食用植物酵素是指以可用于食品加工的植物为主要原料，添加或不添加辅料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分可供人来食用的酵素产品[1-2]。其在含有植物本身的多种维生素、酶和矿物质等营养物质的同时，还通过微生物发酵产生新的次生代谢物及活性成分，与直接食用蔬菜水果相比，酵素中的生物活性成分和有机小分子更为浓缩，而且更容易为人体所吸收[3]。食用植物酵素作为一种功能性微生物发酵制品因其丰富的营养和显著的功效多年来盛行于欧美、东南亚、日本以及台湾地区，受到国内外学者的普遍关注[4]，目前有关自然发酵苹果酵素的研究多以短期发酵为主，杨小幸等[5]研究发现，苹果酵素发酵第21天获得了较高总酚含量与1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率；李飞等[6]研究发现，发酵50 d的苹果酵素的抗氧化活性基本呈现上升趋势。但目前酵素研究由于发酵周期较短，致使产品品质不稳定，酒精含量容易超标，大量研究表明，酵素是时间的产物，随着发酵时间的延长，产品中的活性物质逐渐增加[7-11]，因此，进一步阐明苹果酵素自然发酵过程中活性物质的动态变化是很有必要的。本研究以苹果为原料进行自然发酵，探讨苹果酵素自然发酵过程中抗氧化成分（总酚、总黄酮、维生素C（vitamin C，VC）、总花青素含量）、功效酶活性（超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）以及抗氧化能力（DPPH自由基
、·OH、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid，ABTS）自由基清除能力和还原力）等的动态变化，并对总酚、总黄酮含量、SOD活性与抗氧化能力之间的相关性进行分析。分析苹果酵素自然发酵过程中生物活性物质的变化，以期为进一步阐明苹果酵素保健功能机理和综合性开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
富士苹果（长富2号）：采自甘肃省庆阳市有机苹果基地；冰糖：市售；福林-酚（Folin-Ciocalteau）、NaCO3、没食子酸、亚硝酸钠、硝酸铝、芦丁、抗坏血酸（VC）、盐酸、盐酸、氢氧化钠、原花青素、香草醛、甲醇、三羟甲基氨基甲烷、邻苯三酚、盐酸、氢氧化钠、酚酞、DPPH、乙醇、ABTS、过硫酸钾、铁氰化钾、三氯化铁、硫酸亚铁、水杨酸、双氧水、Tris、邻苯三酚、淀粉酶试剂盒、盐酸、三氯乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、聚乙烯醇、橄榄油、磷酸二氢钾、氢氧化钠、乙酸、乙酸钠、葡萄糖、羧甲基纤维素钠、无水硫酸钠、酒石酸钠、苯酚、3,5-二硝基水杨酸：中瑞化学试剂公司。实验所用试剂均为分析纯或色谱纯。
1.2 仪器与设备
UV-1100型紫外可见分光光度计：上海凌析达仪器有限公司；LRH-70型恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；YXQ-LS-75G型立式压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DK-S24数显恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；MIRCOCL 17R离心机：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；MDF-U3386S超低温冰箱：青岛海尔集团；DL-CJ-1N超净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；PB-10型精密pH计：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 苹果酵素加工工艺流程
苹果原料选择→清洗→去核→切分→装罐→加水、加糖→发酵→过滤→苹果酵素
1.3.2 操作要点
新鲜苹果用纯净水冲洗干净，沥干水分后去核并切分成3～5 mm的片，冰糖破碎后用紫外灯辐照处理30 min，将苹果片与纯净水按料液比200（g∶L）加入无菌酵素发酵罐中，加入15%的冰糖调节糖度，置于阴凉干燥的发酵车间，在常温（20～26 ℃）条件下自然发酵30 d后，滤去果肉，继续发酵至90 d，发酵第一个月隔天搅拌通气，之后密封发酵，发酵结束即得苹果酵素，取上清液进行指标测定。
