四川省攀枝花市位于亚热带地区，且具有以南亚热带为基带的岛状式立体气候和充足的光热，盛产热带和亚热带水果。石榴、芒果、火龙果作为攀枝花主要热作水果，随着种植面积逐年扩大，病害程度随之增加[1-3]，而生产过程中杀菌剂施用不合理，造成3种水果农药残留问题日益凸显，导致其安全性受到影响，因而高效检测石榴、芒果、火龙果中的杀菌剂残留变得非常重要。
三唑类杀菌剂为全球杀菌剂类别中品种最多的一个大类[4]，具有高效、内吸、广谱等特点，可防治果树及其他作物的多种锈病、白粉病、叶斑病、根腐病、炭疽病等病害[5]。在GB 2763—2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中，石榴、芒果和火龙果属于皮不可食的热带和亚热带水果，且对于标准规定食品中农药最大残留限量，芒果有3种专属（直接检测）的三唑类杀菌剂（戊唑醇、苯醚甲环唑、腈菌唑）、石榴有2种专属的三唑类杀菌剂（苯醚甲环唑、腈菌唑）、火龙果无检测的杀菌剂[6]。同时，现执行的国家标准GB/T 20769—2008《水果和蔬菜中450种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法》前处理操作繁琐，成本高，费时费力，不适合大批量样品的快速定性及定量分析[7]；且尚未见同时检测三唑酮、戊唑醇、丙环唑、苯醚甲环唑、腈菌唑等5种三唑类杀菌剂的残留报道。因此，探讨并建立检测皮不可食的热带和亚热带水果（以石榴、芒果和火龙果为研究对象）中5种低毒内吸性三唑类杀菌剂残留标准具有实际意义。
高通量检测蔬菜及水果中农药残留的最有效和快速的前处理净化方法是QuEChERS法[8]，而超高效液相色谱-串联质谱法（ultra-performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry，UPLC-MS/MS）是农药残留分析的热点技术之一[9-10]，但二者结合分析时，由于样品提取溶剂及量的变化，可能会造成环境污染和溶剂效应，因此本实验对QuEChERS填料和提取溶剂、体积、提取次数等进行筛选，采用UPLC-MS/MS法测定3种水果中5种杀菌剂残留，以期为国家或行业标准中关于皮不可食的热带和亚热带水果的农药最大残留限量检测指标增加和方法建立的制定提供一定的参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
芒果、石榴、火龙果：攀枝花地区采摘。
1.1.2 化学试剂
甲醇（色谱级）：美国Fisher公司；农药（三唑酮、戊唑醇、丙环唑、苯醚甲环唑、腈菌唑）标准品（纯度均＞98%）：德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
Agilent 6460A超高效液相色谱-串联四级杆质谱仪：美国Agilent公司；1-14k离心机：美国Sigma公司；FA2014B电子天平：上海越平公司；Milli-Q IQ7000超纯水器：美国Millipore公司；Vortex 4涡旋混合器：比利时LMS公司；NEVAP-45氮吹仪：美国Organomation公司。
1.3 方法
1.3.1 标准溶液的配制
4 mmol/L甲酸的水溶液：准确吸取0.15 mL甲酸，用水稀释并定容至1 L。
标准溶液的配制：分别准确称取适量5种三唑类杀菌剂标准品，用甲醇配制成1.0 mg/mL的标准储备液，-20 ℃避光保存。其他浓度标准溶液用甲醇定量稀释即得。
1.3.2 样品前处理
芒果去皮去核取可食用部分、石榴去皮取可食用部分、火龙果去叶冠取可食用部分，分别称取10.0 g石榴、芒果、火龙果样品（精确至0.01 g），分别置于50 mL聚丙烯刻度离心管中，加入10 mL0.5%甲酸乙腈溶液[11]，振荡涡旋20 min，加入氯化钠1 g和无水硫酸镁5 g[12-14]，立即涡旋混匀10 s，然后10 000 r/min离心5 min，取上清液5.0 mL，加入QuEChERS试剂管中涡旋混匀1 min，10 000 r/min离心3 min，取上清液0.5 mL，用水定容至1 mL，混匀后14 000 r/min离心5 min，过0.22 μm滤膜，即得。
1.3.3 仪器条件
色谱条件：色谱柱为ZORBAX SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相：4 mmol/L甲酸的水溶液-甲醇[15-16]，梯度洗脱；流速：0.2 mL/min；进样体积：2 μL；柱温：30 ℃；洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序：0～7.5 min，甲醇体积分数由30%升至90%；7.5～10 min，甲醇体积分数为90%；10～10.5 min，甲醇体积分数由90%降至30%；10.5～15 min，甲醇体积分数为30%。质谱条件：离子源为电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）；扫描方式为正离子扫描；检测方式为多反应监测（multiple-reaction monitoring，MRM）；雾化气压力45 psi；辅助气（auxiliary gas flow，AUX）流速11 L/min；辅助气温度300 ℃；电喷雾电压4 000 V[17]。
5种三唑类杀菌剂的多反应监测质谱参数见表1。
表1 多反应监测模式下5种三唑类杀菌剂的质谱参数
Table 1 Mass spectrometry parameters of 5 kinds of triazole fungicides under multiple reaction monitoring mode
