酱油是起源于我国的一种传统发酵调味品，早期的酱油由酱演变而来，从周朝就有记载[1]。酱油是我国最为常见、使用范围最广的调味品之一，也是东南亚国家和欧美国家广受欢迎的调味品[2]。酱油的主要原料有大豆、豆粕、面粉、小麦、麸皮等，经过微生物发酵作用和代谢产物间互相作用等一系列复杂反应最终形成液体酱油[3-4]。与国外尤其是日本相比，我国对酱油风味的研究仍有一定的差距，因此研究我国酱油风味物质并不断完善酱油风味体系是非常必要的[5]。
目前在我国乡村，不采取密封包装方式就进行售卖的散装酱油仍然较为常见。散装酱油常常由于生产厂家使用劣质原辅料、生产工艺落后、卫生条件差等原因而导致质量检测合格率较低[6]，且散装酱油在运输和销售过程中长时间暴露于空气中，容易受到污染致使品质下降，造成检验不合格[7-8]。过去一些关于散装酱油品质的报道都是针对细菌总数、总酸、重金属含量等卫生指标，而散装酱油与市售品牌酱油的风味是否具有差异仍然未知。
目前研究酱油的挥发性风味物质主要采用气相色谱-质谱联用技术（gaschromatography-massspectrometer，GC-MS），检测中通常升温到200 ℃以上，会对酱油中一些热不稳定物质造成破坏，因而检测结果可能与挥发性物质在酱油中分布的真实情况有偏差。此外，检测前需要对样品进行预处理以富集挥发性成分，萃取过程不仅步骤复杂繁琐而且耗时较长，通常要经过几十分钟甚至几小时的萃取才能进样检测。
气相色谱-离子迁移谱（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）是一种近些年来新兴的气相分离检测技术，结合了气相色谱分离能力强和离子迁移谱响应快、鉴别能力强的优点，适用于痕量检测挥发性物质[9]，已在毒品检测[10]、疾病监测[11]、环境保护[12]、食品风味分析[13-14]等方面广泛应用。GC-IMS具有检测限低（低至ng/kg级）、选择性好、分析时间短、可在常压下操作、无需样品前处理、操作简单等一系列优点。在食品风味检测应用中，GC-IMS检测温度较低，能够保护一些热不稳定物质免受破坏，因此可以更加真实的呈现挥发性风味物质在食品中的分布情况。其次，相较于GC-MS，GC-IMS技术样品的孵育和进样之间全自动无缝衔接，大大节省了时间和人力。
本研究利用GC-IMS对市售品牌酱油和散装酱油样品中的挥发性风味物质进行检测，根据挥发性成分指纹图谱，利用多元统计法分析散装酱油与品牌酱油的差异和散装酱油与不同等级品牌酱油的差异，旨在为酱油风味检测提供新思路，对酱油风味改良和工艺优化具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
本研究使用的品牌酱油样品共21个：均由山东省食品药品检验研究院在市场采购获得，品牌分别有欣和味达美（XHWDM6919、XHWDM7486）、巧媳妇（QXF6920、QXF7399、QXF8105、QXF7613）、嘉和（JH6996、JH8154）、厨邦（CB7774）、东古（DG6922、DG8420）、加加（JJ8434）、德馨斋（DXZ8662）、好太太（HTT7021、HTT7028）、海天（HT8095、HT7561、HT8415）、鲁花（LH8374）、灯塔（DT7095、DT7183），其中特级酱油有5个，一级酱油有2个，二级酱油有1个，三级酱油有13个；散装样品共3个：分别采自山东三个乡村粮油店，编号为SZ1、SZ2、SZ3。
1.2 仪器与设备
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气相离子迁移谱联用仪：济南海能仪器股份有限公司；FS-SE-54-CB-1色谱柱（15 m×0.53 mm，1 μm）：德国CS Chromatographie Service GmbH公司。
1.3 实验方法
1.3.1 样品预处理
样品密闭存放于常温条件下，检测前每个样品取1 mL置于20 mL顶空瓶中，密封后上机。仪器自动在40 ℃条件下对样品进行10 min的孵育，然后进样。
1.3.2 仪器条件
自动顶空进样条件：孵化温度40 ℃；孵化转速500 r/min；孵育时间10 min；进样针温度45 ℃；进样体积500 μL。
气相色谱条件：载气为高纯氮气（N2）（纯度≥99.999%）；柱温为60 ℃；分析时间为30 min。
离子迁移谱条件：离子源为氚源（6.5 keV）；漂移气为高纯氮气（N2）（纯度≥99.999%）；漂移气流量为150 mL/min；模式为正离子模式；漂移管温度为45 ℃；电场强度为500 V/cm；漂移管长度为9.8 cm。
1.3.3 数据分析
