赤霞珠（Cabernet Sauvignon）是一种用于酿造葡萄酒的红葡萄品种，原产自法国波尔多（Bordeaux）地区，生长容易，适合多种不同气候，在全世界都有广泛种植，虽然几乎有葡萄酒出产的地方都可以见到赤霞珠的身影，但是它在世界各地区的表现是有所差异的。赤霞珠葡萄在中国葡萄酒产区栽培范围最广[1]，主要产区包括山东半岛、宁夏贺兰山东麓、新疆、河北、云南、山西清徐、甘肃武威等[2]。葡萄酒的感官品质主要包括色泽、香气及口感，其中口感是葡萄酒感官品质的重要方面，葡萄酒的基本味觉成分都是可溶于水或酒精水溶液中的非挥发物质[3]，主要包括糖类、醇类、有机酸类和酚类物质，而酚类物质对红葡萄酒感官的作用尤为重要[4]。发酵过程中酵母利用糖分发酵成酒精，同时产生大量的中间与最终产物（如甘油等），这些成分构成了葡萄酒的甜味来源。葡萄酒中的酸类物质主要包括来自果实的酒石酸、苹果酸和柠檬酸以及苹果酸-乳酸发酵产生的乳酸。多酚在葡萄酒中产生涩感和/或苦味，葡萄酒中的多酚化合物主要来自葡萄果皮、籽和果梗[5]，橡木也会给葡萄酒增加一些单宁[6]。单宁具有涩感，分为水解单宁和缩合单宁[7]。缩合单宁属于黄烷-3-醇类[8]，在葡萄酒中主要是由儿茶素类化合物通过C4～C6和C4～C8键形成的聚合物[9]。原花青素是原花色素（缩合单宁）中最主要的一类化合物，是葡萄酒中的主要多酚，原花青素二聚体B1和B2是葡萄中最丰富的。红葡萄酒的苦味主要是由阈值浓度下黄烷-3-醇产生的，黄烷-3-醇类单体包括儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表棓儿茶素、棓儿茶素等，其中儿茶素虽然也呈涩感通常被认为贡献更多的苦味[4]。葡萄酒中非挥发风味物质种类繁多，并且不同风味物质之间存在相互作用（中和效应、协同效应、拮抗效应）[10]，因此，红葡萄酒的味感平衡表现为甜味与酸味、苦涩感的总和的平衡，即甜味↔酸味＋苦味[11]。
酚类物质对红葡萄酒的收敛性具有重要作用[12]，研究表明，葡萄酒的干涩与儿茶素、表儿茶素、表棓儿茶素及原花青素B1、B2含量显著正相关[13]。左俊伟[14]对不同产区赤霞珠干红葡萄酒口感特征分析发现，酸味、涩味、苦涩味、丰厚度为各产区酒样的主要特征口感物质。非挥发风味物质对葡萄酒风味特征的影响首先取决于品种[15]。其次，同一品种在不同的生态因素（温度、光照、土壤和水）的互相作用下，其果实特性和葡萄酒品质参数都会受到影响[16]。即使在同一产区，不同地块葡萄园所产的葡萄酒其挥发性成分在种类和含量都表现为各自特有的品质特性[17]。国内外研究已经证实同一酿酒葡萄品种在不同产区栽培，其果实品质具有地域特征性。杨洋等[18]研究了三个不同产区赤霞珠葡萄果实品质的指标发现，新疆石河子、山东蓬莱和宁夏银川果实的含糖量、可滴定酸含量、总酚和单宁含量以及挥发性香气物质的组成等果实品质指标均存在显著差异。马磊[19]通过超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）分析葡萄酒中非挥发风味物质，实现对葡萄酒样品在产区和品种间的有效识别，证明了中国葡萄酒基于有机酸和酚类物质的种类和含量具有良好产地和品种间的特征性。国外研究学者基于葡萄酒的风味成分对葡萄酒产区和品种特征性的研究已经很广泛，BOSELLI E 等[20]对意大利白葡萄酒指纹图谱分析，表明了同一产区、不同品种其化学成分和感官特性完全不同。SOUFLEROS E H等[21]通过对白葡萄酒中游离氨基酸的含量实现了产地、品种和年份的判别分析。
本研究以中国宁夏贺兰山东麓、河北怀来、新疆焉耆等三个产区出产的2016年份15款赤霞珠干红葡萄酒为对象，选定的三个葡萄酒产区南北纬度上差异不大，但海陆热力性差异突出，自东向西从湿热的海洋气候过渡到干旱半干旱的沙漠气候[22]，采用光谱法、比色法和高效液相色谱法分析非挥发风味物质（糖类、醇类、酸类及酚类等）含量，寻找葡萄酒中非挥发风味物质与产区之间的联系与差异，讨论通过非挥发风味物质区分不同产区葡萄酒的可能性，以期对不同风土条件下葡萄酒的风格特征研究提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 酒样
