红枣（ZizyphusjujubeMill）又名大枣，是由鼠李科（Rhamnaceae）植被枣树的成熟果实经暴晒脱水而成的呈红色或深红色的干果[1]。红枣是食药两用水果，具有补气养身、抗衰老、生理保健等功效[2-3]。红枣中含有多种丰富的维生素和微量元素及生物活性成分[4]，具有深入研究的价值。新疆是中国优质红枣的栽培基地，而目前新疆的红枣产品种类单一，加工形式主要还是以干制或粗制加工为主，如干制红枣、红枣速溶粉和红枣浓缩汁等[5-6]。目前红枣精深加工类产品相对较少，致使每年市场上的红枣处于超额状态，因此开发红枣精深加工的产品是提高红枣的经济价值，带动红枣产业发展的有效途径。
益生菌是指具有一定生命力，且对宿主有益的活性微生物。当动物宿主摄入一定数目的菌群时会产生健康功效，能对动物机体产生有益的生物活性物质，同时还可以维持机体肠道微生物处于平衡的状态[7]。益生菌中部分乳酸菌在发酵饮料中还具有益生功能[8]，对降低胆固醇、降血清和降血压等具有一定的功效[9]。还可改善果汁的风味，提高果汁的营养价值，防止果汁变坏，延长保存期，增加保健作用，其功效有益于提高人体健康水平[10]。其中，丹尼斯克商业混合菌种（乳杆菌类、双岐乳杆菌类、革兰氏阳性球菌等）已被临床证实对改善人体胃肠道、提高免疫力等具有一定的疗效[11]。除此之外，益生菌的生长还与其他物质有关，如红枣中的红枣多糖不仅是红枣中重要的功能性成分，具有很多生理保健的功能[12]，还会对乳酸菌的生长产生一定的影响。适量的红枣多糖能够增加乳酸菌活菌数，提高产品品质[13]。益生菌发酵饮料口感清爽酸甜，受到大众的普遍青睐，但关于益生菌发酵红枣饮料的工艺还需进一步探索和优化。
本研究以阿克苏红枣为原料，利用丹尼斯克商业菌种发酵红枣制作饮料，并以感官评价和活菌数为评价指标，设计单因素试验和响应面试验，确定最佳发酵工艺参数，以期为红枣益生菌发酵饮料加工工艺开辟新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料与菌种
阿克苏红枣：市售；丹尼斯克商业菌种YO-MIX 207、YO-MIX 863、YO-MIX 883（嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌及不影响酸奶质构的乳双歧杆菌或嗜酸乳杆菌）：丹尼斯克（中国）有限公司。
1.1.2 化学试剂
ROHAVIN Flash果胶酶（酶活100 U/g）：新疆鼎唐贸易公司；碳酸钠、葡萄糖、氯化钠、磷酸二氢钾、乙酸钠、硫酸锰、吐温-80（均为分析纯）：天津市盛奥化学试剂有限公司；硫酸镁、柠檬酸氢二铵、酵母膏、琼脂粉、牛肉膏、蛋白胨（均为分析纯或生化试剂）：北京奥博星生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
MC202231手持折光仪：四川成都泰光学有限公司；TD-A型分析天平：余桃金诺天平仪器有限公司；WMS-PB108奥科打浆机：江西南昌田汀厨具有限公司；F50型胶体磨：沈阳航天新光超微粉碎机械有限公司；HWS-28电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；GJJ-0.03T/70Mpa型高压均质机：上海诺尼轻工机械有限公司；pHS-3C型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；SPX-250B型生化培养箱：常州诺基仪器有限公司；LDZX-30KBS高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2D超净工作台：苏州苏洁净化设备有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 益生菌发酵红枣饮料工艺流程
红枣筛选→去核→混合打浆（红枣∶蒸馏水=1∶5）→过胶体磨→浸提（0.05%果胶酶，45 ℃，2 h）→过滤→均质→调配→高温杀菌（90 ℃，20 min）→接种发酵→成品
1.3.2 工艺操作要点
