和时间能显著提高肉制品亚硝酸盐清除率和感官品质，促进氨基酸含量增加[12]。发酵产生的亚硝酸盐还原酶和酸类物质，促进亚硝酸盐的降解[13-14]。LIU D C等[15]研究发现，接种过红曲霉（Monascus）的0.25%安卡米能代替香肠中75%的亚硝酸盐发色。1010 CFU/mL乳酸菌发酵能全部代替香肠中亚硝酸盐发色[16]。低温肉制品集营养、风味、安全于一体，是肉制品的发展方向。然而，受生产工艺等因素影响，褪色现象在低温肉制品中普遍存在，对亚硝酸盐的使用量和替代物的选择提出了更高的要求。袁玲等[17]研究发现，0.3%牡丹提取物和3%乳酸菌发酵液可代替低温火腿肠中2/3亚硝酸钠，且李燚等[18]研究发现，红曲霉发酵可促进低温火腿肠发色，但少有将红曲霉（Monascus）和乳酸菌（lactic acid bacteria）联合发酵，探究低温火腿肠的发酵工艺。本研究以猪肉为原料，利用红曲米和乳酸菌菌粉为发酵剂，研制低温猪肉火腿肠，通过单因素试验和响应面优化其发酵工艺，并对低温猪肉火腿肠品质进行分析，旨在为实现低硝低温肉制品的生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
猪后腿肉、食盐、红曲米、乳酸菌发酵菌粉（包括保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌）、孜然、胡椒粉、辣椒面、白砂糖、味精：购于沃尔玛超市；胶原蛋白肠衣（直径3 cm）：广州德福隆生物科技有限公司；亚硝酸盐、复合磷酸盐、异抗坏血酸（均为分析纯）、淀粉（生化试剂）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
LRH-250C生化培养箱：韶关市泰宏医疗器械有限公司；YX-18HM手提式压力蒸汽灭菌锅：江阴滨江医疗设备有限公司；BCD-258WDP冷藏冷冻箱：青岛海尔股份有限公司；WFJ7200可见分光光度计：上海尤尼柯仪器有限公司；PHS-3C酸度计：天津市赛得利斯有限公司；TA-XT2i型质构分析仪：英国Stable Micro Systems UK公司；UltraScan VIS台式色差仪：上海韵鼎国际贸易有限公司；DZKW-D-2电热恒温水浴锅：上海科恒实业发展有限公司；DHG-9075A电热恒温鼓风干燥箱：上海齐欣科学仪器有限公司；TK-12型绞肉机：浙江应晓工贸有限公司；MJ-BL25C4型斩拌机：广东美的生活电器制造有限公司。
1.3 方法
1.3.1 低温猪肉火腿肠制作工艺流程及操作要点
原料整理→分割→绞肉→腌制→斩拌乳化→接种红曲霉、乳酸菌→灌制→蒸煮→烘烤、冷却→低温猪肉火腿肠成品
操作要点：
原料猪肉的挑选：原料选取一定的猪肉肥膘与精肉搭配，肥瘦比为2∶8（g∶g），挑选的肉冷却至3～5 ℃后再进行加工。
绞肉：将原料瘦肉剔除结缔组织以及可见脂肪部分，切成1～2 cm见方的小块，用绞肉机将其绞成肉馅待用，控制肉温10 ℃左右，将肥膘切成1～2 cm见方的小块。
腌制：在绞碎的瘦肉中加入2.5%食盐、4 mg/kg亚硝酸盐、0.03%异抗坏血酸、0.1%孜然、0.1%胡椒粉、0.1%辣椒面、0.1%白砂糖、0.1%味精，搅拌5～10 min混合均匀，排净肉糜表面气泡，然后用保鲜膜包好置于4 ℃、相对湿度85%～90%条件下腌制2 h。
斩拌乳化：斩拌前先用冰水（肉质量20%）将斩拌机降温至10 ℃左右，然后投放腌制好肉糜斩拌2 min，接着倒入脂肪末，最后加入6%淀粉搅拌均匀，斩拌3.5 min使原料肉与辅料充分结合，达到最佳的乳化效果。
红曲霉溶液制备：以鲜肉糜为基准，将研磨后的红曲米粉中加入无菌水，充分溶解，制成一定浓度的红曲霉溶液。
乳酸菌菌悬液制备：以鲜肉糜为基准，在无菌条件下，在乳酸菌发酵菌粉中加入一定比例的无菌水，搅拌均匀，制成一定浓度乳酸菌菌悬液。
接种红曲霉和乳酸菌：一定量的红曲霉、乳酸菌均匀加入经斩拌乳化后的肉糜中，于相对湿度92%～96%、发酵温度30 ℃的条件下发酵不同时间。
灌制及排气：将接种好的肉馅放入直径约3 cm的猪肠衣中，并用排气针在肠衣上扎孔排气，灌肠时肉馅的温度不超过2 ℃。填充时需小心，尽量减少肉馅中的空气，松紧适度。