1.3.3 分析检测
（1）生物活性成分测定
总酚含量参照张静雯[12]的方法；总黄酮含量、VC含量以及总花青素含量参照李杰等[13]的方法。苹果酵素中生物活性成分标准曲线回归方程及相关系数见表1。
表1 苹果酵素生物活性成分标准曲线回归方程
Table 1 Regression equations of standard curves of bioactive components in apple Jiaosu
（2）功效酶活性
SOD活性的测定参照国标GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性》；纤维素酶活性的测定参照农业行业标准NY/T 912—2004《纤维素酶活力的测定-分光光度计法》；蛋白酶活性的测定参照商业行业标准SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》；淀粉酶活性的测定参照淀粉酶试剂盒内说明书；脂肪酶活性的测定参照国标GB/T 23535—2009《脂肪酶制剂》中的电位滴定法。
（3）抗氧化能力
DPPH自由基清除能力、超氧自由基清除能力、羟基自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、还原力的测定参考樊秋元[14]的方法。
1.3.4 数据统计处理
每组试验重复3次，试验数据采用Excel 2010、SPSS 22.0数据分析软件进行分析处理及作图。
2 结果与分析
2.1 苹果酵素自然发酵过程中生物活性成分的变化
苹果酵素中存在总酚、总黄酮、VC和总花青素等主要生物活性成分，但含量较核桃青皮果蔬、葡萄、生姜等酵素中低[15-17]。苹果酵素自然发酵过程中总酚、总黄酮、VC和总花青素的变化结果见图1。
图1 苹果酵素自然发酵过程中生物活性成分的变化
Fig.1 Changes of bioactive components during natural fermentation process of apple Jiaosu
由图1可知，随着发酵时间的延长，总酚含量的变化呈先升高后降低趋势，发酵0～60 d时总酚含量从0.17 mg/mL升高至1.16 mg/mL，随后出现降低趋势，这可能是由于部分酚类物质与发酵后期发酵液中产生的有机酸结合，生成酚酸类物质，引起总酚含量的降低[18]；随着发酵时间在0～90 d的延长逐渐升高，总黄酮的含量从0.05 mg/mL增加至0.45 mg/mL，且发酵第1个月增加较第2个月缓慢，并于发酵60 d后缓慢增加或趋于稳定，这可能与发酵体系中微生物的多样性有关[19]；VC和总花青素的含量在整个发酵过程中变化不大，分别基本保持在0.05 mg/mL和0.01 mg/mL的水平。表明苹果酵素中VC和总花青素主要来源于原料中。
2.2 苹果酵素自然发酵过程中功效酶活性的变化
苹果酵素自然发酵过程中功效酶活性的变化结果见图2。由图2可知，苹果酵素中存在SOD、纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等功效酶，且5种酶的活性均随着发酵时间的延长呈逐渐升高趋势，并基本于发酵60 d后缓慢增加或趋于稳定，其中SOD和纤维素酶的含量较高，发酵90 d时分别从发酵初期的9.63 U/mL和6.00 U/mL升高至42.12 U/mL和23.34 U/mL，蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的含量较低，发酵初期分别为1.01 U/mL、0.81 U/mL和0.27 U/mL，发酵90 d时分别达到10.03 U/mL、6.15 U/mL和2.14 U/mL。结果表明，通过微生物发酵，可提高酵素产品发酵液中SOD、脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等功效酶的活力[20]。
图2 苹果酵素自然发酵过程中功效酶的变化
Fig.2 Changes of functional enzyme activity during natural fermentation process of apple Jiaosu
2.3 苹果酵素自然发酵过程中抗氧化能力的变化