红枣筛选、去核、混合打浆：挑选颗粒饱满、无霉病的干制红枣，用去离子水清洗并沥干水分。将清洗好的红枣去核，随后与蒸馏水混合打浆120 s。
过胶体磨：通过胶体磨将红枣汁中的颗粒打磨更细碎[14-15]。
浸提：向混合打浆好的红枣原料中加入0.05%果胶酶后放入45 ℃的水浴锅中水浴浸提2 h，使红枣与蒸馏水充分融合，提高红枣的浸出物，充分释放红枣的香味物质与有效成分[16]。
过滤：将红枣汁用8层纱布滤去果肉，后用150目筛网进行过滤，以确保汁液能够通过均质机。
均质：将过滤完的红枣汁通过高压均质机处理。
调配：均质后用碳酸钠将其pH调至适宜菌种生长的范围，用手持折射仪测量可溶性固形物含量。
高温杀菌：浸提液进行高温杀菌（90 ℃水浴环境中杀菌20 min）[17]，随后冷却至室温备用。
接种发酵：称取适量的丹尼斯克菌种，加入5%的葡萄糖水溶液10 mL，将菌种活化培养30 min（活化后的活菌数为6.0 lg（CFU/mL））；随后在无菌环境下，将其接种于灭菌冷却好的浸提液中，然后在恒温培养箱中控温发酵，并定期进行搅拌测其pH值，当发酵一定时间pH降至合适范围时则终止发酵，即得益生菌发酵红枣饮料。
1.3.3 红枣益生菌发酵饮料发酵工艺优化单因素试验
以红枣饮料的感官评价和活菌数作为考察指标，设置菌种型号（YO-MIX 207、YO-MIX 863、YO-MIX 883）、红枣含量（10%、20%、30%、40%、50%）、初始pH（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）、菌种添加量（0.03%、0.06%、0.09%、0.12%、0.15%）、发酵温度（35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃、43 ℃）、发酵时间（36 h、39 h、42 h、45 h、48 h）为单因素变量，考察其对红枣饮料感官评分和活菌数的影响。
1.3.4 红枣益生菌发酵饮料发酵工艺优化响应面试验
以单因素试验得到的最佳参数为基础，采用Design-ExpertV8.0.6响应面软件对菌种添加量（A）、初始pH值（B）、发酵温度（C）及发酵时间（D）设计4因素3水平的响应面优化试验，以感官评分和活菌数为响应值，并对试验进行回归分析。Box-Behnken试验因素与水平见表1。
表1 发酵条件优化Box-Behnken试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests for fermentation conditions optimization
1.3.5 感官评价标准
选取10名经过感官评价培训的人员，按照表2的评分准则对产品进行综合评定打分，最终评定结果取平均值（满分100分）。
表2 益生菌发酵红枣饮料的感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards for probiotics fermented jujube beverage
续表
1.3.6 指标检测方法
可溶性固形物含量测定：使用手持折射仪测定样品的可溶性固形物。总糖含量测定：采用直接滴定法测定样品的总糖含量[18]。pH的测定：使用pH计测定样品的pH值；乳酸菌活菌数量测定：活菌计数按照梯度稀释平板涂布的方法进行培养观察，以CFU/mL来表示活菌数[19]。
总酸含量的测定：采用酸碱滴定法进行测定[20]，总酸（total acid，TA）含量计算公式如下：
式中：TA为总酸含量（以乳酸计），g/L；c为氢氧化钠标准滴定液的浓度，mol/L；v1为滴定时消耗氢氧化钠标准液的体积，mL；v2为空白样品消耗氢氧化钠标准液的体积，mL；v3为液体样品的体积，mL；90为乳酸的摩尔质量值，g/mol。
1.3.7 数据处理
采用Design-ExpertV8.0.6以及Origin 8.0处理数据。
2 结果与分析
2.1 发酵条件优化单因素试验
2.1.1 菌种对感官评分和活菌数的影响