蒸煮：在90 ℃的水浴锅中加热肠体，用探针式温度计测定肠心温度，待蒸煮后肠心温度达到70 ℃左右时停止加热，捞出冷却晾干。
烘烤：60 ℃的烘箱中烘烤30 min，使肠体本身呈现具有弹性而肠体表面不会出现失水塌陷的情况。
冷却：猪肉肠烘烤后冷却至室温，得到低温猪肉火腿肠成品。
1.3.2 分析检测
（1）理化指标测定
全质构分析（texture profile analysis，TPA）：参照文献[19]测定。色差：参照文献[20]，每组随机选取3只火腿肠，切成薄片，用色差仪测定各试验组及对照组的明亮度（L*值）、红绿色（a*值）、黄蓝色（b*值）及色差值（ΔE），其中ΔE的计算公式如下：ΔE=
pH值：采用GB 5009.237—2016《食品安全国家标准食品pH值的测定》中方法进行测定；亚硝酸盐：按照GB 5009.33—2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中方法进行测定；氨基酸含量：采用GB 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》中方法进行测定；菌落总数：GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品中菌落总数的测定》。
（2）低温猪肉火腿肠感官评分方法
低温猪肉火腿肠感官质量评分参照GB 20712—2006《火腿肠》，评分标准见表1。感官评定由15名专业人员组成的感官评定小组参照按照国标GB/T 22210—2008《肉与肉制品感官评定规范》对火腿肠的色泽、组织形态、风味、滋味4个方面进行感官评定，满分100分。
表1 低温猪肉火腿肠感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation standards of low-temperature pork ham sausage
续表
1.3.3 发酵火腿肠单因素试验设计
选取100 g/份猪肉，2.5%食盐、4 mg/kg亚硝酸盐、0.03%异抗坏血酸、适量的香辛料和调味料，红曲霉添加量分别为（0、1.4%、2.8%、4.2%、5.6%）、乳酸菌添加量分别为（0、3%、4%、5%、6%）、发酵时间（38 h、40 h、44 h、48 h、52 h）条件下进行单因素试验，考察各影响因素对火腿肠的氨基酸含量、感官评分、亚硝酸盐含量、pH、硬度及色差的影响。
1.3.4 Box-Behnken试验设计
根据单因素优化结果，选择红曲霉添加量（A）、乳酸菌添加量（B）、发酵时间（C）为影响因素，以感官评分（Y）为响应值，利用Design-Expert V8.0.6软件设计3因素3水平的响应面试验，响应面试验设计因素与水平见表2。
表2 响应面试验设计因素与水平
Table 2 Factors and levels of response surface tests design
1.3.5 产品保藏试验
以响应面优化后的配方制成的低温猪肉火腿肠成品为试验组，仅加入0.03%的亚硝酸盐制成的低温猪肉火腿肠为对照组，设置3个平行试验，两组产品置于37 ℃条件下保藏21 d（相当于4 ℃条件下保藏194 d，即6个月的保质期），每7 d测定两组样品的菌落总数，观察产品的色泽。
1.3.6 数据处理
采用Design-Expert V8.0.6响应面设计软件、Excel 2016和IBM SPSS Statistics 25.0进行数据处理。
2 结果与分析
2.1 发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 红曲霉添加量对火腿肠品质的影响
