黄酒是世界著名的酿造酒之一，也是中国特有的酒种，近来黄酒因其细腻清爽的口感和高雅的香气，越来越受到消费者的喜爱。传统黄酒生产工艺中主要采用糯米、粳米、籼米等作为酿造原料，也有一些使用青稞、黍米等具有地域特色的原料来酿造[1-2]。小米作为一种营养价值极高的天然功能性食品，在开发应用方面有得天独厚的优势，目前已有许多关于小米在酸奶、面包、婴儿辅食等产品中的应用研究，由于小米具有高支链淀粉含量和高营养价值，因此其很适合作为黄酒酿造的原料。目前对小米黄酒的研究主要集中在酿造工艺的研究[3-4]，对小米黄酒中风味成分的研究相对较少，所以研究不同小米品种对其所酿造黄酒中风味成分的影响具有一定的意义。
黄酒的风味是评价其品质的重要指标之一，酒体中的挥发性风味物质对黄酒整体风味有着重要贡献，而不同原料酿制的黄酒风味成分也有所不同。
由于黄酒中的挥发性风味成分组成复杂、含量各异且多数质量浓度较低，不同的风味成分具有不同的挥发性、溶解性、极性及稳定性等提取特性，且受黄酒复杂基质如酒精的影响。因此，仅通过单一的提取分离和检测分析方式对黄酒中的挥发性风味成分定性定量分析较为困难。气相色谱-质谱联用检测技术（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）是目前在风味物质检测中应用最为广泛的一种技术，其利用质谱仪可对样品中单个风味物质进行定性定量鉴定，具有多种优点。根据目前相关的研究[5-8]，本研究利用顶空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）提取技术和GC-MS联用检测技术对不同品种小米酿造黄酒中的风味物质进行差异分析，为选取不同品种小米酿造黄酒提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
5种小米（黄金1号，小香谷，大金苗，晋谷21，东方亮）：市售。安琪酿酒曲（绍酒风味T3）、安琪高活性干酵母：安琪酵母股份公司。
氢氧化钠、盐酸、硫酸铜、硫酸钾、硫酸、硼酸、甲基红指示剂、亚甲基蓝指示剂、无水乙醇、无水乙醚、石油醚、乙酸铅、硫酸钠、氯化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、甲醛、亚铁氰化钾（均为分析纯）：成都科龙化工试剂厂；正构烷烃混标C3～C9（色谱纯）、正构烷烃混标C10～C25（色谱纯）：百灵威科技有限公司；2-辛醇（色谱纯）、D-无水葡萄糖（色谱纯）：美国Sigma公司。
1.2 仪器与设备
DGG-9240B电热恒温鼓风干燥箱：上海森信实验仪器有限公司；SKD-200凯氏定氮仪：上海沛欧仪器有限公司；LHS-150SC恒温培养箱：上海齐欣科学仪器有限公司；PB-10酸度计：德国赛多利斯集团；UV1000紫外可见分光光度计：上海天美科学仪器有限公司；手动SPME进样器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头：美国supelco公司；QP2010气质联用仪：日本岛津公司。
1.3 方法
1.3.1 小米原料基本营养成分测定
水分含量按照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》[9]中的直接干燥法进行测定。蛋白质含量按照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[10]中的凯氏定氮法进行测定。脂肪含量按照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》[11]中的索氏抽提法进行测定。淀粉含量按照GB 5009.9—2016《食品安全国家标准食品中淀粉的测定》[12]中的酸水解法进行测定。
1.3.2 小米黄酒酿制工艺流程及操作要点[13]
操作要点：浸米后常压蒸煮50 min（考虑小米的特性）再进行糖化；主发酵结束后密封，于18 ℃陈酿15 d进行后发酵；后发酵结束离心分离酒糟（8 000 r/min、15 min），取上清液。