由图1可知，不同菌种发酵得到的红枣饮料之间感官评分与活菌数各不相同，且差异性较大，造成这种差异性可能是由于不同菌种所具有的性能不同所致，每个菌种生长繁殖的代谢产物不尽相同，因而对最终产品的口感及活菌数产生影响，活菌数的不同可能还与活性菌种的活度有关，不同活性干粉菌种自身所配比的营养成分与比例各不相同，在发酵时乳酸菌发挥作用的时间与生长程度就会有所差异，由图1可知，菌种YO-MIX 863的感官评分与活菌数最高。故综合考虑，最佳的菌种为YO-MIX 863。
图1 菌种对红枣饮料感官评分和活菌数的影响
Fig.1 Effects of strain on sensory score and viable count of jujube beverage
2.1.2 红枣含量对感官评分和活菌数的影响
由图2可知，随着原料比例的增多，感官评分出现先增大后减少的趋向，在红枣含量为20%时，感官评分达到最大，为89分，这是因为随着红枣含量的增多，红枣饮料的糖度在逐步增大，而发酵过程中产生的酸度是固定的，致使红枣饮料的糖酸比例失衡，口感变腻，感官评分下滑；活菌数随着红枣含量的增多也出现先增大后减少的趋向，在红枣含量为20%时达到最大，这可能是由于红枣含量的增多使料液比例失衡，在浸提与发酵时红枣中的营养物质无法完全浸出与分解，无法提供菌种生长所需的营养成分，近而使得乳酸菌的生长繁殖受到限制，活菌数量出现下降。故综合上述因素，得到最佳红枣含量为20%。
图2 红枣含量对红枣饮料感官评分和活菌数的影响
Fig.2 Effect of jujube content on sensory score and viable count of jujube beverage
2.1.3 初始pH值对感官评分和活菌数的影响
由图3可知，初始pH值在4.5～6.0的范围内，感官评分与活菌数的变化是随着pH的增大呈上升的趋势，且增幅较大，变化趋势与pH的变化呈正相关关系；感官评分在pH为6.0时达到最大，为96分，随后pH增大感官评分减小，而活菌数随着pH的进一步增大呈现出升高的趋势；这可能是由于乳酸菌的特殊生长环境所致，乳酸菌在pH趋于中性的环境中其生长繁殖能力最佳，生长效果作用最为显著，因为大多数菌种的耐酸性效果并不佳，在酸性较强的环境中菌种就会失去活性，而乳酸菌在生长繁殖过程中会代谢出大量的乳酸等酸类化合物[21]，会对菌种的生长产生影响，故发酵环境pH越趋于中性，其在发酵过程中的酸度增加就越缓慢，对乳酸菌的生长繁殖就越有利；感官评分在pH为6.5时出现下降是因为pH趋中性影响了产品最终的口感，使得口感体验较差。综合考虑得到最佳初始pH值为6.0。
图3 初始pH值对红枣饮料感官评分和活菌数的影响
Fig.3 Effect of initial pH value on sensory score and viable count of jujube beverage
2.1.4 菌种添加量对感官评分和活菌数的影响
由图4可知，随着菌种添加量的加大，在0.03%～0.09%范围内感官评分呈上升趋势，且增幅较大，在0.09%～0.15%呈下降趋势，在菌种添加量0.09%时感官评分最高为93分；活菌数的变化以0.12%为分界点，呈现先升高后下降的趋势，在菌种添加量为0.12%时到达最高值8.7 lg（CFU/mL），这可能是因为当菌种量增多时，其生长繁殖需要更多的营养成分，但发酵液中的营养成分有限，不能供给过多菌种的生长，从而影响乳酸菌的生长繁殖，且乳酸菌添加量过多在发酵时产生的酸类化合物较多，影响产品最终的口感，菌种添加量过少时发酵速率缓慢，更易于受到有害菌的污染，影响产品的品质[22-23]，使得感官评分降低，且产品最终的活菌数也达不到要求。综合感官评分和活菌数的变化，得到菌种最佳添加量为0.09%。
图4 菌种添加量对红枣饮料感官评分和活菌数的影响
Fig.4 Effect of strain addition on sensory score and viable count of jujube beverage
2.1.5 发酵温度对感官评分和活菌数的影响
