糖尿病已经成为严重危害人类健康的重大公共卫生问题。据国际糖尿病联盟最新数据显示，目前有4.63亿成年人患有糖尿病[1]，2019年有420万名20～79岁的成年人死于糖尿病[2]。全球糖尿病的直接健康支出为7 600亿美元，其中中国的糖尿病年度健康支出为1 090亿美元[3]。糖尿病及其并发症对个人、家庭以及国民经济具有重大的影响。因此，有效地预防和治疗糖尿病及其并发症至关重要[4]。
α-葡萄糖苷酶抑制剂（α-glucosidase inhibition，α-GI）通过抑制α-葡萄糖苷酶，可有效地延缓肠道碳水化合物的消化吸收以维持餐后血糖正常，已广泛应用于2型糖尿病的治疗[5]。目前临床上该类药品有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇等，在国内外均具有可观的市场销量[6]，但存在药物种类少、价格高、胃肠道反应大、不良反应发生率高等问题[7-8]。因此，开发安全高效的新型α-GI具有广泛的前景[9-10]。
罗汉果具有降糖作用[11-12]，基于共生理论，其内生菌可能也会产生降糖类物质[13]。龙楚媚等[14-15]从罗汉果内生菌中筛选出产α-淀粉酶抑制剂的菌株，罗汉果内生菌作为降糖活性物质筛选来源尚有待探究。本研究从罗汉果内生菌中筛选出产α-葡萄糖苷酶抑制剂的菌株，对其进行形态学观察及分子生物学鉴定，采用单因素试验及正交试验优化菌株发酵条件，并对其活性部位进行追踪，以期为罗汉果内生菌来源的α-GI的开发利用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种
罗汉果内生菌株：广西师范大学发酵工程实验室保藏。
1.1.2 主要试剂
α-葡萄糖苷酶（酶活50 U/mg）、对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）（纯度99%）：上海源叶生物科技有限公司；阿卡波糖：杭州中美华东制药有限公司；葡萄糖、氯化钠、碳酸钠（均为分析纯）：西陇化工股份有限公司。
1.1.3 培养基
种子培养基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，蒸馏水1 000 mL，121 ℃灭菌30 min。
发酵培养基：取去皮土豆200 g，切块煮沸30 min，八层纱布过滤，加入20 g葡萄糖，定容至1 L，pH自然，121 ℃灭菌30 min。
马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：同发酵培养基，另加20 g琼脂，pH自然，121 ℃灭菌30 min。
1.2 仪器与设备
YM75型立式压力蒸汽灭菌锅：上海三申医疗器械有限公司；ZD-85型恒温振荡器：国华仪器制造有限公司；HP400S型生化培养箱：武汉瑞华仪器设备有限责任公司；BX63型荧光成像分析系统显微镜：日本Olympus公司；Infinite M200Pro酶标仪：帝肯贸易有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌株活化与发酵培养
取36株保藏的罗汉果内生菌株，分别划线接种于PDA平板培养基上，28 ℃静置培养3 d。挑取单菌落一环接种于装100 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，置于28℃、160 r/min摇床培养3 d，按1%接种量转接至发酵培养基中，28 ℃、160 r/min条件下振荡培养7 d，得发酵液用于目的菌株的筛选。
1.3.2 α-葡萄糖苷酶抑制剂产生菌的筛选
采用对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）法进行筛选，参照LIMA R A T等[16-17]的方法具体如下：在96孔酶标板上，样品组（发酵原液）依次加入50 μL样液和100 μL的α-葡萄糖苷酶溶液（0.125 U/mL），37℃保温10 min，加入50μL的PNPG（5 mmol/L）混匀，37 ℃反应20 min，最后加入50 μL 0.2 mol/L的Na2CO3溶液中止反应，酶标仪（检测波长405 nm）测其吸光度值。1 μg/mL的阿卡波糖溶液作阳性对照组，样品空白组中用相同体积的磷酸缓冲液代替酶液，其余与样品组相同。对照组中不加发酵液，用磷酸缓冲液补齐。对照空白组中不加酶液，其余与对照组相同，用磷酸缓冲液补齐。样品对α-葡萄糖苷酶抑制率的计算公式如下：
