新平酸腌菜是以当地称为青菜的叶用芥菜（Brassica juncea）加盐及各种调料经多种微生物发酵而成，滋味酸爽、香气浓郁，是我国云南极具地方特色的一种传统发酵蔬菜[1-3]。可直接食用，也可作为酸味调味品，风味独特，具有开胃、促食欲等功能[4-5]。目前，针对酸菜的主要研究集中在微生物的分离与鉴定、发酵过程中亚硝酸盐的控制、发酵工艺的优化以及酸菜中有机物动态变化等方面，而生产实践中，生产者会经验性地添加食盐以保证酸菜的顺利发酵，但对盐分如何影响其中的微生物相关研究报道则相对较少[6-8]。因此，科学阐明食盐与酸菜发酵微生物的关系将有助于生产工艺标准化、控制产品质量稳定性以及指导工艺改进，也有助于更好地利用和发展酸菜菌种资源。研究酸菜中的微生物多样性主要有传统培养法和非培养法。虽然传统方法能对分离的菌种进行鉴定并分析其多样性，但步骤繁琐、耗时费力，无法分离大部分不可培养的微生物且检出率及灵敏度不高，还易受到环境因素的影响，无法全面分析酸菜中微生物群落多样性[9-11]。非培养法不依赖培养过程，大大缩短了样品的分析时间，而且还能显示环境样品中不可培养的微生物的遗传信息，有助于快速、准确地对复杂微生物区系菌群结构演替和多样性进行分析[12-13]。近年来，高通量测序以其速率快、准确定量、实时检测等特点，已广泛应用到环境样本的微生物多样性分析中。
本实验采用高通量测序技术对无盐和有盐（盐度10%）腌制的新平酸腌菜在主发酵期理化指标波动较大的三个时间点的样品细菌多样性进行测序分析，研究盐分对新平酸腌菜细菌菌群结构差异的影响，同时对无盐和有盐（盐度10%）腌制的新平酸腌菜理化指标进行测定，建立理化指标与细菌群落之间的相关性，为今后酸菜制作工艺改进提供一定理论参考，并为深入机理研究奠定一定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
叶用芥菜：云南省玉溪市新平县平甸乡菜市场；食盐及辅料等（均为食用级）：云南昆明盘龙区东华家乐福超市；发酵坛子（5 L，容量、形状及材质统一）：云南昆明华森试剂公司；食品中亚硝酸盐含量测定试剂盒：苏州科铭生物技术有限公司；样品脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取，16S rRNA V3-V4区引物合成及测序建库：委托北京诺禾致源科技股份有限公司完成。
1.2 仪器与设备
PHS-25型雷磁pH计：上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；UV-1000紫外可见分光光度计：上海跃进医疗器械有限公司；YXQ-75G立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司；HH-2数显电子恒温水浴锅：金坛市丹瑞电器厂；universial 32R高速冷冻离心机：华粤企业集团有限公司；CP64C电子天平：上海志荣电子科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 酸菜的制备
本实验的酸菜样品均取于采用传统方法自制的新平酸腌菜。发酵方法如下：挑选结实饱满，无腐烂及病虫害的叶用芥菜，将其在通风且阳光充足的室外晾晒2 d后，去除老黄叶片并清洗干净，将其切碎，加辅料，之后按无盐、有盐（盐度10%）分别处理，反复揉搓，按同等体积比（1∶3）放入5 L的玻璃坛子，每个盐浓度32罐，置于室内密封常温发酵30 d。从第1天开始取样，之后每隔2 d取样，进行pH、总酸、亚硝酸盐（nitrite，NIT）含量跟踪检测[14-15]。通过理化指标的数据统计与分析，加之考虑亚硝酸盐含量影响酸菜的食用安全性，从两个盐浓度腌制的酸菜系列样品中，于pH值持续降低，总酸含量持续快速升高的主发酵期，分别选取亚硝酸盐含量上升、顶峰、明显降低三个时间拐点的样品，进行细菌多样性分析。
1.3.2 发酵酸菜的指标测定
发酵酸菜罐的多方位置混合取样25 g，加250 mL无菌蒸馏水混匀，用研钵研磨成匀浆四层纱布过滤，分别对滤液进行测定[16-18]：采用pH计测定对应样品的pH值；参考GB/T 12456—2016《食品中总酸的测定》对酸菜样品的总酸进行测定；亚硝酸盐含量测定参照GB 5009.33—2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定》中的盐酸萘乙二胺法，采用食品中亚硝酸盐含量测试盒测定，其标准曲线回归方程为：y=0.234x+0.000 2，相关系数R2=0.999。