由图5可知，当发酵温度为37 ℃时，感官评分与活菌数都到达最高值，在37 ℃之后随着发酵温度的上升，感官评分与活菌数都呈现下降的趋势，这可能是菌种的耐热性较差所致，温度较高对乳酸菌的生长活性有影响，温度过高时乳酸菌就会失去活性，从而影响发酵进程和最终的产品活菌数[24]；感官评分在37 ℃达到最大值91分，感官评分的变化可能是因为发酵温度过高时会影响饮料中的果香味物质，破坏香味物质的化学组成，影响饮料的品质，而温度较低时能较好的保留住这种香味物质，提高饮料的果香味。故综合思量，得到最佳的发酵温度为37 ℃。
图5 发酵温度对红枣饮料感官评分和活菌数的影响
Fig.5 Effect of fermentation temperature on sensory score and viable count of jujube beverage
2.1.6 发酵时间对感官评分和活菌数的影响
由图6可知，随着发酵时间的延长，感官评分和活菌数都出现先升高后降落的变化趋势，当发酵时间为42 h时，两者都出现最大值，这可能是因为发酵时间过短时乳酸菌发酵没有达到最佳效果，其代谢产物不够丰富，对饮料品质没有明显的提升，生长繁殖也受到限制，活菌数达不到要求；发酵时间过长时，乳酸菌的生长代谢产物乳酸过多，提高了发酵液的酸性，而菌种在酸性环境中容易失去活性，耐酸性较差，致使乳酸菌活菌数下降[25]，同时酸性的上升影响产品的糖酸平衡，使得感官评分下降。综合考虑感官评分与活菌数的变化，得到最佳发酵时间为42 h。
图6 发酵时间对红枣饮料感官评分和活菌数的影响
Fig.6 Effect of fermentation time on sensory score and viable count of jujube beverage
2.2 红枣益生菌发酵饮料响应面试验结果与分析
2.2.1 响应面设计方案与结果
根据发酵单因素试验优化结果，采用响应面法对菌种添加量（A）、初始pH（B）、发酵温度（C）及发酵时间（D）进行响应面优化试验，建立4因素3水平的响应面设计方案，响应面的响应值设为感官评分（M）和活菌数量（N），响应面设计方案与结果见表3。
表3 发酵条件优化响应面设计与结果
Table 3 Design and results of Box-Behnken tests for fermentation conditions optimization
续表
2.2.2 建立回归模型和方差分析
采用响应面软件对表3进行统计分析后，得到感官评分和活菌数量的多元二次回归方程如下所示：
对感官评分（M）和活菌数（N）的多元回归二次方程进行模型方差分析，结果见表4。
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“*”表示影响显著（P＜0.05），“**”表示影响极显著（P＜0.01）。
结果表明，感官评分（M）和活菌数（N）的回归模型显著性结果显示P＜0.001，为极显著，失拟项为P=0.089 0/0.070 5，失拟项结果为不显著，说明两种模型为差异极显著，感官评分（M）和活菌数（N）与4个响应因素间的线性显著关系为极显著；两个模型的相关系数为R2（M）=0.980 6，R2（N）=0.953 7，校正系数为R2Adj（M）=0.961 1，R2Adj（N）=0.943 1，说明两个模型的回归拟合度较好，更接近实际试验，且校正系数值说明两个模型仅有3.89%和5.69%的变异情况不能采用此模型的回归方程解释，综合分析，得出此回归模型可用于对发酵工艺的响应面因素进行分析和预测。
由表4的显著性结果可知，感官评分的回归模型中一次项A、B、C、D和交互项CD对结果影响极显著（P＜0.01），二次项A2、B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01），其余都为不显著（P＞0.05）；活菌数的回归模型中一次项A、D对结果影响显著（P＜0.05），一次项B、C和二次项A2、B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01）。此外，通过F值大小可反映出各响应面因素对产品感官评分的影响因次顺序为：初始pH值（B）＞发酵温度（C）=发酵时间（D）＞菌种添加量（A），对活菌数的影响因次顺序为：发酵温度（C）＞初始pH（B）＞菌种添加量（A）＞发酵时间（D）。
