葡萄酒因营养价值而被人们所喜爱，其中含有丰富的氨基酸、果胶、维生素等营养物质，还含有锌、硒等多种微量元素和植物源抗氧化剂[1-7]。在国内市场，葡萄酒品质参差不齐，导致价格也有高有低，所以很多葡萄酒爱好者更倾向于自己酿制。自酿葡萄酒的工艺相对比较简单，个人可以根据自身的喜好对口感（如酸甜度等）进行适当的调节，自酿葡萄酒的一般制作方法：选葡萄-清洗-捣碎-装罐-加酵母-加白糖-发酵-纱布过滤-勾兑与调配-贮存。
甲醇是饮料酒中的有害成分，是一种神经性毒物，在体内的代谢产物为甲酸、甲醛，甲醛的毒性更强，能引发视神经萎缩，导致失明[8-10]。GB/T 15037—2006《葡萄酒》[11]对红葡萄酒中甲醇限量有明确要求，含量≤400 mg/L；白、桃红葡萄酒含量则要求≤250 mg/L。
一般正规的葡萄酒厂有健全的设备，也有相关的安全质量标准，对甲醇的限量把关严格，很少出现安全事故。而大多数家庭自酿葡萄酒过程简单，也没有除去甲醇的工艺，有时会发生因喝自酿葡萄酒中毒的新闻，其中最多的是酒中甲醇超标引起的中毒事件，所以在自酿过程中如何有效地控制甲醇含量在安全范围已成为亟需解决的问题。目前国内外，对自酿葡萄酒甲醇含量测定及影响葡萄酒口感工艺研究报道甚多[12-18]，而对其中甲醇含量控制研究鲜见。
本研究围绕发酵容器、发酵温度、陈酿时间等多个简单可行的环节来控制自酿葡萄酒中甲醇的产生，结合气相色谱法检测，在保证葡萄酒口感品质前提下，通过优化工艺条件以达到降低酒中甲醇含量的目的，从而为自酿族们提供科学的技术指导，从而达到为自酿葡萄酒质量安全提供保障的目的。
1 材料与方法
1.1 材料
葡萄：常见品种刺葡萄；甲醇（纯度≥99%）、叔戊醇（内标）（纯度≥99%）：上海安谱实验科技股份有限公司；酒曲（酿酒酵母＋米根霉）：湖南省永鑫酒曲有限公司。
1.2 仪器与设备
7890A气相色谱仪：美国安捷伦公司；RTX-WAX毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：北京科益恒达科技有限公司。圆柱形塑料材质发酵器、圆柱形橡木材质发酵器、圆柱形陶瓷材质发酵器、圆柱形玻璃材质发酵器（4种发酵容器容积均在3 L左右，高度约为30 cm）。
1.3 方法
1.3.1 酿制工艺[19-21]
选取果面干净带粉的葡萄3份，每份1.0 kg，分别用凉开水轻轻冲洗之后铺开晾干，将葡萄去柄捏破装入发酵罐，按照1∶10比例加入白糖并搅拌均匀，添加一定量酿酒酵母。由于葡萄经由酵母发酵，在此工程中会产生大量的二氧化碳气体，如葡萄盛装的过满，就会导致葡萄酒从玻璃瓶中溢出，因此，发酵瓶罐不宜装得过满，需留出约1/3空间，最后盖上瓶盖在一定温度条件下进行发酵酿造。
1.3.2 单因素试验
以甲醇含量为依据，分别考察发酵容器（塑料发酵容器、木质发酵容器、陶瓷发酵容器、玻璃发酵容器）、酿酒酵母添加量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、发酵温度（环境）（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃）、发酵时间（10 d、15 d、20 d、25 d、30 d）、陈酿温度（环境）（10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃）、陈酿时间（30 d、60 d、90 d、120 d、150 d）对葡萄酒中甲醇产生的影响。
1.3.3 响应面优化试验设计
依据单因素试验结果，选择发酵温度（A）、发酵时间（B）、陈酿时间（C）为自变量，以甲醇含量（Y）为响应值，进行响应面优化试验，响应面试验因素与水平见表1。
表1 自酿葡萄酒发酵条件优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface methodology for fermentation technology optimization of home-brewed wine
1.3.4 测定方法
甲醇含量：参考GB 5009.266—2016《食品安全国家标准食品中甲醇的测定》进行检测[22]。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 不同发酵容器材质对自酿葡萄酒甲醇含量的影响