由表3可知，随着红曲霉添加量在0～5.6%范围内的增加，火腿肠的氨基酸含量显著增加（P＜0.05），亚硝酸盐含量、pH和硬度逐渐降低，感官评分先增加后降低，色差值先降低后增加。可能是因为红曲霉添加量增加，红曲霉初级代谢产物蛋白酶增多，这些蛋白酶能将大分子蛋白质分解为多肽、氨基酸等，所以氨基酸含量增加[21]。pH值先大幅下降后缓慢下降再趋于稳定是因为红曲霉发酵产生的碱性蛋白酶平衡了pH的迅速降低[22]，有助于火腿肠品质的稳定；红曲霉发酵产生的红曲色素、乳酸菌发酵产生的有机酸类物质，两者对亚硝酸盐起到降解作用[23-24]，因而亚硝酸盐含量降低。红曲霉发酵产生的代谢酶系，使火腿肠的蛋白质和脂肪发生水解，产生大量水溶性物质，酪蛋白原有网络结构被破坏，肉糜发酵体系变得软柔而均匀的组织结构改善了质构特性，即破坏了肉中蛋白质的空间结构，引起了硬度的变化[25]，另外红曲霉具有较强的抗氧化能力，可有效地抑制肉制品中脂肪和蛋白质的氧化腐败，能在一定程度上改善肉制品的劣变[26]。红曲霉添加量为4.2%时，此时亚硝酸盐含量为18.5 mg/kg，与空白组相比，亚硝酸盐减少了8.8 mg/kg，产品色差值（ΔE）最小（11.6），感官评分最优78.2分。因此，最适红曲霉添加量为4.2%。
表3 红曲霉添加量对低温猪肉火腿肠品质的影响
Table 3 Effect of Monascus addition on the quality of low-temperature pork ham sausage
注：表中数据为“均值±标准差”；同列数据尾部标记无相同字母者表示显著差异（P＜0.05）。下同。
2.1.2 乳酸菌添加量对火腿肠品质的影响
由表4可知，随着乳酸菌添加量在0～6%范围内的增加，氨基酸含量先增加后稳定，色差值先降低后增加，而亚硝酸盐、pH值显著降低（P＜0.05），硬度显著增加，根据多重比较分析结果发现不同的乳酸菌添加量的各个组之间对于硬度的差异显著。且在一定范围内增加添加量可以增加产酸，但酸度过低会掩盖发酵火腿肠的固有风味，带来不良的感官品质。硬度随添加量的增加逐渐增加，与红曲霉添加量对火腿肠硬度的影响不同，因为乳酸菌菌数增加，发酵产酸量增加，导致pH的迅速下降，酸诱导蛋白质变性和凝胶反应，从而增加其硬度[27]。乳酸菌添加量为5%时，亚硝酸盐含量减少26.1 mg/kg，因为乳酸菌产生的亚硝酸盐还原酶和酸性物质，可降低亚硝酸盐含量[28]，此时火腿肠色差值（ΔE）最小（7.5），感官评分最高78.7分。因此，最适乳酸菌添加量5%。
表4 乳酸菌添加量对火腿肠品质的影响
Table 4 Effect of lactic acid bacteria addition on the quality of low-temperature pork ham sausage
2.1.3 发酵时间对火腿肠品质的影响
发酵时间是评价发酵程度的重要指标。由表5可知，随着发酵时间在38～52 h的延长，氨基酸含量、硬度和感官评分先增加后降低，亚硝酸盐显著下降（P＜0.05），而pH先缓慢下降后稳定。发酵时间为38～44 h时，发酵肉中的蛋白质和肽类物质进一步降解，表现为氨基酸含量增加，发酵时间＞44 h之后，肉中某些氨基酸转化成挥发性风味物质[29-30]，使氨基酸含量降低。由前面研究可知，单一菌种发酵，乳酸菌添加量为5%时，火腿肠亚硝酸盐含量为27.3 mg/kg，红曲霉添加量为4.2%时，亚硝酸盐含量为28.9 mg/kg，4.2%红曲霉和5%乳酸菌混合发酵38 h火腿肠亚硝酸盐含量为13.9 mg/kg，联合发酵比红曲霉、乳酸菌单菌种发酵其亚硝酸盐分别降低了15 mg/kg、13.4 mg/kg，表明红曲霉和乳酸菌混合发酵能显著降低亚硝酸盐含量，可能是因为在乳酸菌大量存在的情况下，红曲霉的生长会受到部分抑制[31]，使乳酸菌更好地发挥作用，同时红曲霉发酵促进亚硝酸盐的降解，从而加快亚硝酸盐含量的下降。发酵时间对火腿肠的硬度影响显著，可能是蛋白质变性、凝胶反应体系和水分的变化，导致硬度增加[27]。发酵时间为44 h时，火腿肠的色差值（ΔE）最小（15.7），感官评分较高为80分。因此，最适发酵时间为44 h。
表5 发酵时间对低温猪肉火腿肠品质的影响
Table 5 Effect of fermentation time on the quality of low-temperature pork ham sausage
2.2 发酵工艺优化响应面优化试验
2.2.1 响应面试验结果与回归模型显著性分析