GC-IMS的数据利用仪器自带的软件和插件进行处理，使用LAV（Laboratory Analytical Viewer）软件用于查看酱油样品的分析谱图，样品中检出的挥发性有机物以色点的形式在图上呈现出来；Reporter插件，用于对比样品之间的二维图谱差异和三维图谱差异；Gallery Plot插件，用于制作挥发性物质指纹图谱，以对比不同样品中挥发性物质的差异。GC-IMS Library Search软件内置美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）数据库和管理信息系统（information management system，IMS）数据库，通过搜索数据库完成对挥发性物质的定性分析，并生成指纹图谱对比，对样品风味物质进行正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least square method-discriminant analysis，OPLS-DA）。
2 结果与分析
2.1 酱油的离子迁移谱分析
部分酱油样品的GC-IMS分析三维图谱见图1。由图1可知，初步看出品牌酱油样品之间虽略有区别但较为相似，而品牌酱油与散装酱油之间具有一定的差异，一些信号峰普遍在品牌酱油中峰体积较大，也有某些信号峰在散装样品中峰体积较大。
图1 部分酱油样品中挥发性风味物质的GC-IMS三维图谱
Fig.1 GC-IMS three-dimensional spectrogram of volatile flavor compounds in some soy sauce samples
从左至右样品依次为XHWDM6919、QXF6920、JH6996、HT8095、SZ1。
与三维图谱相对应的二维俯视图见图2。由图2可知，色点为白色或接近底色（蓝色）时表示物质的浓度较低，红色表示物质浓度较高，颜色越深代表浓度越高。可以清楚地看到，品牌酱油之间信号峰的位置和强度比较相似，而品牌酱油和散装酱油样品之间的差异非常明显，差异大的信号峰主要存在于保留时间在100～200 s和迁移时间（归一化处理）在1.0～1.5的范围内。
图2 部分酱油样品中挥发性风味物质的GC-IMS二维图谱
Fig.2 GC-IMS two-dimensional spectrogram of volatile flavor compounds in some soy sauce samples
从左至右样品依次为XHWDM6919、QXF6920、JH6996、HT8095、SZ1。
使用Gallery Plot插件截取代表挥发性物质的色点，绘制出各样品挥发性风味物质指纹图谱见图3。由图3可知，图中绿色框内的物质为品牌酱油样品中普遍存在的挥发性物质，这些物质在几乎所有的品牌酱油中都有一定量分布；红色框表示散装酱油的特征性风味物质，这些物质几乎只在散装样品组中大量检出，而在品牌酱油样品中几乎不存在或检出量很低；黄色框中的物质为造成不同的品牌酱油样品之间差异的风味物质，这些物质在不同的品牌酱油样品之间分部差异较大，而在散装样品中几乎不存在或检出量很低。
图3 酱油样品的挥发性风味物质指纹图谱
Fig.3 Fingerprint spectrum of volatile flavor compounds in soy sauce samples
在酱油样品中共检测到72种挥发性组分，经过与NIST数据库和IMS数据库比对后29种组分得到定性，按照图3从左至右的顺序，绿色框中的物质为：苯乙醛、丙醛、5-甲基-2-呋喃甲醇、2,3-丁二酮、5-甲基糠醛（单体）、丁醛、乙醇、5-甲基糠醛（二聚体）、乙酸乙酯、丙酮、戊酸、2-丁酮；红色框中的物质为：糠醛（单体）、己醛、3-甲硫基丙醛（单体）、2-乙酰基呋喃（二聚体）、糠醛（二聚体）、3-甲硫基丙醛（二聚体）、柠檬烯（单体）、柠檬烯（二聚体）、3-羟基-2-丁酮、异戊醛；黄色框中的物质为：2-乙酰基呋喃（单体）、乙二醇单丁醚、乳酸乙酯、乙酸异戊酯、苯甲醛、2-庚酮、丙酸乙酯。
仔细比较品牌酱油和散装酱油的挥发性化合物之间的差别发现，品牌酱油普遍含有的物质（绿色框）并非全部都在散装样品里普遍存在，如丙醛（propanal）、5-甲基-2-呋喃甲醇（5-methyl-2-furanmethanol）、46号、56号、34号物质在散装样品中含量很低或几乎不存在。一些几乎只在散装样品中大量检出的物质（红色框）在品牌酱油中普遍含量很低，但三个散装酱油样品之间也各有差异，如己醛（hexanal）、70号物质只在SZ3样品大量检出，3-甲硫基丙醛（3-methylthiopropanal）、柠檬烯单体和二聚体（limonene）只在SZ2样品大量检出，异戊醛（3-methylbutanal）只在SZ1样品中大量检出。黄色框内的物质在各个品牌样品之间分布差异很大，可能为某一个或几个品牌酱油的特征性风味物质，在其他品牌中不具代表性。