1.3.3 细菌总DNA提取及多样性分析
选取对应指标变化明显的3个时间点的无盐和有盐（盐度10%）酸菜样品各25 g，于250 mL装有7～8 mm的玻璃珠的无菌水中摇床（180 r/min）振荡1 h，用灭菌后的纱布进行过滤处理，除去其中所含杂质，放入高速冷冻离心机之后4 ℃、10 000×g条件下离心5 min收集菌体沉淀，无盐腌制的酸菜样品编号为SCL1、SCL2、SCL3（SCL1对应亚硝酸盐含量上升时间点，SCL2对应亚硝酸盐含量高峰点，SCL3对应亚硝酸盐含量明显降低时间点）；有盐（盐度10%）腌制的酸菜样品编号为SCG1、SCG2、SCG3（SCG1对应亚硝酸盐含量上升时间点，SCG2对应亚硝酸盐含量高峰点，SCG3对应亚硝酸盐含量明显降低时间点），冷藏保存。采用16SrRNA基因的V3-V4区[19-21]引物对338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'），806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）委托北京诺禾致源科技股份有限公司进行样品DNA提取及Illumina NovaSeq测序平台进行测序，并使用Novomagic V2.0云平台进行多样性分析。
1.3.4 数据处理
理化指标数据均平行测定3 次，使用SPSS 22.0软件对数据进行统计学处理，所有数据以平均值±标准差（x¯±SD）表示。利用Cutadapt软件对高通量初始数据进行处理[22]；然后用Usearch软件和Uchime软件进行序列的质量筛选和优化[23]，得到最终的原始数据；利用Uparse软件对所有样品的有效序列以97%的一致性进行操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）聚类[24]；用Mothur结合SILVA的SSUr-RNA数据库进行物种注释分析[25-26]，获得分类学信息并分别在各个分类水平统计各样本的群落组成；使用Qiime软件计算Shannon、Simpson、Chao1、Goods-coverage指数，以及计算Unifrac距离、构建UPGMA样本聚类树；使用R软件绘制稀释曲线，进行Alpha和Beta多样性指数组间差异分析以及环境因子关联分析。
2 结果与分析
2.1 酸菜基本理化指标
如表1所示，无盐和有盐（盐度10%）酸菜样品理化指标变化明显的起始点和平缓点时间一致，高峰点出现时间稍微不同。两个盐浓度处理的酸菜pH 值均介于5～6之间，有一定的变化趋势，无盐腌制的酸菜pH 值较有盐腌制的降低得更快，而有盐腌制的酸菜pH值起始就比无盐的低；而无盐腌制的酸菜总酸含量相对于有盐腌制增加得更快；酸腌菜属于发酵蔬菜制品，其亚硝酸盐含量应符合国标限量（以NaNO2计）为20 mg/kg[17-18]，无盐处理组的亚硝酸盐含量高峰点（20.264 mg/kg）稍微超出国标限量，而有盐（盐度10%）处理组整个发酵期间亚硝酸盐含量均符合国标限量。总酸是酸菜酸味的主要体现者，亚硝酸盐含量多少影响着酸菜食用安全性，于pH值持续降低，总酸含量持续快速升高的主发酵期，分别选取亚硝酸盐含量上升、顶峰、明显降低三个时间拐点的样品对后续分析其细菌多样性具有重要意义。
表1 无盐与有盐腌制酸菜的理化性质
Table 1 Physical and chemical properties of salt-free and salt-treated pickle
注：无盐腌制的酸菜样品对应编号为SCL1、SCL2、SCL3；有盐腌制的酸菜样品对应编号为SCG1、SCG2、SCG3。下同。
2.2 细菌多样性
2.2.1 样本16S rRNA基因序列质量评估
稀释曲线可直接反映测序数据量的合理性，并间接反映样本中物种的丰富程度[25-27]。如图1所示，稀释曲线在序列数达到30 000条左右后趋向平坦，再增加测序量对于发现新物种的边际贡献很小。说明测序数据量合理，所含菌种数较多，现有测序量已经可以反映样品中细菌丰度信息。
图1 酸菜样品的细菌稀释曲线图
Fig.1 Rarefaction curves for bacteria in pickle samples
2.2.2 Alpha多样性分析