浸米条件：加水量150%、20 ℃浸米36 h；糖化条件：酒曲添加量0.6%，30 ℃糖化60 h；主发酵条件：酵母添加量0.22%，32 ℃发酵5 d。
1.3.3 小米黄酒基本理化指标测定和感官评价
还原糖：3,5-二硝基水杨酸法[14]测定；酒精度、总酸按照GB/T 13662—2018《黄酒》[15]测定。出糟率：酒糟质量与分离前酒糟醪液总质量之比。试验平行3次，各指标取平均值。
选10名经培训的人员组成感官品评小组。要求小组成员从小米黄酒的色泽、香气、口感、典型性和组织状态5个方面进行评分，结果取平均值。小米黄酒品质的优劣以综合得分为依据，满分100分，59分及以下为不合格，60～79分为良好，80～100分为优质[16]。
1.3.4 挥发性风味成分测定
参考刘敬科等[17]的方法，采用HS-SPME萃取方式及GC-MS分析技术，比较不同品种小米酿造所得黄酒中的挥发性风味成分。
顶空固相微萃取：取8 mL小米黄酒样品于20 mL顶空瓶中，加入2 g氯化钠以促进香气的挥发，再加入10 μL（491.4 mg/L）2-辛醇内标溶液，平衡5 min，采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS三相萃取头，于50 ℃吸附萃取50 min后，在250 ℃进样口温度条件下解吸附5 min，进行GC-MS分析。
气相色谱条件：色谱柱为DB-5MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度250 ℃；程序升温，初始温度40 ℃保持5 min，以2.5 ℃/min升至65 ℃保持1 min，以5 ℃/min升至200 ℃保持2 min，以10 ℃/min升至250 ℃保持2 min；载气：氦气（纯度＜99.999%）；压力47.7 kPa；柱流量1.0 mL/min，分流比4∶1。质谱条件：电离方式为电子电离（electronic ionization，EI）源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；质谱扫描范围m/z 50～550；采集模式，全扫描。
定性方法：试验数据处理由GC-MS Solution软件系统完成，C3～C9、C10～C25正构烷烃标准品与样品相同条件经GC-MS分析，由保留时间计算得保留指数（retention index，RI），再结合美国国家标准与技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）08谱库检索进行定性。
定量方法：采用峰面积归一化法计算各挥发性成分相对含量。
2 结果与分析
2.1 不同品种小米基本营养成分含量分析
5个品种小米的基本营养成分如表1所示。由表1可以看出，5个小米品种中水分含量最高的是东方亮为（12.91±0.19）%，最低的是大金苗为（11.07±0.14）%；脂肪含量最高的是东方亮为（5.36±0.05）%，最低的是小香谷为（2.22±0.09）%；蛋白质含量最高的是晋谷21为（11.34±0.08）%，最低的是黄金1号为（8.94±0.08）%；粗淀粉含量最高的是黄金1号为（73.77±0.13）%，最低的是晋谷21为（69.25±0.11）%。对于传统大米酿制黄酒有研究表明，大米中脂肪含量与黄酒的出酒率呈负相关[18]，因此脂肪含量低的小米品种更适合用于酿酒。同时有研究表明[19-21]，降低原料中蛋白质含量能有效控制黄酒中由过量高级醇带来的异味以及酒体中氨基甲酸乙酯和生物胺等有害物质含量，因此从酒的安全性方面来看，蛋白质含量相对较低的小米品种更适合用于酿酒。另外由于淀粉颗粒吸水后会膨胀，所以较高的淀粉含量有利于小米吸水，可以促进小米糖化发酵过程，转化生成更多的还原糖。
表1 不同品种小米基本营养成分及含量
Table 1 Basic nutrient contents of different kinds of millet