样品取自中国三个葡萄酒产区（宁夏贺兰山东麓、新疆焉耆、河北怀来）不同酒庄出产的2016年15款赤霞珠干红葡萄酒，均采用传统工艺酿造，酒样信息详见表1。
表1 酒样信息
Table 1 Information of wine samples
1.1.2 化学试剂
福林-酚（Folin-Ciocalteau）试剂盒、没食子酸标准品（纯度≥98%）、对二甲基氨基肉桂醛（4-dimethylamino-cinnamon-aldehyde，DMACA）试剂盒、儿茶素标准品（100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L）：西班牙Bio Systems S.A.公司；原花青素标准品（纯度≥95%）：北京博奥拓达科技有限公司；儿茶素（catechin，C）、表儿茶素（epicatechin，EC）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate，EcG）、表棓儿茶素（epigallocatechin，EgC）、棓儿茶素（gallocatechin，GC）、原花青素B1（procyanidin B1，PC B1）、原花青素B2（procyanidin B2，PC B2）（纯度均≥98%）：上海源叶生物科技有限公司；硫酸铁铵、盐酸、正丁醇、乙酸乙酯（均为分析纯）：北京化工厂；甲醇、乙酸、乙腈（均为色谱纯）：上海麦克林生化科技有限公司。
1.2 仪器与设备
FOSS WineScanTM葡萄酒分析仪：丹麦福斯（中国）有限公司；Bio Systems S.A.Y350半自动分析仪：西班牙Bio Systems S.A.公司；UV-1780分光光度计、LC-20AD高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪（配有SPDM20A紫外检测器和LabSolutions色谱数据处理系统）：岛津（中国）有限公司；platisil ODS色谱柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）：北京迪马科技有限公司；RE-2000A旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；SHZ-III循环水真空泵：上海知信实验仪器技术有限公司。
1.3 方法
1.3.1 酒样常规理化指标测定
酒精度、还原糖、总酸、pH、挥发酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸等采用FOSS WineScanTM葡萄酒分析仪检测。
1.3.2 总酚和黄烷醇含量的测定
（1）总酚含量的测定[23-24]
用移液枪精确吸取没食子酸标准品/酒样12 μL于比色皿中，加入Folin-Ciocalteau试剂盒A液800 μL，室温（16～25 ℃）反应2 min，然后加入B液800 μL混匀，室温反应8 min，分别在波长750 nm条件下测定试剂空白、标准品和酒样的吸光度值A。以没食子酸质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制没食子酸标准曲线，得到回归方程：y=0.000 7x+0.01，相关系数（R2）＞0.99。按照标准曲线回归方程计算样品中总酚含量（以没食子酸计）。
（2）黄烷醇含量的测定[25]
精确吸取标准品/酒样24 μL于比色皿中，加入DMACA试剂盒中A液800 μL，混匀，室温反应2 min，在波长620 nm条件下测吸光度值A1。然后在反应体系中加入B液800 μL（B1液和B2液现用现混），混匀，室温反应5 min。在乙醇和酸性介质的存在下，样品中的黄烷醇类物质与发色基团对二甲基氨基肉桂醛反应，形成有色复合物，在波长620 nm条件下测定试剂空白、标准品和酒样的吸光度值A2。根据如下公式计算标准品/样品吸光度值的增量：
A=（A2-0.49×A1）标品/样品-（A2-0.49×A1）试剂空白
以儿茶素质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制儿茶素标准曲线，回归方程：y=0.000 9x+0.010 4，相关系数（R2）=0.999 4。按照标准曲线回归方程计算样品中黄烷醇含量（以儿茶素计）。
