枸杞（Lycium barbarum L.）亦称枸杞子，是茄科枸杞属的多分支灌木植物，中宁枸杞为宁夏枸杞中的优品[1-3]。研究结果表明，枸杞具有降低胆固醇、减轻动脉硬化、降低血糖等作用[4-6]。不仅能够有效增强各脏腑的机能[7-10]，还能够优化肠道菌群，提高人体免疫力[11-13]。诸多研究都印证了枸杞具有极大的营养价值和广阔的应用前景。
对于枸杞发酵也有很多报道，乔博鑫等[14]研究了保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌组合发酵枸杞过程中理化指标及风味物质的变化，从发酵后的枸杞液中分离出酯类、醛类、酮类、醇类、酸类、芳香杂环类共63种挥发物质；吴昊等[15]以石榴、枸杞为主要原料酿造石榴枸杞酒，并对其发酵工艺进行了响应面优化分析，制成的石榴枸杞酒的酒精度达到9.94%vol，酒体醇厚、酒味怡人、口感尚佳；李彩霞等[16]利用葡萄和枸杞为主要原料，接种酵母菌及醋酸菌发酵酿造复合果醋，制成的果醋中总酸（以醋酸计）为4.27 g/100 mL，还原糖（以葡萄糖计）为2.5 g/L，产品风味纯正，具有特殊的水果香味及较高的营养价值；杨电增等[17]利用响应面优化山药枸杞酸奶最佳生产工艺参数为山药浆添加量7.64%、枸杞粉添加量0.40%、蔗糖添加量8.56%、发酵剂接种量0.21%，此条件下得到的山药枸杞酸奶在总可溶性固形物、蛋白含量、脂肪等指标均高于国家规定的理化值且感官评价良好。但现在的研究多是基于单一菌种通过发酵工艺优化得到的纯种发酵产品，其营养物质及风味物质的种类单一且含量有限，在发酵过程中严重受到菌种自身制约。虽可对其进行工艺优化，但对营养及风味物质的增加与丰富影响有限，影响了发酵产品的进一步升级优化。多菌种复合发酵通过利用菌种之间的代谢组学多样性和生长特性，为解决发酵产品中产物种类单一、产物产量有限、菌种自身瓶颈等问题提供一定的参考。
本研究采用新鲜宁夏枸杞干果，加水磨浆后，接入肠膜明串珠菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌进行发酵。通过单因素及响应面试验优化发酵枸杞汁的最佳工艺参数，以期为复合益生菌发酵枸杞汁的实际应用提供理论和实践依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
宁夏枸杞（特优级，≤280粒/50 g）：市售；小苏打、白砂糖：市售；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）：宁夏食品微生物应用技术与安全控制重点实验室保藏；D-异抗坏血酸钠：江西省德兴市百勤异VC钠有限公司；氢氧化钠：天津市北联精细化学品开发有限公司；酚酞：天津市大茂化学剂厂；MRS肉汤、MRS固体培养基：北京陆桥技术股份有限公司；芦丁标准品（纯度＞98%）、考马斯亮蓝G-250、牛血清白蛋白：北京索莱宝科技有限公司；所有试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
V-5100紫外分光光度计：上海精科实业有限公司；RZ-988e Royalstar 打浆机：合肥荣事达小家电公司；PLD-HDE2.0手持糖量计：陕西普洛帝测控技术有限公司；PB-LO pH计：赛多利斯科学仪器有限公司；LRH-150-B生化培养箱：韶关市泰宏医疗器械有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 复合益生菌发酵枸杞汁工艺流程及操作要点
取出在-80 ℃条件下甘油保藏的4种菌株（嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、肠膜明串珠菌、植物乳杆菌），解冻至室温。在无菌操作台上进行平板划线，随后置于生化培养箱中37 ℃恒温培养8～10 h，重复操作3次，使其充分活化。在无菌条件下挑取单菌落，接种到MRS液体培养基中，37 ℃、200 r/min摇床振荡培养8～10 h后取出，获得发酵用菌悬液。
挑除枸杞干果中的烂果、霉果，用自来水冲洗表面，去除杂质后按一定的料水比加入蒸馏水，加入0.15 g/kg D-异抗坏血酸钠，混合均匀，封口置于干燥阴凉处浸泡10～12 h后进行打浆，并用无菌纱布过滤。随后向滤液中加入5%的白砂糖，用小苏打调pH至6.5～7.0后巴氏杀菌（65 ℃、30 min）。待枸杞汁冷却至30～35 ℃后进行分装，接种一定比例制备好的菌悬液，37 ℃恒温培养一定时间，终止发酵后放入4 ℃冰箱冷藏。
1.3.2 单因素试验
固定其他条件，以感官评分和乳酸含量为评价指标，分别考察复合益生菌配比（植物乳杆菌∶肠膜明串珠菌∶嗜热链球菌∶保加利亚乳杆菌=1∶1∶1∶1、1∶2∶2∶2、1∶3∶3∶3、2∶1∶2∶3、3∶3∶2∶1，V/V）、料水比（1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12（g∶mL））、接种量（3%、4%、5%、6%、7%）和发酵时间（2 h、4 h、6 h、8 h、10 h）对发酵枸杞汁品质的影响。
1.3.3 响应面试验优化