注：同一列字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
2.2 不同品种小米酿造黄酒基本指标分析
5个品种小米所酿黄酒的基本理化指标及感官评价如表2所示。由表2可以看出，在相同发酵条件下，不同品种小米所酿黄酒的主要理化指标差异较大。酒精度最高的是小香谷为（12.73±0.06）%vol，最低的是东方亮为（11.09±0.06）%vol；总酸含量最高的是小香谷为（6.67±0.07）g/L，最低的是黄金1号为（5.53±0.05）g/L；还原糖含量最高的是晋谷21为（5.49±0.09）g/L，最低的是小香谷为（4.65±0.08）g/L；出糟率最高的是晋谷21为（23.09±0.26）%，最低的是黄金1号为（18.66±0.18）%；感官评分最高的是小香谷为（89.66±0.89）分，最低的是黄金1号为（81.75±0.71）分。小香谷和黄金1号所酿小米黄酒酒精度较高，还原糖含量较低，发酵最彻底，与其他3个品种差异显著（P＜0.05）。东方亮、晋谷21所酿小米黄酒酒精度均低于11.5%vol，还原糖含量较高，发酵程度不如其他3个品种，这可能是由于不同品种的小米中直、支链淀粉含量不同，进而酵母对其利用程度不同。综合小米黄酒几个主要理化指标分析，小香谷所酿小米黄酒酒精度较高，发酵彻底，出糟率低，并且感官评分最高，品质最优。
表2 不同品种小米酿造黄酒的基本指标
Table 2 Basic indicators of Huangjiu brewed with different kinds of millet
注：同一行字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
2.3 不同品种小米酿造黄酒挥发性风味成分比较分析
2.3.1 不同品种小米黄酒挥发性物质种类分析
不同品种小米黄酒风味物质GC-MS分析总离子色谱流图如图1所示。
图1 不同品种小米黄酒风味GC-MS分析总离子流色谱图
Fig.1 Total ion chromatogram of flavor of different varieties of millet Huangjiu analyzed by GC-MS
表3 不同品种小米黄酒挥发性风味成分
Table 3 Volatile flavor components of different varieties of millet Huangjiu
续表
续表
续表
续表
注：“-”表示未检出。
通过HS-SPME和GC-MS联用技术定性定量分析可获得5个品种小米所酿小米黄酒中挥发性风味成分的种类和含量如表3所示。统计得出，5个品种小米黄酒共检测出222种风味物质，分别有酯类、醇类、酸类、醛酮类、萜烯类、芳香族、烷烃类和其他种类的化合物，其中黄金1号、小香谷、大金苗、晋谷21及东方亮所酿小米黄酒分别检测出56、92、98、81、74种风味物质。
由测定结果可知，不同原料品种酿造的小米黄酒中风味成分差异较大，测定出的风味成分中有5种物质为5个品种小米黄酒共有，其中酯类化合物4种：辛酸乙酯具有菠萝、苹果样的香韵和白兰地的酒香味，该物质对甘薯烧酒的风味也有重要贡献[22]；己酸乙酯具有曲香、菠萝香型的香气，常用于曲酒调香，是传统黄酒的典型香气[23]；丁二酸二乙酯又名琥珀酸二乙酯，具有西瓜的香气；乙酸乙酯具有清灵、微带果香的酒香，但易扩散不持久，为传统黄酒主要的酯类物质之一[24]。共有的醇类化合物仅1种，为β-苯乙醇，其具有玫瑰花香、茉莉花香、蜂蜜香等多种香气，是传统黄酒中最为重要的高级醇成分，其对黄酒风味具有重要影响[25]。另外，3-甲基丁醇、棕榈酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、油酸乙酯、月桂酸乙酯、十四酸乙酯、乙酸苯乙酯等传统黄酒典型风味成分在多数品种小米黄酒中也均有检出。
