谷物酿造的历史悠久，谷物发酵的历史可追溯到古埃及和美索不达米亚[1]。谷物发酵可以分为酒精发酵和非酒精发酵，酒精发酵如酿造啤酒，非酒精发酵主要为乳酸菌发酵，偏酸性居多[2]。谷物发酵饮料中应用的功能性微生物种类较多，主要有乳酸菌、醋酸菌、特殊酵母菌和丝状真菌，通过发酵能够提高饮料的消化率、风味和口感，谷物非酒精发酵可作为粮食加工的一个新途径[2-3]。根据现行国家标准，谷物发酵饮料可以归类到植物饮料中的其他植物饮料类别，是指以谷物或谷物提取物为原料，添加或不添加其他食品原辅料和（或）食品添加剂，经发酵制成的液体饮料[4-5]。非酒精谷物发酵饮料可用的主要谷物有藜麦、黑麦、小麦、大米、燕麦、小米、玉米、谷粒、高粱和大麦等[6-7]。这些谷物因营养价值高，含有膳食纤维、维生素、蛋白质和生物活性化合物，来源廉价，一年四季都可获得而被广泛使用[8]。
随着人们不断增强的健康意识，具有潜在健康效益的非酒精谷物发酵方面的研究越来越多[9]。刘仁禄等[10]使用酵母菌和乳酸菌混合发酵用大麦芽制备的麦芽汁，开发出了一款麦芽汁发酵饮料，并对生产工艺进行了研究。LEMARCQ M等[11]使用鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）和干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）发酵麦汁制备了一款功能性益生菌饮品，并且评估了饮料的质量和保质期以及发酵麦汁中益生菌的生存能力。此外科研人员分别利用燕麦、薏米、玉米、糙米等为原料，单独使用乳酸菌或乳酸菌和酵母菌两种菌种进行发酵，来制备谷物发酵饮品，取得一定的研究成果[2]。由于消费者在选择功能性食品时，口味因素占59%，营养因素仅占36%[12]。尽管单独使用乳酸菌发酵制备谷物发酵饮料的健康益处是公认的，但消费者对它们的接受度很低[6]。可以尝试使用乳酸菌和酵母菌或其他菌种混合发酵来制备大众能够接受的产品。目前使用混合菌种开发出的谷物发酵饮料大都具有令人反感的异味和味道，如过重的麦芽味，酸败味和类谷物味等，虽然产品的记忆点很强，但是大众的接受度低，不具备市场前景[9]。因此需要从谷物原料选择和处理，发酵微生物的选择和制备工艺的优化这几个方面相结合来克服这些问题。
本研究使用大麦芽、小米、赤小豆、燕麦和香型啤酒花为原料，并经过特定的糖化工艺来制备谷物汁，使用高活性面包酵母和副干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）和瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）两种乳酸菌作为发酵菌种，采用一步混合发酵的工艺来制备谷物发酵饮料。使用单因素试验和响应面试验[13-15]对发酵工艺进行优化。旨在开发出一款具有记忆点并且大众接受度高的新型的谷物发酵饮料，并为其产业化生产奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料和菌株
安琪高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；副干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）：科汉森（中国）有限公司；麦芽：烟台帝伯仕自酿机有限公司；赫兹布鲁克牌香型颗粒啤酒花：山东安克生物工程有限公司；燕麦、赤小豆及其他谷物原料：市售。
1.1.2 化学试剂
中性蛋白酶（0.8 AU/g）、中温淀粉酶（480 KNU/g）：诺维信（中国）生物技术有限公司；牛肉膏、蛋白胨（均为生化试剂）：北京奥博星生物技术有限公司；葡萄糖、磷酸氢二钾、乙酸钠、柠檬酸二铵、一水合硫酸锰（均为分析纯）：天津市广成化学试剂有限公司；碘化钾（分析纯）：天津市科盟化工工贸有限公司；吐温80：武汉清汇生物科技有限公司。
1.1.3 培养基
12°P麦芽汁培养基：12°P麦芽汁，自然pH，115 ℃灭菌30 min。
MRS培养基[10]：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，葡萄糖5.0 g，吐温80 1.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，乙酸钠5.0 g，柠檬酸二铵2.0 g，七水合硫酸镁0.2 g，一水合硫酸锰0.05 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.5～6.8，115 ℃灭菌30 min。
1.2 仪器与设备
ALCOLYZER M安东帕酒精分析仪：奥地利安东帕公司；WYA-2WAJ阿贝折射仪测定：上海力辰仪器科技有限公司；PHS-3C 酸度计：上海雷磁仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 谷物发酵饮料加工工艺流程及操作要点
谷物→粉碎→糊化、糖化→煮沸→过滤→接种→发酵→调配→灭菌→谷物发酵饮料
谷物粉碎：使用粉碎机粉碎，大麦芽粉碎至破而不碎，赤小豆、燕麦粉碎至大约40目。
糊化、糖化：大麦芽、小米、赤小豆、燕麦的原料质量比为5∶1∶1∶1。向粉碎好的燕麦、赤小豆和小米里加入适量70 ℃的水，搅拌，先70 ℃保温20 min，然后100 ℃煮沸30 min。然后向糊化液里加入适量的常温水，加入粉碎好的大麦芽，搅拌均匀，按照总谷物原料质量的1.0‰添加中温淀粉酶，0.5‰添加中性蛋白酶，采用单醪升温浸出糖化法进行糖化[16]。