Alpha多样性用于分析样品内部微生物群落的物种丰富度[27]。对Illumina NovaSeq 测序得到的下机数据（Raw PE）进行拼接和质控，得到Clean Tags，再进行嵌合体过滤，得到可用于后续分析的有效数据（Effective Tags）。对所有样品的Effective Tags进行聚类，以97%的一致性将序列聚类成为操作分类单元（operational taxonomic units，OTU），基于OTU对6个酸菜样品中细菌的Alpha多样性进行分析评估，其中Shannon指数反映样本的各物种均匀度，指数越高，物种分布越均匀；Simpson指数反映物种的多样性，指数越小，多样性越高；Chao1指数常用来估计物种总数，反映物种丰富度。Alpha多样性指数结果见表2。
表2 酸菜样品中细菌Alpha多样性
Table 2 Alpha diversity of bacteria in pickle samples
由表2可知，共获得细菌群落3 界、22 门、36 纲、87目、166 科、339属，902个OTU。通过高通量测序，从6个酸菜样本中共获得397 292条有效序列，其中SCL3获得的OTU数最多，SCG3获得的OTU数最少，而SCG1获得的OTU数高于SCL1，SCL2和SCL3获得的OTU数则相对高于SCG2和SCG3；无盐腌制组的样品发酵后期均匀度高，而有盐腌制均匀度相对变化不大，且无盐腌制组的均匀度高于有盐腌制组；无盐和有盐（盐度10%）腌制的样品发酵前期物种多样性均高于后期，且有盐（盐度10%）腌制组的物种多样性均高于无盐腌制组；无盐腌制组的样品发酵后期物种丰富度高，有盐（盐度10%）腌制组的样品发酵前期物种丰富度高，且SCG1物种丰富度高于SCL1，SCL3物种丰富度最高，SCG3物种丰富度最低。说明盐分的存在会抑制某些细菌，从而导致物种丰富度降低。所有样品的覆盖率（Coverage）指数均＞0.9，说明样品文库中序列的覆盖率高，可反映样品测序的真实情况。
2.2.3 Venn图分析
Venn 图分析可以展示多样品（或分组）共有和各自特有OTU数目，直观的表现环境样本间（或分组）的组成相似性及重叠情况[27-28]，基于OTU的花瓣图和Venn图结果见图2。由图2a可知，6个酸菜样品共产生了902个OTU，6个酸菜样品共同拥有的OTU数达152个，约占各样品OTU数量的28.82%～33.19%，说明各样品间有较多相似物种，而各样品又含独有OTU，SCL3独有OTU数量最多，达100个，SCG3最少，只有22个。由图2b可知，无盐处理的酸菜样品与有盐处理组共有的OTU数达487个，约占总数的54.00%，说明两组酸菜样品微生物群落组成结构相似，而无盐处理组独有的OTU数262个，有盐处理组独有OTU数133个，说明加盐坏境会造成独特的微生物群落。
图2 基于OTU的花瓣图（a）和Venn图（b）
Fig.2 Petal graph (a) and Venn graph (b) based on OTU
无盐腌制的酸菜样品组为LYZ；有盐腌制的酸菜样品组为GYZ。下同。
2.2.4 酸菜样品的优势菌群分析
如图3a所示，酸菜样品中细菌群落在门分类水平上具有较高的多样性，其中平均相对丰度占比排名前10的依次为变形菌门（Proteobacteria，57.46%）、蓝细菌门（Cyanobacteria，29.70%）、厚壁菌门（Firmicutes，10.27%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，1.56%）、放线细菌门（Actinobacteria，0.54%）、酸杆菌门（Acidobacteria，0.38%）、梭杆菌门（Fusobacteria，0.13%）、绿弯菌门（Chloroflexi，0.03%）、疣微菌门（Verrucomicrobia，0.02%）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae，0.01%）。本实验自定义相对丰度＞10%的为优势菌群。据此，变形菌门占绝对优势，相对丰度占各样品比例为44.39%～79.05%，由低到高依次为SCG1、SCG2、SCL2、SCG3、SCL3、SCL1。说明在门水平下，两个盐浓度处理的酸菜样品中细菌群落结构组成相近，仅组成比例存在一定差异。