1.3.3 总原花青素含量的测定[26]
溶液配制：2%硫酸铁铵溶液、盐酸正丁醇溶液、2 mol/L盐酸溶液、0.5 mg/mL原花青素标准品溶液。
原花青素标准曲线的制作：用刻度移液管分别精确吸取0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL原花青素标准品溶液于25 mL比色管中，用体积分数为95%乙醇定容至3 mL，得到原花青素标准品质量浓度梯度为0、0.017 mg/mL、0.033 mg/mL、0.050 mg/mL、0.067 mg/mL、0.083 mg/mL。然后分别加入0.2 mL 2%硫酸铁铵溶液和6 mL盐酸正丁醇溶液，盖塞，摇匀。在95 ℃恒温水浴中保持40 min，取出，浸入冷水中快速冷却，溶液显红色（或黄色）。取出比色管，在波长546 nm条件下测定其吸光度值，以原花青素质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制原花青素标准曲线，得到回归方程：y=43.684x+0.664 7，相关系数（R2）=0.999 7。
样品稀释及测定：吸取样品1～2 mL于25 mL容量瓶中，定容至刻度，取3 mL稀释后样品，按标准品溶液的测定步骤，测定酒样的吸光度值，按照原花青素标准曲线回归方程计算酒样中总原花青素的含量。
1.3.4 黄烷-3-醇单体和原花青素B1、B2含量的测定[27]
酒样前处理：采用乙酸乙酯液-液萃取法，取10 mL酒样，用30 mL乙酸乙酯，萃取3次，收集有机相，旋转蒸发仪（25 ℃）浓缩至干，用10 mL色谱级甲醇溶解，-18 ℃避光保存，待液相色谱分析。样品测定前经0.22 μm微孔滤膜过滤。
液相色谱分析条件：采用platisil ODS色谱柱（250 mm×4.6 mm×5 μm），紫外检测波长为280 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL，流速1 mL/min。流动相A为水∶乙酸（98∶2，V/V），流动相B为乙腈，梯度洗脱程序：0～10 min，10%B；10～15 min，10%～20%B；15～26 min，20%～40%B；26～30 min，40%～100%B；30～35 min，100%～10%B；35～40 min，10%B。
酚类物质单体标准曲线的绘制：精确称取7种酚类物质标准品5 mg，于10 mL棕色容量瓶中，甲醇定容，得到500 mg/L的混合标准品溶液，稀释成不同浓度梯度，-18 ℃保存。
1.3.5 数据处理
通过IBM SPSS Statistics 22.0对酒样理化指标进行单因素方差分析（anaylsis of variance，ANOVA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）。实验数据均平行测定3次，结果以平均值±标准差（
±s）表示。
2 结果与分析
2.1 黄烷-3-醇单体和原花青素B1、B2的含量的测定
对7种物质混标进样分析，标准品高效液相色谱图见图1。由图1可知，7种物质能得到有效分离且出峰时间稳定。按照优化好的色谱条件进样分析，以峰面积（y）为纵坐标，物质含量（x）为横坐标，建立标准曲线，回归方程、相关系数见表2。由表2可知，各物质的含量与峰面积呈良好的线性关系，相关系数（R2）＞0.99，各物质的最低检测限均低于0.20 mg/L，将同一标样和样品分别连续进样6次，记录其保留时间和峰面积，标准品和样品保留时间的相对标准偏差均在1%以内，峰面积的相对标准偏差均在4%以内，表明色谱工作稳定、重复性好。
图1 7种酚类物质标准品高效液相色谱图
Fig.1 HPLC chromatogram of 7 phenols standards
1.棓儿茶素GC；2.原花青素B1；3.表棓儿茶素EgC；4.儿茶素C；5.原花青素B2；6.表儿茶素EC；7.表儿茶素没食子酸酯EcG。
表2 各酚类物质的标准曲线和保留时间
Table 2 Standard curve and retention time of each phenols