煮沸、过滤：糖化结束，过滤除渣后煮沸40 min。酒花按2.0 g/kg麦汁分2次添加，第一次初沸时，第二次是煮沸终了前10 min。煮沸结束，静置20 min，使用8层纱布分离酒花糟及热凝固物，并进行冷却，得到谷物混合液。
乳酸菌活化：按量称取适量干酵母，加入12°P麦芽汁培养基中置于摇床中，以28 ℃、120 r/min过夜培养。
乳酸菌活化采用MRS培养基[10]与12°P麦芽汁培养基按照1∶1混合，37 ℃静置过夜培养。副干酪乳杆菌和瑞士乳杆菌的接种比例为3∶2。
接种、发酵：把活化好的酵母菌和乳酸菌接入谷物混合液中，按照发酵温度进行发酵。待发酵液达到发酵指标要求后，降至4 ℃终止发酵，得到谷物发酵原液。终止前发酵指标以酸度为准，终止酸度为2.6 mL/100 mL。
调配：按谷物发酵原液添加50%，再添加反渗透（reverses osmosis，RO）水、三氯蔗糖、槐花蜜等进行调配，控制调配后酸度为1.10～1.40 mL/100 mL。
灭菌：在75 ℃条件下杀菌30 min。冷却后即得谷物发酵饮料。
1.3.2 单因素试验设计
原麦汁的浓度、接种量、发酵温度、摇床转速等是影响发酵饮料制备的重要因素[17-18]。以感官分值作为评价指标，分别考察酵母接种量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）、乳酸菌接种量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、发酵温度（13 ℃、20 ℃、27 ℃、34 ℃、41 ℃）、原麦汁浓度（4°P、6°P、8°P、10°P、12°P）和摇床转速（0、50 r/min、100 r/min、150 r/min、200 r/min）对谷物发酵饮料品质的影响。
1.3.3 响应面试验设计及验证
根据单因素试验结果，选取酵母接种量、乳酸菌接种量、发酵温度作为考察因素进行下一步试验。采用Box-Benhnken试验设计，试验因素与水平见表1。
表1 Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design
1.3.4 产品分析及指标测定方法
（1）感官评价
在评价前准备好发酵样品。每次评估选择8名训练有素的专业人员和6名普通消费者。每轮只品评6个样品，每次品评的时间最长为30 min。谷物发酵饮料的感官评价标准见表2。
表2 谷物发酵饮料的感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of fermented grain beverage
（2）理化指标
酸度的测定按照国标GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》中的方法；酒精度的测定采用酒精分析仪；糖度测定采用阿贝折射仪。
1.3.5 数据分析
所有试验组均设计平行试验组，采用Design-Expert 10.0.3进行统计分析。得出最大感官评分值的预测值和相应的各因素的编码值，并进行验证试验，以确定混合发酵制备谷物发酵饮料的最佳工艺参数。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 乳酸菌接种量对谷物发酵饮料感官品质的影响
乳酸菌接种量对谷物发酵饮料感官评分的影响见图1。由图1可以看出，乳酸菌接种量在1.0%～2.5%范围内，感官分值随着乳酸菌接种量的增加而逐渐升高；乳酸菌接种量＞2.5%之后，感官分值随着乳酸菌接种量的增加而降低。当乳酸菌接种量为1.0%、1.5%、2.0%时，发酵的时间要长于2.5%的接种量，导致产品的醇厚感较重，因此感官分值偏低；当乳酸菌接种量为3.0%时，发酵又太快，导致样品除了酸味之外其他风味不足，因而影响感官分值。因此，乳酸菌接种量初步选择为2.5%。
图1 乳酸菌接种量对谷物发酵饮料感官品质的影响
Fig.1 Effect of lactic acid bacteria inoculum on sensory quality of fermented grain beverage
2.1.2 酵母接种量对谷物发酵饮料感官分值的影响
酵母接种量对谷物发酵饮料感官品质的影响见图2。由图2可以看出，在一定范围内，感官分值随着酵母接种量的增加先升高，然后再逐渐降低。酵母接种量为0.5%时感官分值最高，酵母接种量太低口味比较寡淡，酵母接种量太高醇厚感太重。因此，酵母接种量初步选择为0.5%。
图2 酵母接种量对谷物发酵饮料感官品质的影响
Fig.2 Effect of yeast inoculum on sensory quality of fermented grain beverage
2.1.3 发酵温度对谷物发酵饮料感官品质的影响
发酵温度对谷物发酵饮料感官品质的影响见图3。由图3可以看出，当发酵温度为13～41 ℃时，感官分值随着发酵温度的升高先逐渐升高，然后再降低。当发酵温度为34 ℃时，口感风味等较其他温度更好，感官分值最高。因此，发酵温度初步选择为34 ℃。