将品牌酱油按等级分类后分别与散装酱油进行对比，酱油样品的挥发性风味物质指纹图谱分别见图4和图5。由图4可知，5个特级酱油样品分别来自5个不同的品牌，组内差异较大，而与散装酱油比较组间差异较小，绿色框内许多物质在各特级酱油样品中的含量差异大，如丙醛、5-甲基糠醛（5-methylfurfurar）、乙酸乙酯（ethyl acetate）、丙酮（acetone）、2-丁酮（2-butanone）、56号、32号、64号化合物等，红色框物质只在散装组大量检出，黄色框的物质主要分布于某个或某几个样品。由图5可知，三级酱油和散装酱油之间的差异明显，与品牌酱油和散装酱油间的差异相似，绿色框内的物质在三级酱油中分布较为普遍，而其中某些物质在散装酱油中含量甚微，红色框的物质几乎只在散装组大量检出，黄色框的物质主要分布于某个或某几个样品。
图4 特级和散装酱油样品的挥发性风味物质指纹图谱
Fig.4 Fingerprint spectrum of volatile flavor compounds in premium grade and bulk soy sauce samples
图5 三级和散装酱油样品的挥发性风味物质指纹图谱
Fig.5 Fingerprint spectrum of volatile flavor compounds in grade 3 and bulk soy sauce samples
2.2 酱油中主要的风味物质
散装酱油样品采自农村的粮油店，多为小工厂或小作坊制得，其风味可能与品牌酱油产品之间存在差异。品牌酱油样品由规范化的企业和工厂生产，在原料挑选、生产操作、包装销售等过程把控严格，其品质相对比较稳定。选取品牌酱油样品来分析酱油中主要的挥发性风味物质。
根据图3显示的结果，选取绿色框中的总共20种物质作为合格酱油产品的主要挥发性风味物质，这些物质在所有或大多数品牌酱油样品中检出较多，在不同品牌样品之间含量差别不大，是合格的酱油产品中不可或缺的非常重要的挥发性风味物质。酱油中主要的挥发性物质详细信息见表1。这20种组分中一共有12种组分被定性，除去同种物质的二聚体共11种挥发性化合物。由表1可知，醛类化合物有3种，分别为苯乙醛、丙醛和丁醛；醇类化合物仅有乙醇1种；酯类化合物仅有乙酸乙酯1种；有机酸仅有戊酸1种；酮类化合物有3种，分别为2,3-丁二酮、丙酮和2-丁酮；杂环类化合物有2种，分别为5-甲基-2-呋喃甲醇和5-甲基糠醛。
表1 酱油中主要的挥发性物质详细信息
Table1 Detailed information of main volatile substances in soy sauce
酱油中的醛类物质是淀粉质原料被酶解产生的葡萄糖经过醛酸途径产生，气味辛辣刺激，主要起调和香气的作用[20]，苯乙醛、丙醛、丁醛为酱油提供焦糖香、可可香、咖啡香等气味[15]。醇类物质被认为是酱油中含量最高的一类风味成分，是成酯的基础，其中含量最高的为乙醇，为酱油提供醇和的酒香味[17]。酯类物质是酱油中的基础香气成分之一，由有机酸和醇类酯化生成，能使酱油气味更加醇厚，其中乙酸乙酯是酱油中酯类的代表之一，能够使酱油香气更加醇和[17]。酱油中的有机酸不但可以提供香气还起到呈味作用，为酱油提供酸味和缓和咸味，除此之外，有机酸还能与醇类物质成酯，增加酱油中的酯香[21]。酱油中的酮类化合物本身不是风味物质，但少量羰基化合物可提供果香和焦糖香[20]。杂环化合物对酱油风味的贡献很大，在酱油中呋喃类的杂环化合物含量较多[22]，5-甲基-2-呋喃甲醇和5-甲基糠醛等杂环化合物主要提供焦糖香和焙烤香气[16]。这些酱油中主要的挥发性成分相互调和，为酱油提供了醇厚的基础香味。
李俊刚等[23]采用同时蒸馏法萃取4种品牌高盐稀态发酵酱油中的挥发性成分并使用GC-MS进行分析，在4种酱油中鉴定出较多的醛酮类、醇类、杂环类化合物。与李俊刚等[23]的研究结果相似，本研究在品牌酱油中找到的主要挥发性物质中也有很多为醛酮类和杂环类物质，仅鉴定出1种醇类。除此之外，4-乙基愈创木酚（4-ethylguaiacol，4-EG）、2-乙基-4-羟基-5-甲基-3（2H）呋喃酮（2-ethyl-4-hydroxy-5-methyl-3（2H）furanone，HEMF）、4-羟基-2,5-二甲基-3（2H）-呋喃酮（4-hydroxy-2,5-dimethyl-3（2H）furanone，HDMF）等物质在许多文献中被认为是酱油的关键风味物质[5，24]，在本研究中并未鉴定出。在采用GC-MS分析酱油中风味物质的研究中，由于采取的萃取方法以及酱油样品种类不同，检测到的物质种类和含量各有差异[25-26]。