在单因素试验的基础上，以料水比（A）、接种量（B）、发酵时间（C）为3个考察因素，发酵枸杞汁的感官评分（Y）为考察指标，利用Design-Expert v8.0.6.1软件进行Box-Behnken响应面分析和优化，响应面试验因素与水平见表1[19]。
表1 发酵枸杞汁发酵条件优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface methodology for fermented Lycium barbarum juice fermentation conditions optimization
1.3.4 测定方法
乳酸含量：参照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》[20]；乳酸菌菌落数：参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[21]；总糖：参照GB 5009.7—2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》[22]；总黄酮：参照SN/T 4592—2016《出口食品中总黄酮的测定》[23]；蛋白质：参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[24]；致病菌：参照GB 4789.6—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》[25]。
感官评价：由10名不同年龄、性别、具有丰富评定经验的专业人员组成评定小组，从发酵产品的口感、组织状态、色泽、香气4个方面综合进行评定，满分为100分，取平均分进行评定。发酵枸杞汁感官评分标准见表2。
表2 发酵枸杞汁感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of fermented Lycium barbarum juice
续表
2 结果与分析
2.1 发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 菌种比例对发酵枸杞汁乳酸含量和感官评分的影响
图1 复合益生菌配比对发酵枸杞汁乳酸含量和感官评分的影响
Fig.1 Effect of composite probiotics ratio on lactic acid content and sensory score of fermented Lycium barbarum juice
由图1可知，随着复合益生菌配比的变化，发酵枸杞汁乳酸含量为370～430 mg/100 mL，表明所有复合益生菌配比均可较好地使菌种利用体系中的可发酵糖进行乳酸的积累。虽然各水平间乳酸含量较为接近，但感官评分差异较大。可能是由于菌种之间生长和代谢特性不同，不同时期发酵枸杞汁中的主导菌群不同，从而影响挥发性物质的种类和含量，最终导致感官评分出现较大差异。当植物乳杆菌∶肠膜明串珠菌∶嗜热链球菌∶保加利亚乳杆菌=3∶3∶2∶1时，乳酸含量为429 mg/100 mL，感官评分达到85分。综合考虑，确定最佳复合益生菌配比为植物乳杆菌∶肠膜明串珠菌∶嗜热链球菌∶保加利亚乳杆菌=3∶3∶2∶1（V/V）。
2.1.2 料水比对发酵枸杞汁乳酸含量和感官评分的影响
图2 料水比对发酵枸杞汁乳酸含量和感官评分的影响
Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on lactic acid content and sensory score of fermented Lycium barbarum juice
由图2可知，发酵枸杞汁乳酸含量随料水比中水含量的增加而增加，可能是因为在一定范围内水含量的增加有助于提高多糖等营养物质的扩散传质效率，提高浸出率[26]，使得乳酸菌更易于利用底物产生乳酸。料水比为1∶10（g∶mL）时，发酵枸杞汁中乳酸含量为439 mg/100 mL，当料水比为1∶12（g∶mL）时，乳酸含量达到448 mg/100 mL。
随着水含量的增加，发酵枸杞汁的感官评分先升高后降低，料水比为1∶10（g∶mL）时，感官评分最高达83分。综合考虑，选取料水比1∶8、1∶10、1∶12（g∶mL）进行后续响应面试验。
2.1.3 接种量对发酵枸杞汁乳酸含量和感官评分的影响
图3 接种量对发酵枸杞汁乳酸含量和感官评分的影响
Fig.3 Effect of inoculum on lactic acid content and sensory score of fermented Lycium barbarum juice
由图3可知，发酵枸杞汁乳酸含量随接种量的增加而增加，在接种量达到6%时，乳酸含量为432 mg/100 mL；在接种量达到7%时，乳酸含量为最大值485 mg/100 mL。在接种量为6%～7%时，乳酸含量上升幅度较小，可能是由于负责产生乳酸的菌体由于发酵后期发酵枸杞汁中可发酵性糖的缺乏，不能维持菌体生长，在竞争中处于劣势，逐渐丧失优势菌种地位。