苹果酵素自然发酵过程中自由基清除率的变化结果见图3。由图3可知，DPPH·、O2·、·OH、ABTS·清除率和还原力在苹果酵素发酵过程中抗氧化能力的变化规律大体较为一致，DPPH自由基清除率和·OH清除率发酵前60 d逐渐上升，60 d后趋于稳定，发酵60 d时的自由基清除率分别从发酵初期的47.82%和43.05%上升至85.29%和78.85%；O2·清除率、ABTS自由基清除率和还原力呈现发酵前75 d逐渐上升达到峰值、75 d后略有下降的趋势，发酵75 d时的自由基清除率分别为65.06%、59.04%和1.93（OD700nm值）。表明发酵60～75 d时的苹果酵素的抗氧化活性较好，这可能与此时酵素中总酚、总黄酮含量较高有关系[21]。
图3 苹果酵素自然发酵过程中抗氧化能力的变化
Fig.3 Changes of antioxidant capacity during natural fermentation process of apple Jiaosu
2.4 苹果酵素中总酚、总黄酮、SOD活性与抗氧化能力的相关性
酵素发酵技术通过复杂的物质代谢，不仅可以改善果蔬原料原有的一些不良风味，还可以产生一些新的生物活性成分，增加酵素食品的风味、口感及功效，提高产品抗氧化能力[22]，酵素富含的多酚、黄酮以及功效酶等物质能够有效清除机体内自由基[23]。选择苹果酵素自然发酵过程中含量较高的抗氧化成分总酚、总黄酮、SOD活性，分析它们与DPPH自由基清除率、O2-·清除率、·OH清除率、ABTS自由基清除率和还原力之间的相关性，结果见表2。
表2 苹果酵素中总酚、总黄酮、超氧化物歧化酶活性与抗氧化能力的相关性
Table 2 Correlation analysis of total phenols,total flavonoids contents,superoxide dismutase activity and antioxidant capacity of apple Jiaosu
注：“*”表示显著相关（P＜0.05），“**”表示极显著相关（P＜0.01）。
由表2可以看出，总酚含量与DPPH·、O2-·、·OH、ABTS·清除能力及还原力呈显著正相关（P＜0.05）；SOD活性与DPPH·
、·OH、ABTS·清除能力及还原力呈极显著正相关（P＜0.01），与总酚、总黄酮含量之间相关性较弱（P＞0.05）；而DPPH自由基
、·OH以及ABTS自由基清除能力之间呈极显著正相关（P＜0.01），因此，想要全面评估苹果酵素的抗氧化能力，应使用多种测定方法体系[24]；总黄酮含量与自由基清除能力及还原力之间无显著相关性，这可能是由于苹果酵素中总黄酮含量较低的原因，有待于进一步研究。说明苹果酵素抗氧化能力的主要来源是SOD活性。
3 结论
通过对苹果酵素自然发酵过程中抗氧化成分（总酚、总黄酮、VC、总花青素含量）、功效酶活性（SOD、纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）以及抗氧化能力（DPPH·、O2·、·OH、ABTS·清除能力和还原力）的变化进行研究，结果表明，苹果酵素自然发酵过程中，除VC、总花青素含量分别基本保持稳定以外，其他抗氧化成分、功效酶活性以及抗氧化能力总体呈先升高再趋于稳定或略有下降的趋势。总酚和总黄酮含量在发酵60 d时达到最高，分别为1.16mg/mL和0.45 mg/mL；SOD、脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶的活性在发酵90d时达到最高（42.12U/mL、23.34U/mL、10.03 U/mL、6.15 U/mL和2.14 U/mL）；DPPH·、
、·OH、ABTS·清除能力和还原力在发酵60～75 d时抗氧化活性最高（85.29%、78.85%、65.06%、59.04%和1.93）。同时，总酚含量与DPPH·、
、·OH、ABTS·清除能力及还原力呈显著正相关（P＜0.05）；SOD活性与DPPH·
、·OH、ABTS·清除能力及还原力呈极显著正相关（P＜0.01），说明SOD活性是苹果酵素抗氧化能力的主要来源。
[1]中华人民共和国工业和信息化部.QB/T 5323—2018植物酵素[S].北京：中国标准出版社，2018.
[2]高庆超，常应九，马蓉，等.微生物酵素的研究进展[J].食品研究与开发，2020，41（2）：190-195.