相比之下，一些重要挥发性物质在散装样品（SZ1、SZ2、SZ3）中含量明显低于品牌酱油或几乎不存在，如丙醛、5-甲基-2-呋喃甲醇、48号、56号和34号化合物。这表明散装样品中缺失了一些合格酱油所需要具备的重要的风味物质，可能会导致散装酱油在风味方面的感官体验不如市售品牌酱油。
值得注意的是，在散装酱油与其他品牌酱油的比较中，3个散装酱油样品（SZ1、SZ2、SZ3）均显示出较高的糠醛（furfural）含量。糠醛具有甜香、木香、焦糖香气、烘烤香气，食品中的糠醛通常产生于热加工或发酵过程[27]。在白酒的酿造中使用谷皮、玉米芯、麸糠等原料可以产生更多糠醛，工业上多使用玉米芯等含有丰富半纤维素的原料生产糠醛，食品中一定量的糠醛可以带来特殊香气，但含量过高会对身体多个脏器产生不良影响[28-29]。散装酱油样品可能使用了较多的麦麸、麸皮等原料，原料成本虽然较低，但产生过多的糠醛可能影响散装酱油的安全性。
2.3 多元统计分析
进一步利用多元统计分析散装酱油和品牌酱油的风味差异。酱油样品挥发性组分的主成分分析（principal component analysis，PCA）得分图见图6A。由图6A可知，散装酱油样品和品牌酱油样品之间得到很好的区分，同时品牌酱油内部也存在一定差异，尤其是灯塔牌样品（DT7095、DT7183）与其他品牌样品之间。OPLS-DA得分图见图6B。由图6B可知，OPLS-DA得分区分结果更明显，表明品牌酱油和散装酱油风味物质之间的差异非常显著。OPLS-DA载荷双标图见图6C。由图6C可知，大部分物质聚集于品牌酱油一侧，仅有少量物质分布于散装样品一侧，表明绝大部分挥发性风味物质在品牌酱油中含量高于散装酱油，散装酱油的香气不如品牌酱油浓郁。
PCA和OPLS-DA显示的结果与GC-IMS的风味指纹图谱显示的结果基本一致。基于GC-IMS数据的PCA和OPLS-DA分析都显示，散装酱油样品和品牌酱油样品的风味之间具有显著的差异，也表明GC-IMS应用于酱油风味检测和鉴别具有可行性。
图6 酱油样品挥发性化合物的多元统计分析
Fig.6 Multivariate statistical analysis of volatile compounds in soy sauce samples
A：PCA得分图；B：OPLS-DA得分图；C：OPLS-DA载荷双标图。下同。
特级酱油和散装酱油样品的多元统计分析结果见图7。由图7可知，PCA和OPLS-DA都可将特级酱油和散装酱油分开，但分布相对较分散，与图4风味物质指纹图谱的结果相似。
图7 特级和散装酱油样品挥发性化合物的多元统计分析
Fig.7 Multivariate statistical analysis of volatile compounds in premium grade and bulk soy sauce samples
三级酱油和散装酱油样品的多元统计分析结果见图8。由图8可知，PCA和OPLS-DA处理两组酱油分组明显，尤其是OPLS-DA可以很好的区分。虽然三级酱油组内具有一定差异，但两组之间的差异仍很显著，与图5风味物质指纹图谱的结果一致。
无论是所有品牌酱油与散装酱油比较还是不同等级的品牌酱油与散装酱油比较，均显示出有差异。综合来看，品牌酱油与散装酱油之间具有非常明显的差异，也印证了散装样品生产、储存、销售中的不确定性会导致其与合格品牌酱油产品的风味存在差异的猜想，结果表明GC-IMS结合多元统计分析可以应用于分析不同酱油的差异，GC-IMS在酱油风味分析检测具有广阔应用前景。
图8 三级和散装酱油样品挥发性化合物的多元统计分析
Fig.8 Multivariate statistical analysis of volatile compounds in grade 3 and bulk soy sauce samples
3 结论
本研究使用GC-IMS技术结合多元统计分析方法分析了散装酱油和品牌酱油的差异。结果显示虽然品牌酱油内部存在一定的差异，但是散装酱油与品牌酱油之间存在更为明显的差异，品牌酱油中主要的风味物质有苯乙醛、丙醛、5-甲基-2-呋喃甲醇、2,3-丁二酮、5-甲基糠醛、乙醇、乙酸乙酯等。
在本研究中GC-IMS技术能够很好地呈现出散装酱油和品牌酱油间的差异甚至不同品牌样品间的细微差异，表明该技术在酱油的鉴别和风味分析方面具有巨大潜力。
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