2.2.3 响应面因素交互分析
通过模型方程绘制的响应面图和等高线图可直观体现出响应面因素菌种添加量（A）、初始pH（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）与响应值感官评分（M）和活菌数（N）间的关系及各响应因素间的交互作用关系。根据各因素间的三维响应面图和等高线图判定各因素间交互作用的强弱，也能反映出两因素间的交互作用对响应值的影响大小。等高线图为椭圆形则代表两者交互作用强，反之则代表交互作用弱[26]；而三维响应面图曲面坡度幅度则代表响应值的变化幅度，曲面坡度越陡，对响应值的影响越大，反之则越小[27]。
由图7可知，响应值感官评分（M）和活菌数（N）随着4个响应因素的增大呈现先上升后下降的趋势，其中感官评分（M）与四个响应因素之间形成的三维响应面图坡面较陡，坡度较大，说明四个响应因素对感官评分（M）影响较大。活菌数（N）与菌种添加量（A）、初始pH值（B）及发酵温度（C）间形成的三维响应面图坡面较陡，说明这三个响应因素对活菌数（N）影响较大，而发酵时间（D）的三维响应图坡面较缓，坡度较小，说明发酵时间（D）对活菌数（N）影响较小。同时发酵温度（C）与发酵时间（D）对感官评分（M）的影响是显著（P＜0.05）。
图7 各因素交互作用对益生菌发酵红枣饮料感官评分与活菌数影响的响应面图
Fig.7 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factor on sensory score and viable count of probiotics fermented jujube beverage
2.2.4 响应面模型验证试验
根据响应面软件分析得出4个响应因素对活菌数影响所得工艺参数分别菌种添加量0.09%、初始pH6.08、发酵温度37.43 ℃、发酵时间42.52 h，活菌数可达8.796 lg（CFU/mL）；对感官评分影响所得的工艺参数为菌种添加量0.1%、初始pH6.19、发酵温度37.4 ℃、发酵时间42.87 h，感官评分可达95.239分。在此基础上，该工艺以活菌数为首要参考指标，感官评分为次要参考指标，且在活菌数最优的工艺条件下，所得感官评分为95.035分，对产品并未产生显著影响。
最终确定益生菌发酵红枣饮料的工艺参数为：菌种添加量0.09%、初始pH6.08、发酵温度37.43 ℃、发酵时间42.52 h。为验证模型预测的工艺参数可靠性，根据实际情况，对上述工艺参数微调，最终实际工艺参数为菌种添加量0.09%、初始pH值为6.0、发酵温度37 ℃、发酵时间42 h，感官评分为95分，活菌数为8.6 lg（CFU/mL），实际数值与模型预测数值基本一致，故该多元线性回归模型基本准确。
2.2.5 益生菌发酵红枣饮料产品指标检测结果
通过此工艺参数得到的红枣饮料为褐黄色，且香气浓郁，酸甜适口，感官评分为95分。理化指标中，活菌数可达（8.60±0.12）CFU/mL，总糖含量可达（56.24±0.53）g/L，总酸含量可达（4.82±0.24）g/L。微生物指标中，大肠杆菌数量≤5 MPN/100 mL，未检出致病微生物，符合GB/T 31121—2014《果蔬汁类及其饮料》标准要求[28]。
3 结论
本试验以新疆阿克苏红枣为发酵原料，利用乳酸菌发酵红枣益生菌饮料。以原料比、初始pH、发酵时间和发酵温度设计发酵工艺单因素试验，并在此基础上以感官评分及活菌数为响应值进行响应面分析试验。得到优化后的工艺参数为菌种添加量0.09%、初始pH值为6.0、发酵温度37.43 ℃、发酵时间42.52 h，在此优化条件下，总糖含量为56.24 g/L，活菌数为8.6 lg（CFU/mL），感官评分可达95分。产品呈褐黄色，口感爽滑，酸甜适宜。结果表明，响应面模型验证实验具有可靠性，为进一步优化红枣益生菌发酵产品提供参考依据。
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