在单因素试验基础上，选择红曲霉添加量（A）、乳酸菌添加量（B）、发酵时间（C）为影响因素，以感官评分（Y）为响应值，利用Design-Expert V8.0.6软件设计3因素3水平的响应面试验，试验方案和结果见表6，通过Design-Expert 8.0.6软件对表6的数据进行方差分析，结果见表7。
表6 Box-Behnken试验设计与结果
Table 6 Design and results of Box-Behnken tests
续表
以感官评分为响应值（Y）建立数学模型，得到回归方程如下：
Y=76.52+2.44A+3.45B+0.062C-4.83AB-2.20AC-1.68BC-3.14A2+1.84B2-3.68C 2
表7 回归模型系数显著性检验
Table 7 Significance test of regression model coefficient
注：P＜0.001表示对结果影响高度显著；P＜0.01表示对结果影响极显著；P＜0.05表示对结果影响显著；P＞0.05表示对结果影响不显著。
由表7可知，模型P=0.001 2＜0.05，失拟项P=0.458 9＞0.05，说明该模型自变量与因变量之间函数关系显著，几乎不存在失拟现象。决定系数R2=0.880 4，调整决定系数R2adj=0.726 7，说明模型拟合度高，用于模拟试验结果可靠。A、B、AB、A2、C2对结果影响极显著（P＜0.01），AC对结果影响显著（P＜0.05），BC、B2、C表现为不显著（P＞0.05），各因素对感官评分顺序为乳酸菌添加量＞红曲霉添加量＞发酵时间。
2.2.2 响应面分析及最优工艺验证
由图1可知，乳酸菌添加量一定时，红曲霉添加量和发酵时间逐渐增加时，感官评分呈先升高后降低趋势，说明交互作用明显。通过以上模型得到的火腿肠最佳发酵工艺为红曲霉添加量3.66%、乳酸菌添加量为5.00%，发酵43.86 h，感官评分预测值为81.81分。为了便于实际操作，将上述优化的发酵条件修正为红曲霉添加量4.0%、乳酸菌添加量为5.0%，发酵44 h。在此条件下进行3次重复试验，得到火腿肠的感官评分实际值为82.5分，与预测值相差不大，说明最优发酵工艺条件可靠。
由表8可知，37 ℃条件下保藏7 d，试验组与对照组菌落总数差别不大；37 ℃条件下保藏14 d、21 d时，试验组菌落总数略高于对照组，但差别不大，说明红曲霉和乳酸菌确实能够抑制微生物的生长，达到延长保质期的目的。两组产品21 d后菌落总数低于国标GB 2726—2016《熟肉制品》中菌落总数要求（＜20 000 CFU/g），符合卫生要求。
试验组与对照组的感官评分分别为82.5分、81.9分，实验组方差分析表明，试验组的红曲霉和乳酸菌的防腐作用与对照组亚硝酸盐的作用基本一致，即3.66%的红曲霉添加量和5.00%的乳酸菌添加量的联合作用能够代替84.31%的亚硝酸盐对火腿肠进行防腐保鲜，其火腿肠色泽明亮，呈浅红色。
图1 各因素交互作用对火腿肠感官评分影响的响应面及等高线
Fig.1 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on the sensory score of low-temperature pork ham sausage
表8 低温猪肉火腿肠菌落总数在保藏期内的变化
Table 8 Changes of total bacteria count of low-temperature pork ham sausage in the preservation period
注：试验组为按照最佳工艺制成的火腿肠成品；对照组为加入0.03%亚硝酸盐的火腿肠成品。
3 结论
低温猪肉火腿肠经红曲霉和乳酸菌发酵后营养价值显著提高，火腿肠色泽明亮，呈浅红色。最佳发酵工艺条件为红曲霉4.0%、乳酸菌5.0%，发酵44 h。在此优化条件下，肠体呈浅红色，口感柔和，感官评分为82.5分，pH值6.24，亚硝酸盐含量为4.9 mg/kg。保藏试验表明，红曲霉4.0%和乳酸菌5.0%可以替代84.31%的亚硝酸盐对低温猪肉火腿肠进行发色。
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