如图3b所示，在属水平下，6个酸菜样品共检测出339个细菌属，相对丰度前10的物种分别是未分类的蓝细菌属（unidentified-Cyanobacteria，30.02%）、水杆菌属（Aquabacterium，17.65%）、未分类的根瘤菌属（unidentified-Rhizobiaceae，11.44%）、未分类的立克氏体属（unidentified-Rickettsiales，2.41%）、明串珠菌属（Leuconostoc，19.56%）、代尔夫特菌属（Delftia，6.34%）、假单胞菌属（Pseudomonas，3.06%）、甲基杆菌属（Methylobacterium，2.44%）、假红育菌属（Pseudorhod oferax，3.19%）、魏斯氏菌属（Weissella，1.16%）。本实验定义相对丰度＞10%的为优势菌群。其中无盐腌制组的优势细菌属为未分类的蓝细菌属、明串珠菌属、水杆菌属、未分类的根瘤菌属，分别占15.13%、16.17%、21.05%、14.26%；有盐腌制组的优势细菌属为未分类的蓝细菌属、水杆菌属、明串珠菌属，分别占46.20%、14.25%、11.62%。说明在属水平下两个盐浓度腌制的酸菜样品中细菌群落结构和组成比例存在差异，盐分的存在会抑制某些细菌属。
图3 酸菜样品在门（a）和属（b）分类水平的细菌群落结构构成
Fig.3 Bacterial community structure at phylum (a) and genus (b) level in pickle samples
2.3 组间群落差异分析
2.3.1 UPGMA分析
为了研究不同样本间的相似性，还可以通过对样本进行聚类分析，构建样本的聚类树。在环境生物学中，非加权组平均法（unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA）是一种较为常用的聚类分析方法[28-29]。由图4a可知，在不同时考察物种有无及丰度时，有盐处理组SCG1和SCG2细菌物种相似，SCG3细菌物种类型相似性相对发生了变化，说明有盐（盐度10%）腌制会影响发酵后期的细菌群落结构；无盐处理组的三个样品细菌物种类型均在发生改变，说明无盐处理细菌群落结构变化更明显。由图4b可知，在同时考察物种数量和丰度时，无盐腌制组与有盐（盐度10%）腌制组的样品能各自聚为一类，无盐腌制组内SCL2和SCL3聚为一类，有盐（盐度10%）腌制组内SCG1和SCG2聚为一类，但样品物种类型及丰度依然有差异。说明盐分的存在会明显影响细菌群落的差异，且在发酵后期会抑制某些细菌物种。
图4 酸菜样品非加权组（a）与加权组（b）的UPGMA聚类树
Fig.4 UPGMA cluster tree of unweighted group (a) and weighted group (b) in pickle samples
2.3.2 Anosim分析
Anosim分析[26]是一种非参数检验，用来检验组间的差异是否显著大于组内差异，从而判断分组是否有意义。基于Bray-Curtis距离值的秩次进行组间差异显著性检验，对Anosim的分析结果，基于两两样本之间的距离值排序获得的秩（组间的为between，组内的为within），这样任一两两组的比较可以获得三个分类的数据，并进行箱线图的展示（若两个箱的凹槽互不重叠，则表明它们的中位数有显著差异），结果见图5。
图5 Anosim组间差异分析
Fig.5 Difference analysis of Anosim group
纵坐标为样本间距离的秩，横坐标：Between为两组之间的结果，其他两个各自组内的结果。
结果表明，无盐组和有盐（盐度10%）组细菌群落结构差异显著（P＜0.05），且R值为0.852＞0，统计分析有意义。由图5可知，无盐腌制组与有盐腌制组各自组内和相互比较的箱图有凹槽且互不重叠，说明盐分的有无会影响细菌群落结构，导致的差异显著（P＜0.05）。
2.4 组间差异物种分析
2.4.1 物种丰度聚类热图分析
根据OTU的丰度数据，选取丰度排名前35的属，从物种和样本两个层面进行聚类，绘制成热图，并根据颜色梯度反映不同样品中细菌群落相似性、差异性及物种聚类关系[26-27]。由图6可知，每份样品均含有相对于其他样品含量更高的菌属，且各个样品中优势菌属各不相同。无盐处理组中SCL3中优势细菌属最多，且三个样品是随时间的变化而变化；盐度10%处理组中三个样品中优势细菌属数目相似，种类却相对于无盐处理组要少，说明加盐处理会导致酸菜中的优势细菌属产生明显组成差异。