根据上述色谱条件，对采集的酒样进行测定，按照各酚类物质的标准曲线回归方程计算酒样中各酚类物质含量。
2.2 不同产区干红葡萄酒非挥发风味物质特征的比较
不同产区酒样理化指标测定结果见表3。
表3 不同产区赤霞珠干红葡萄酒样品理化指标
Table 3 Physical and chemical indexes of Cabernet Sauvignon dry red wine samples from different regions
注：“*”表示差异显著（P＜0.05）；“**”表示差异极显著（P＜0.01）。
由表3可知，不同产区赤霞珠干红葡萄酒酒石酸、总酚、总原花青素、黄烷醇、原花青素B1、表棓儿茶素、儿茶素、原花青素B2、表儿茶素没食子酸酯含量存在显著差异；新疆焉耆产区与宁夏贺兰山东麓产区相比，酒石酸、总原花青素、黄烷醇、原花青素B1、表棓儿茶素、儿茶素、原花青素B2含量存在极显著差异（P＜0.01），总酚和表儿茶素没食子酸含量存在显著差异（P＜0.05）；河北怀来产区与宁夏贺兰山东麓产区相比，总酚、总原花青素、表棓儿茶素含量存在极显著差异（P＜0.01），原花青素B2含量存在显著差异（P＜0.05）。存在差异性的原因可能是因为三个产区的气候、光照、降水量、土壤以及葡萄酒酿造和陈酿方式的不同。
2.3 赤霞珠干红葡萄酒的非挥发风味物质含量主成分分析和层次聚类分析
对供试酒样非挥发风味物质含量进行主成分分析，大量原始信息被降为前2个主成分，分别占总体方差贡献率的33.66%和27.07%，占总成分的60%以上。各指标在前2个主成分上的载荷图见图2。由图2可知，总酚、黄烷醇、总原花青素、表棓儿茶素、儿茶素、原花青素B1、原花青素B2、表儿茶素没食子酸酯聚集在第1主成分的正向端，酒精度、还原糖、总酸、柠檬酸、苹果酸聚集在第2主成分的正向端。第1主成分中包含的物质都是与葡萄酒的苦涩感相关的酚类物质，第2主成分中包含的物质是与葡萄酒甜感和酸感相关的物质，结果表明干红葡萄酒中的酚类物质是影响其风格和品质的重要因素。
图2 理化指标主成分分析的因子载荷图
Fig.2 Factors load diagram of physical and chemical indexes by principal component analysis
不同产区干红葡萄酒层次聚类分析结果见图3。由图3可知，新疆焉耆产区酒样与其他产区酒样可以明显归为两类，结合表3，焉耆产区酒样还原糖和总酸含量均高于另外两个产区，可能因为焉耆产区气候相对温暖、日照强烈、干燥少雨，使酿酒葡萄酒积累浓郁的风味物质。宁夏贺兰山东麓产区与河北怀来产区酒样也得到了很好的区分，结合表3，河北怀来产区酒样各酚类物质含量均高于宁夏贺兰山东麓产区，也可能是因为产区风土条件的不同，河北怀来产区受到季风气候的影响，四季分明，海拔高的地区气候比较凉爽，而贺兰山东麓产区属于典型的大陆性半湿润半干旱气候，昼夜温差大，空气湿度小。相同产区酒样聚类在一起，表明相同年份相同品种的酒样，产区是影响其风味差异的重要因素，本研究中酒样中非挥发性物质的含量指标可以作为鉴别酒样产区的依据。
图3 不同产区干红葡萄酒层次聚类分析结果
Fig.3 Hierarchical cluster analysis results of dry red wines from different regions
3 结论
本实验通过对中国三个葡萄酒产区出产的2016年份15款赤霞珠干红葡萄酒中非挥发风味物质的分析发现，甜味指标（酒精度、还原糖）和酸味指标（总酸、pH、苹果酸、乳酸、柠檬酸）在不同产区酒样间差异不显著（P＞0.05），但酒石酸含量存在显著性差异（P＜0.05）；而不同产区酒样的主要苦涩味指标（总酚、总原花青素、黄烷醇、儿茶素、表棓儿茶素、原花青素B1、原花青素B2）存在极显著性差异（P＜0.01）。
对供试干红葡萄酒样非挥发风味物质含量进行主成分分析显示，原花青素B1、原花青素B2、儿茶素、黄烷醇、总酸、还原糖、酒精度对呈味特征贡献较大；经聚类分析显示，同年份赤霞珠干红葡萄酒非挥发风味物质的产区聚类结果与酒样产区来源一致表明可以基于非挥发风味物质实现对葡萄酒产区的判定。
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