式中：A样品为样品组的吸光度值；A样品空白为样品空白组的吸光度值；A对照为对照组的吸光度值；A对照空白为对照空白组的吸光度值。
1.3.3 菌株鉴定
形态观察：采用平板划线分离法将所筛目的菌株接种到PDA培养基上，置37 ℃培养箱内培养1 d，观察菌落形态，初步确认为细菌后进行革兰氏染色和芽孢染色[18]观察。
分子生物学鉴定：由武汉华大基因科技有限公司对菌株进行16S核糖体RNA基因（16S ribosomal DNA，16S rDNA）测序，使用基于局部比对算法的搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）将测序结果与美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank数据库已知序列进行比对，并利用MEGA7.0软件中的邻接法（neighbor-joining，NJ）构建系统发育树。
1.3.4 目的菌株摇瓶发酵条件优化
单因素试验：设置基本发酵条件为pH自然，按1%的接种量将目的菌株的种子液接入装液量为100 mL/250 mL的发酵培养基中，于28 ℃、160 r/min条件下振荡培养3 d。以此为基础，调整各因素水平，研究不同pH值、装液量、发酵时间、发酵温度以及接种量对产酶抑制剂的影响，其因素与水平见表1。
表1 单因素试验的因素与水平
Table 1 Factors and levels of single factor tests
正交试验：根据单因素试验结果，选取对试验结果影响大的因素进行正交试验设计。
1.3.5 目的菌株活性部位的追踪
取目的菌株发酵液于4 ℃、10 000 r/min 离心10 min，得上清液（胞外物）和沉淀，沉淀进一步用磷酸缓冲液（0.1 mol/L，pH 6.8）冲洗3次，超声波破碎细胞，破碎液于4 ℃、10 000 r/min 离心10 min，得上清液即为菌体胞内物[19]，分别测定胞内物和胞外物对α-葡萄糖苷酶的抑制率，初步得到活性部位。
将所得目的菌株的1 L胞外物浓缩至500 mL，依次使用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇4种有机溶剂分别等体积萃取3次，萃取液合并后减压浓缩得到各相浸膏。将浸膏配制成1 mg/mL的待测液，采用PNPG法检测各萃取相对α-葡萄糖苷酶的抑制活性[20]，以质量浓度为1 μg/mL的阿卡波糖溶液作为阳性对照组。
2 结果与分析
2.1 产α-GI内生菌株的筛选
采用PNPG法对产α-GI的内生菌株进行筛选，结果见表2。由表2可知，得到8株内生菌其发酵原液的抑制率在20%以上，其余菌株的抑制率均在20%以下，结果省略。在8株菌株中，菌株PD-14的发酵原液对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高达到60.70%，虽比阳性对照阿卡波糖（98.67%）的低，但仍显示出较高的活性。因此，选择菌株PD-14进行进一步鉴定。
表2 α-葡萄糖苷酶产生菌筛选结果
Table 2 Screening results of α-glucosidase inhibitor-producing strains
2.2 菌株PD-14的鉴定
2.2.1 形态观察
由图1A可知，菌株PD-14在PDA培养基上生长良好，37 ℃培养15 h就可以形成明显的菌落，菌落呈圆形、不透明、湿润、表面光滑凸起。由图1B可知，经革兰氏染色、芽孢染色、镜检，菌株PD-14为革兰氏阳性菌，细胞呈杆状。由图1C可知，菌株PD-14有芽孢且位于菌体中间，芽孢呈椭圆形。根据菌株形态学观察结果，初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌（Bacillus）。
图1 菌株PD-14的菌落形态（A）、革兰氏染色（B）及芽孢染色图（C）
Fig.1 Colony morphology (A),gram staining (B) and spore staining (C)of strain PD-14
2.2.2 分子生物学鉴定
由武汉华大基因科技有限公司测得菌株PD-14的16SrDNA基因序列碱基长度为1 465 bp。根据16SrDNA序列，构建系统发育树，结果如图2所示。由图2可知，菌株PD-14与Bacillus velezensis同属一个分支，与已知菌株Bacillus velezensis LZLJ01的同源性达到100%。结合菌株PD-14的形态观察结果和分子生物学鉴定结果，确定菌株PD-14为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。