1.3.4 标准曲线的绘制及检出限的测定
配制好的5种三唑类杀菌剂标准储备液用甲醇稀释成400 μg/L混合标准溶液，分别用空白石榴、芒果、火龙果基质提取液将混合标准溶液稀释成200 μg/L、100 μg/L、80 μg/L、40 μg/L、20 μg/L、10 μg/L、4 μg/L系列质量浓度的混合标准溶液分别进样测定。以质量浓度为横坐标，定量离子峰面积为纵坐标，采用外标法建立标准曲线。以3倍信噪比（S/N≥3）和10倍信噪比（S/N≥10）分别确定检出限（limit of detection，LOD）与定量限（limit of quantitation，LOQ）[18-20]。
1.3.5 加标回收率和精密度测定
空白的芒果、石榴、火龙果各样品分别添加标准液（5 μg/kg、20 μg/kg、100 μg/kg）3个水平下，摇匀、静置后按1.3.2方法处理，进行空白加标回收率试验。同时，每个水平重复6次，测定平均回收率和精密度相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。
1.3.6 数据处理
实验所得数据为3次重复实验的平均值，采用Microsoft Excel 2010软件对实验数据进行统计分析，通过Origin7.5软件进行制图分析。
2 结果与分析
2.1 仪器条件优化
5种三唑类杀菌剂的MRM色谱图见图1，二级离子质谱图见图2。
图1 100 μg/L混合标准溶液的总离子流色谱图
Fig.1 Total ion chromatogram of 100 μg/L mixed standard solution
1.三唑酮、2.腈菌唑、3.戊唑醇、4.丙环唑、5.苯醚甲环唑。
图2 5种杀菌剂的二级离子质谱图
Fig.2 Secondary ion mass spectrometry of 5 kinds of triazole fungicides
由图1可知，三唑酮、腈菌唑、戊唑醇、丙环唑和苯醚甲环唑经色谱分离流出的组分不断进入质谱，质谱连续扫描进行数据采集，每一次扫描得到一张质谱图，将每一张质谱图中所有离子强度相加，得到一个混合标准溶液总的离子流强度。由图2可知，定量离子色谱图反映了（目标化合物的特征离子）色谱峰的定性，峰的一致性测定。
2.2 方法的线性关系及检出限
5种三唑类杀菌剂的标准曲线线性回归方程、相关系数R2、线性范围及检出限见表2。由表2可知，5种三唑类杀菌剂在4.0～200.0 μg/L质量浓度范围内的相关系数R2均＞0.999，检出限（LOD）为0.05～0.3 μg/kg，定量限（LOQ）为0.15～1.0 μg/kg，低于国家规定的最大残留限量值[12]。
表2 5种杀菌剂的线性回归方程、相关系数、线性范围及检出限、定量限
Table 2 Linear regression equation,range,correlation coefficient,limit of detection and limit of quantitation of 5 kinds of fungicides
2.3 方法的回收率与精密度
表3 5种杀菌剂的加标回收率和相对标准偏差（n=6）
Table 3 Standard recovery rates and relative standard deviations of 5 kinds of fungicides (n=6)
续表
由表3可知，分别以5 μg/kg、20 μg/kg、100 μg/kg的水平将5种三唑类杀菌剂添加到空白芒果基质中，测定回收率，5种三唑类杀菌剂在凯特芒果中的回收率范围为87.7%～103.1%，RSD为4.1%～11.2%；以5 μg/kg、20 μg/kg、80 μg/kg的水平将5种三唑类杀菌剂添加到空白石榴基质、火龙果基质中，测定回收率，5种三唑类杀菌剂的回收率范围分别为80.5%～93.5%，81.6%～94.7%；RSD分别为3.8%～7.3%，4.3%～10.2%；结果表明，该方法准确度和精密度满足农药定量分析要求[21]。
2.4 实际样品分析
按选定的试验方法下，对攀枝花地区的各20份突尼斯软籽石榴、凯特芒果、红心火龙果进行分析，三唑酮等5种三唑类杀菌剂的残留量均低于检测限，均未检出。
食品安全国家标准的检测方法中含5种农药残留以适用于“其他食品”或“其他蔬菜和水果”可参照执行的检测方法相比，GB 23200.8—2016中规定LOQ的三唑酮（0.025 0 mg/kg）、腈菌唑（0.012 6 mg/kg）、丙环唑（0.037 6 mg/kg）和戊唑醇（0.037 6 mg/kg）[22]；GB 23200.49—2016中苯醚甲环唑的LOQ为0.005 mg/kg[23]；均比本研究中5种相应三唑类杀菌剂的残留LOQ规定值大，而定量限是指样品中被测物能被定量测定的最低量，本方法从定量限方面体现了分析方法具备了更灵敏的定量检测能力，能满足3种水果中5种三唑类杀菌剂残留检测的要求。
3 结论
本实验结合固相萃取技术，以高效液相色谱－串联质谱法建立了攀枝花本地的突尼斯软籽石榴、凯特芒果、红心火龙果中5种低毒内吸性三唑类杀菌剂残留的分析测定方法。该方法前处理操作简单，净化效果好，灵敏度高，干扰少，其LOQ可达到0.15 μg/kg，在实际检测中具有较强的可行性和实用性，也适用于各水果中5种农药残留的定性和定量分析，且对于未来“食品中农药最大残留限量”标准的完善3种热作水果中多种三唑类杀菌剂残留的检测方法和限量标准的制定是十分必要的。
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