此外，5个品种小米黄酒均有检测出其独有的风味成分，这说明不同品种小米黄酒中挥发性风味成分种类差异较大。如黄金1号中含有的乳酸异戊酯在汾酒和葡萄酒中也有检出[26-27]，但其含有的巯基乙酸具有令人不愉快的气味；小香谷中含有香草醛，具有香草气味，是香草豆的香味成分；大金苗中含有蘑菇醇，具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香气；晋谷21中含有丙酸乙酯，具有蜜糖、香蕉、菠萝、奶油香型香气，在多种果酒及白酒中均有检出[28-29]；东方亮中含有甲酸己酯、丁酸异戊酯、辛醛等，分别具有苹果香气、甜橙香气及强烈的香蕉和洋梨香气。这些风味在小米黄酒中虽然含量较低，但同时其阈值也较低，所以对小米黄酒的总体香气有较大贡献并起着重要的作用。
酯类和醇类化合物为小米黄酒的主要风味物质，其中酯类化合物中黄金1号、小香谷、大金苗、晋谷21、东方亮分别含有25种、40种、41种、36种、28种，醇类化合物分别含有13种、12种、11种、11种、10种。其余几类化合物虽然有很多种类在酒中被检测到，但总体来看其物质浓度相对酯类和醇类物质较低。
醇类物质主要是原料中的蛋白质、氨基酸和糖类在发酵过程中降解而成，为黄酒中呈味成分之一，所以蛋白质含量过低会导致酒体中风味物质种类较少，风味较差。由GC-MS检测结果结合不同品种小米原料的基本营养成分分析可以看出，黄金1号的蛋白质含量相对其他品种较低，同时其在挥发性风味成分的总数和酯类数量上也显著低于其他品种，造成其风味丰富程度较差，酒体风味较为寡淡。相反，小香谷、大金苗、晋谷21的蛋白质含量相对较高，其风味成分种类也较为丰富。而东方亮虽然有较高的蛋白质含量，但其风味成分种类丰富程度并不算高，这可能是由于其他成分的影响。
酯类物质是小米黄酒风味成分中最多的一类，酿造初期酯类物质主要来自酵母发酵，而在陈酿过程中醇类与酸类进行酯化反应使酯类化合物不断增加。醛酮类物质常具有特殊的香气，与酸类物质对总体香气起到协调、融合的作用。烷烃类化合物一般对总体风味的贡献很小，可忽略。
不同品种小米黄酒挥发性风味成分不仅在种类上差异较大，其共有成分含量差异也较大。其中β-苯乙醇和丁二酸二乙酯在不同品种小米中的含量差异较其他3种风味物质更为显著，而辛酸乙酯在黄金1号和小香谷中的含量则较为接近。除己酸乙酯外，晋谷21中其余4种风味物质含量均较高且在适宜浓度范围，具有更浓郁的香气。
2.3.2 不同品种小米黄酒挥发性物质种类主成分分析
对不同品种小米黄酒中的挥发性物质种类进行主成分分析，得到挥发性物质种类的载荷图（图2a）和不同品种小米黄酒的得分图（图2b）。
图2 不同品种小米黄酒中挥发性物质种类的主成分分析
Fig.2 Principal component analysis of volatile substances types in different varieties of millet Huangjiu
由图2可知，第一主成分占51.066%，第二主成分占34.064%，累计方差贡献率达到85.130%，表示能够解释样品中的大部分信息。由图2a可知，酯类（载荷系数为0.997）与第一主成分呈高度正相关，醇类（载荷系数为-0.937）与第二主成分呈高度负相关。由图2b可知，晋谷21与小香谷的距离较近，说明这两种小米酿制的黄酒中的挥发性物质种类在第一主成分和第二主成分上相差不大，而东方亮、大金苗、黄金1号所酿黄酒样品都独立于各自的象限中，与其他样品距离较远，说明这几种样品中的挥发性物质种类存在较大差距。
3 结论
本研究用5个不同品种的小米作为原料酿造黄酒，对不同品种的原料进行了基本营养成分的分析，并利用HS-SPME提取技术和GC-MS联用检测技术对不同品种小米酿造黄酒中的风味物质进行了分析。结果表明，不同品种原料小米酿造的黄酒中风味物质的种类和含量都有较大差异，5个品种的小米黄酒中所共有的风味物质较少，各个品种均含有其独有的风味成分。说明酿造原料对小米黄酒中的挥发性风味成分有明显的影响，应综合考虑各个方面，选取适合的小米品种作为酿造原料才能更好的保证小米黄酒的综合口感，此研究结果为选取小米品种酿造黄酒提供了科学依据。
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