[3]DAI J,SHA R Y,WANG Z Z,et al.Edible plant Jiaosu:manufacturing,bioactive compounds,potential health benefits,and safetyaspects[J].Sci Food Agr,2020,100(15):5313-5323.
[4]相宇倩，邵娟娟，吕佼，等.食用酵素的研究进展[J].食品工业，2018，39（5）：264-266.
[5]杨小幸，周家春，陈启明，等.苹果酵素天然发酵过程中代谢产物的变化规律[J].食品科学，2017，38（24）：15-19.
[6]李飞，王凤舞，潘越，等.苹果酵素抗氧化活性初步研究[J].青岛农业大学学报（自然科学版），2016，33（1）：40-44.
[7]方晟，陈犇，沙如意，等.百合酵素自然发酵过程中有机酸及其体外抗氧化活性的变化[J].食品与发酵工业，2019，45（22）：39-46.
[8]范昊安，沙如意，杜柠，等.苹果梨酵素发酵过程中香气成分的变化[J].食品科学，2021，42（2）：177-184.
[9]VERÓN H E,GAUFFIN C P,FABERSANI E,et al.Cactus pear (Opuntia ficus-indica) juice fermented with autochthonous Lactobacillus plantarum S-811[J].Food Funct,2019,10(2):1085-1097.
[10]PEREZ S,RUFIAN J A,PASTORIZA S.Towards an improved global antioxidant response method (GAR+):Physiological-resembling in vitro digestion-fermentation method[J].Food Chem,2018,239(1):1253-1262.
[11]覃引，熊音如，卢丽，等.不同发酵方式制备树莓-石榴复合果汁酵素的抗氧化活性研究[J].中国酿造，2019，38（10）：105-109.
[12]张静雯.组合菌发酵过程中产生的微生物酵素及其生物活性研究[D].武汉：武汉轻工大学，2015.
[13]李杰，赵声兰，陈朝银.核桃青皮果蔬酵素的成分组成及体外抗氧化活性研究[J].食品工业科技，2016，37（10）：117-122.
[14]樊秋元.黑加仑酵素的制备及其抗氧化活性的研究[D].大庆：黑龙江八一农垦大学，2019.
[15]李杰，赵声兰，陈朝银.核桃青皮果蔬酵素的成分组成及体外抗氧化活性研究[J].食品工业科技，2016，37（10）：117-122.
[16]蒋增良，毛健卫，黄俊，等.葡萄酵素在天然发酵过程中体外抗氧化性能的变化[J].中国食品学报，2014，14（10）：29-34.
[17]周颖，韦仕静，葛亚中，等.生姜酵素发酵过程中生物活性成分含量及其抗氧化活性的变化[J].食品工业科技，2018，39（18）：39-44.
[18]周偏，蔡坤，梁丛颖，等.诺丽酵素在自然发酵过程中体外抗氧化活性变化及品质研究[J].中国酿造，2018，37（1）：92-96.
[19]姚笛，徐磊，李佳慧.三种酵素的抗氧化活性与微生物多样性的相关性研究[J].天然产物研究与开发，2020，32（6）：928-936.
[20]张梦梅，刘芳，胡凯弟，等.酵素食品微生物指标与主要功效酶及有机酸分析[J].食品与发酵工业，2017，43（9）：195-200.
[21]XIAO Y,WANG L,RUI X,et al.Enhancement of the antioxidant capacity of soy whey by fermentation with Lactobacillus plantarum B1-6[J]. J Funct Food,2015,12(1):33-44.
[22]ALI M,MRUTHUNJAYA K,MANJULA S N.Health benefits of Morinda citrifolia(Noni):A review[J].Pharmacogn J,2016,8(4):321-334.
[23]张思，王蕾，张志旭，等.16种市售酵素食品功能分析与评价[J].食品与机械，2016，32（9）：196-200，224.
[24]晏殊.水果酵素自然发酵中优势菌株的分离鉴定及其代谢产物功效特性的研究[D].长沙：中南林业科技大学，2019.