图3 发酵温度对谷物发酵饮料感官品质的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on sensory quality of fermented grain beverage
2.1.4 原麦汁浓度对谷物发酵饮料感官品质的影响
原麦汁浓度对谷物发酵饮料感官品质的影响见图4。由图4可以看出，当原麦汁浓度为4～8°P时，感官分值随着原麦汁浓度的增加先逐渐升高；当原麦汁浓度为8～12°P时，感官分值随着原麦汁浓度的增加略有增加，趋于平稳。因此，原麦汁浓度初步选择为8°P。
图4 原麦汁浓度对谷物发酵饮料感官品质的影响
Fig.4 Effect of original wort concentration on sensory quality of fermented grain beverage
2.1.5 摇床转速对谷物发酵饮料感官分值的影响
摇床转速对谷物发酵饮料感官品质的影响见图5。由图5可以看出，当摇床转速在0～200 r/min时，感官分值随着摇床转速的升高而逐渐降低。摇床转速为0 r/min时，感官分值最高，此时香味较浓，回味时间长且没有其他杂味；其他转速香味均较弱，且有杂味。因此选择静置发酵。
图5 摇床转速对谷物发酵饮料感官品质的影响
Fig.5 Effect of rotational speed on sensory quality of fermented grain beverage
2.2 响应面试验结果
以乳酸菌接种量（X1）、发酵温度（X2）和酵母接种量（X3）为影响因素，发酵产品感官分值（Y）为响应值，使用Design-Expert 10.0.3设计3因素3水平Box-Benhnken试验，试验设计及结果见表3。
把表3的试验结果输入Design-Expert 10.0.3软件中，对试验数据进行多元回归拟合，建立二次回归模型，得到乳酸接种量（X1）、发酵温度（X2）和酵母接种量（X3）与发酵产品感官分值Y的回归方程。获得回归方程为：Y=+90.20+1.88X1+2.50X2+2.38X3+0.50X1X2+2.25X1X3+0.00X2X3-62.23X12-1.98X22-3.72X32
表3 谷物发酵饮料工艺优化的Box-Behnken试验设计及结果
Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments of fermented grain beverage process optimization
由表4可知，该模型具有显著性（P=0.003 4），失拟项不显著（P=0.303 0）。决定系数R2为0.925 8，调整决定系数R2adj为0.830 4，表明回归模型显著，拟合程度高，回归方程可用于确定最优感官评分的发酵产品。对回归方程的系数进行显著性检验，结果表明对发酵产品感官评分的影响顺序为：发酵温度＞酵母接种量＞乳酸菌接种量。X1、X2、X3、X1X3、X12、X22和X32对结果的影响显著（P＜0.05）。
表4 回归模型的方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.05）。
通过分别对各个自变量求极值，得到极值点。即在乳酸菌接种量为3.28%，发酵温度为37.66 ℃，酵母菌接种量为0.72%时，感官分值取得最大理论值为92.51分。各因素交互作用对谷物发酵饮料感官分值影响的响应面与等高线如图6所示，能够直观的看出乳酸菌接种量，发酵温度，酵母接种量两两之间的交互作用都很明显[19-20]。
图6 发酵温度、酵母接种量、乳酸菌接种量交互作用对谷物发酵饮料感官分值影响的响应面与等高线
Fig.6 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between fermentation temperature,yeast and lactic acid bacteria inoculum on the sensory score of fermented grain beverage
为了便于实际操作，将最佳工艺条件修正为乳酸菌接种量为3.3%，发酵温度为38 ℃，酵母菌接种量为0.7%，对此最佳条件进行了三角瓶和10 L发酵罐各3次平行验证试验，感官评分实际值分别为91.7分、92.7分，与预测值92.51分结果基本吻合，产品的酒精度＜0.5%vol。更加验证了此模型的可行性。
2.3 调配
发酵原液添加量为50%，加入三氯蔗糖和槐花蜜进行调配。对调配后的样品进行感品评，结果表明，当三氯蔗糖、槐花蜜添加量分别为0.025%、5%时感官分值最高，为97分。样品发酵风味较好，口感顺滑厚重，无异味。
3 结论
以大麦芽、小米、赤小豆、燕麦为谷物原料，酵母菌和乳酸菌为发酵菌种一步混合发酵来制备谷物发酵饮料。先通过单因素试验对谷物发酵饮料制备工艺进行了优化，获得了初步工艺参数，筛选出了乳酸菌接种量、发酵温度、酵母接种量三个主要影响因素，再通过响应面法进一步优化。优化后的制备工艺为采用静置发酵，发酵温度38 ℃，乳酸菌接种量3.3%，酵母菌接种量0.7%，原麦汁浓度8°P；添加发酵液50%，三氯蔗糖0.025%，槐花蜜5%制得的产品感官评分为97分，酒精度为0.12%vol，接受度较高，具有记忆点，可推广应用。
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