图2 菌株PD-14基于16S rDNA基因序列的系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree of strain PD-14 based on 16S rDNA gene sequences
2.3 发酵条件优化单因素试验
由表3可知，随着pH值、装液量、发酵温度、接种量的升高，抑制率均先升后降，分别在初始pH值为7，装液量为125 mL/250 mL，发酵温度为30 ℃，接种量为5%时，发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高。随着发酵时间的增加α-葡萄糖苷酶抑制率逐渐增高，到第3天后趋于平稳，因此选择最优发酵时间为3 d。在上述各因素最佳发酵条件下，α-葡萄糖苷酶抑制率在61.00%～87.85%。
表3 菌株PD-14发酵条件优化的单因素试验结果
Table 3 Results of single factor tests for strain PD-14 fermentation conditions optimization
2.4 菌株PD-14发酵条件优化正交试验
以单因素试验为依据，固定初始pH值为7，选取装液量（A）、发酵时间（B）、发酵温度（C）和接种量（D）4个影响因素，以各因素对α-葡萄糖苷酶的抑制率为评价指标，采用L9（34）正交设计研究不同因素对菌株产α-GI的影响，正交试验设计及结果分析如表4所示，方差分析见表5。
表4 菌株PD-14发酵条件优化的正交试验结果与分析
Table 4 Results and analysis of orthogonal tests for strain PD-14 fermentation conditions optimization
表5 正交试验结果方差分析
Table 5 Variance analysis of orthogonal tests results
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“-”表示对结果影响不显著（P＞0.05）。
由表4可知，4个因素对菌株PD-14产α-GI的影响不同，根据极差大小，各因素影响强弱排序为A＞B＞C＞D，即装液量＞发酵时间＞发酵温度＞接种量，其产α-GI最佳发酵条件组合为A1B3C2D3，即装液量100 mL/250 mL、发酵时间4 d、发酵温度30 ℃、接种量7%。在此优化条件下进行3次平行验证试验，α-葡萄糖苷酶的抑制率为91.05%，与阳性对照1 μg/mL阿卡波糖溶液的抑制率98.67%接近。由表5可知，因素A（装液量）对结果影响达到极显著水平（P＜0.01），而发酵时间、温度和接种量对结果影响不显著（P＞0.05）。
2.5 目的菌株活性部位追踪结果
按照1.3.5方法追踪活性部位，测定菌株PD-14胞内胞外物以及发酵液各萃取相对α-葡萄糖苷酶的抑制率的影响。结果表明，菌株PD-14的胞内物对α-葡萄糖苷酶的抑制率较低，而胞外上清液的抑制率达到60.70%，说明α-GI主要集中在胞外即发酵液中。菌株PD-14发酵液中抑制α-葡萄糖苷酶的有效相为正丁醇相和水相，抑制率分别为77.60%和76.70%（质量浓度为1 mg/mL），阳性对照组的抑制率为95.01%（质量浓度为1 μg/mL）。
3 结论
从罗汉果内生菌中筛选出一株高产α-GI的菌株PD-14，经形态学和分子生物学鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。通过单因素试验和正交试验优化得到该菌株产α-GI的最佳发酵条件为初始pH值为7，装液量100 mL/250 mL，发酵时间4 d，发酵温度30 ℃，接种量7%。此优化条件下，其发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制率达到91.05%，是优化前的1.5倍。发酵液经萃取后，正丁醇相和水相对α-葡萄糖苷酶的抑制率较高，分别为77.61%和76.70%。
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