随着接种量的增加，发酵枸杞汁的感官评分先升高后降低，接种量为5%时，感官评分最高达88分。综合考虑，选取接种量4%、5%、6%进行后续响应面试验。
2.1.4 发酵时间对发酵枸杞汁乳酸含量和感官评分的影响
图4 发酵时间对发酵枸杞汁乳酸含量和感官评分的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on lactic acid content and sensory score of fermented Lycium barbarum juice
由图4可知，随着发酵时间的延长，发酵枸杞汁乳酸含量呈逐渐增加趋势，在发酵时间6～8 h时，乳酸含量增幅最大，为150 mg/100 mL。可能由于在此时间段内，菌体加速生长繁殖进入对数生长期，发酵枸杞汁中可发酵性糖的消耗速率大大增加，乳酸含量大幅上升。8 h后菌体生长进入稳定期，菌体生长代谢速度放缓，乳酸含量增幅不显著。发酵10 h时，发酵枸杞汁乳酸含量最大，为485 mg/100 mL。
随着发酵时间的延长，发酵枸杞汁感官评分呈先上升后下降的趋势。在发酵进行到8 h时，发酵枸杞汁感官评分最高，达89分。综合考虑，选取发酵时间6 h、8 h、10 h进行后续响应面试验。
2.2 发酵工艺优化响应面试验
枸杞汁发酵条件优化响应面试验结果见表3，根据表3进行多元回归拟合，得到响应面回归模拟方程为：Y=94.60-6.38A+5.13B-5.75C+4.25AB-1.00AC+2.50BC-7.68A2-6.17B2-14.43C2
表3 枸杞汁发酵条件优化Box-Behnken试验设计及结果
Table 3 Design and results of Box-Behnken design for fermented Lycium barbarum juice fermentation conditions optimization
表4 以感官评分为响应值的回归模型及方差分析
Table 4 Regression model and variance analysis with sensory score as response value
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
由表4可知，该模型P＜0.01，说明该模型极显著；失拟误差P＞0.05，说明没有产生失拟现象。校正决定系数R2adj为0.972 7，表明有约97.27%的感官评分由此模型进行解释；方程的决定系数R2为0.988 0，说明拟合度良好，方程的显著性及可靠性极高。各项方差分析表明，一次项A、B、C，交互项AB，二次项A2、B2、C2对感官评分有极显著影响（P＜0.05）；交互项BC对感官评分有显著影响（P＜0.05）；交互项AC对感官评分影响不显著。模型的F值可以反映各因素对试验响应值的重要性，F值越大，表明对试验响应值的影响越大，重要性越大[27]。根据F值大小可知，各因素对乳酸含量影响的主次因素为A＞C＞B，即料水比＞发酵时间＞接种量。
等高线的形状可反映出交互效应的强弱大小，椭圆形表示2个因素交互作用显著，而圆形则与之相反[28-29]。由图5可知，AB、BC交互作用存在最大值，交互作用显著（P＜0.05），AC交互作用不显著（P＞0.05）。
图5 料水比、接种量、发酵时间交互作用对发酵枸杞汁感官评分影响的响应曲面及等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction of solid-liquid ratio,inoculum and fermentation time on sensory evaluation of fermented mash
复合益生菌发酵枸杞汁的最佳工艺为料水比1∶9.35（g∶mL），接种量5.26%，发酵时间7.67 h，在此条件下，复合益生菌发酵枸杞汁感官评分预测值为97.172 3分。考虑试验可操作性，修正最佳工艺条件为：料水比1∶9（g∶mL），接种量5%，发酵时间8 h。在此条件下，复合益生菌发酵枸杞汁的感官评分达到96分，与预测值接近。说明模型拟合性良好，验证了模型的有效性。
2.3 发酵枸杞汁品质分析
制得的发酵枸杞汁的最终pH 4.32，乳酸含量432 mg/100 mL，活菌数为2.3×108 CFU/mL，总糖含量为155 mg/100 mL，总黄酮含量0.25 mg/100 mL，蛋白质含量0.2 g/100 mL。
3 结论
以宁夏枸杞干果为原料，利用多种乳酸菌对枸杞汁进行混合发酵，得出最优发酵条件为复合益生菌配比植物乳杆菌∶肠膜明串珠菌∶嗜热链球菌∶保加利亚乳杆菌=3∶3∶2∶1（V/V），料水比1∶9（g∶mL），接种量5%，发酵时间8 h。在此优化工艺条件下制得的发酵枸杞汁的最终pH 4.32，乳酸含量432 mg/100 mL，活菌数为2.3×108 CFU/mL，总糖含量为155 mg/100 mL，总黄酮含量0.25 mg/100 mL，蛋白质含量0.2 g/100 mL。该饮料为橘红色，色泽明亮，酸甜平衡，具有枸杞的特征滋味，感官评分达到96分。
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