图6 酸菜样品属水平物种丰度聚类热图
Fig.6 Heat map of species richness of pickle samples at the genus level
2.4.2 组间差异物种检验
LEfSe（linear discriminant analysis Effect Size）法适合物种丰度差异检验，LDA值丰度柱状图可清楚展示不同组中丰度差异的物种，柱状图的长度代表差异物种的影响大小[22-23]。由图7可知，有盐（盐度10%）腌制组的酸菜样品中，硫碱螺旋菌属（Thioalkalispira）、unidentified-Rickettsiales、unidentified-Cyanobacteria等菌群具有特异性；无盐腌制组SCL样品中，代尔夫特菌属（Delftia）、甲基杆菌属（Methylobacterium）具有特异性。说明盐分会造成菌群的相对丰度差异，导致差异的细菌物种可能更利于产品风味。
图7 有盐与无盐样品细菌菌群LEfSe法比较分析
Fig.7 Comparison and analysis of the bacterial flora of saline and non-saline samples by LEfSe method
2.5 样品理化指标与微生物菌群相关性分析
典型相关分析（canonical correlation analysis，CCA）主要反映菌群与理化指标之间的关系，可以检测样品理化指标与菌群之间的关系，可得到影响样品群落分布的重要理化指标[28-30]。在细菌属水平下分析6个酸菜样品与pH值、总酸值（total acid number，TAN）、亚硝酸盐（NIT）的相关性，结果见图8。
图8 样品与环境因子间典型相关分析散点图
Fig.8 Scatter plot of canonical correlation analysis between samples and environmental factors
由图8可知，排序轴CCA1贡献率80.02%，排序轴CCA2贡献率为13.23%。箭头连线的长度代表某个理化指标与群落分布和种类分布之间相关程度的大小，箭头越长，说明相关性越大，反之越小。由此可知，理化指标与群落分布的相关性大小依次为TAN、NIT、pH值，理化指标之间的夹角代表两个理化指标之间相关关系，pH与NIT、TAN与NIT之间的夹角为锐角，相互呈正相关关系，pH与TAN之间的夹角为钝角，呈负相关。由表3可知，理化因子对物种分布影响显著相关的为TAN（P＜0.05），说明三个理化因子均会影响酸菜菌群变化，且总酸值对细菌物种影响显著。
表3 样品与环境因子间典型相关分析结果
Table 3 Results of canonical correlation analysis between samples and environmental factors
注：CCA1 和CCA2 所对应的值是环境因子箭头与排序轴夹角的余弦值，表示环境因子与排序轴的相关性。R2表示环境因子对物种分布的决定系数，R2越小，表示该环境因子对物种分布影响越小。
3 结论
以无盐、有盐（盐度10%）两个盐浓度处理的6个对应指标变化关键点的新平酸腌菜为研究对象，通过Illumina NovaSeq测序分析酸菜样品中细菌多样性，结果表明，有盐处理组的三个酸菜样品较无盐处理组均具有较高的细菌多样性；在门水平下各酸菜样品菌群结构组成相似，变形菌门占主导地位；属水平下各酸菜样品中共有相对丰度较高的菌属为未分类的蓝细菌属（unidentified-Cyanobacteria），水生杆菌属（Aquabacterium），明串珠菌属（Leuconostoc）；两个盐浓度腌制的酸菜样品优势细菌属各有差异，例如有盐腌制的酸菜样品中乳酸杆菌属（Lactobacillus）等发酵相关菌属更占优势；且有盐腌制组的特异菌属较无盐腌制组多；理化指标对菌群分布影响大小顺序依次为总酸值＞亚硝酸盐含量＞pH值。本研究系统解析无盐、有盐两个盐浓度腌制下新平酸腌菜中细菌结构差异，发现盐分会造成细菌物种差异，后续发酵过程中盐分的存在会引起某些特异细菌物种的繁盛从而导致其他一些细菌物种的消减，进而影响酸菜的风味口感与贮存时间。
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