由图1可知，选择采用木质发酵容器酒中甲醇含量最低，可能与木材对甲醇有一定吸附作用有关，而采用塑料作为发酵容器，酒中甲醇含量最高，已超过标准限量规定（400 mg/L）。塑料材质中可能存在一定量的有机溶剂残留（如甲醇等），微生物发酵过程释放热量，会加速塑料中甲醇的释放，从而导致甲醇含量超标。因此，选择木质发酵容器对甲醇含量控制效果要比其他3类要更合适。
图1 不同发酵容器材质对自酿葡萄酒甲醇含量的影响
Fig.1 Effect of different fermentation containers on methanol contents of home-brewed wine
2.1.2 酿酒酵母添加量对自酿葡萄酒甲醇含量的影响
由图2可知，随着酵母添加量的增加，自酿葡萄酒中的甲醇含量呈先降低后升高的趋势，酿酒酵母添加量为1.0%时，得到的葡萄酒中甲醇含量最低，含量为298 mg/L。当酿酒酵母添加过少时，葡萄酒发酵过程较缓慢，这会容易引起杂菌的生长，发酵所产生的甲醇含量虽不高，但会导致葡萄酒的果香和酒香香气淡薄，风味也不够协调；而当酿酒酵母添加过大时，甲醇含量也变化较小，这是由于酵母菌为了生存而竞争营养物质，从而导致酵母菌的发酵受到抑制，酒精产生量少，杂菌加速繁殖，酸味与苦涩味变得更加突出，葡萄酒的果香和酒香香味变得淡薄。故最佳酵母菌接种量为1.0%左右。由于在整个发酵工艺优化过程中酵母添加量对葡萄酒中甲醇含量的影响较其他因素而言并不明显，故而酵母添加量在响应面试验中不作为考察对象。
图2 酿酒酵母添加量对自酿葡萄酒甲醇含量的影响
Fig.2 Effect of Saccharomyces cerevisiae addition on methanol contents of home-brewed wine
2.1.3 发酵温度对自酿葡萄酒甲醇含量的影响
由图3可知，随着发酵温度的升高，自酿葡萄酒中的甲醇含量呈先降低后升高的趋势，在发酵温度25 ℃时，甲醇含量最低，为288 mg/L。因此，选择自酿葡萄酒发酵温度为25 ℃比较合适。
图3 发酵温度对自酿葡萄酒甲醇含量的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on methanol contents of home-brewed wine
2.1.4 发酵时间对自酿葡萄酒甲醇含量的影响
由图4可知，随着发酵时间的延长，自酿葡萄酒中的甲醇含量呈先降低后升高的趋势，在发酵时间为20 d时，甲醇含量最低，为285 mg/L。因此，选择自酿葡萄酒发酵时间为20 d比较合适。
图4 发酵时间对自酿葡萄酒甲醇含量的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on methanol contents of home-brewed wine
2.1.5 陈酿温度对自酿葡萄酒甲醇含量的影响
由图5可知，在陈酿温度为20 ℃时，葡萄酒中甲醇含量最低，为292 mg/L。而陈酿温度过高却会影响到葡萄酒口感及风味，因此，选择自酿葡萄酒陈酿温度为20 ℃比较合适。由于在整个工艺优化过程中陈酿温度对葡萄酒中甲醇含量的影响较其他因素而言并不明显，故而陈酿温度在响应面试验中不作为考察对象。
图5 陈酿温度对自酿葡萄酒甲醇含量的影响
Fig.5 Effect of aging temperature on methanol contents of home-brewed wine
2.1.6 陈酿时间对自酿葡萄酒甲醇含量的影响
自酿葡萄酒发酵结束后，经倒灌过滤后得到滤液，经过一定时间陈酿，不仅加速了酒中杂醇类物质的分解，而且提升了葡萄酒的口感，特别是经过橡木桶陈酿之后，葡萄酒的色泽不但有所改善，而且减少了酒的青涩味，增强了酒体结构。同时，通过一定时间陈酿，自酿葡萄酒中甲醇含量会有所降低，由图6可知，随着陈酿时间延长，葡萄酒中甲醇含量逐渐减小，陈酿90 d时，自酿葡萄酒中甲醇含量为250 mg/L，继续延长陈酿时间，甲醇含量变化不大；此时远远小于标准规定的400 mg/L，因此，选择自酿葡萄酒陈酿时间为90 d比较合适。
图6 陈酿时间对自酿葡萄酒甲醇含量的影响
Fig.6 Effect of aging time on methanol contents of home-brewed wine
2.2 响应面优化葡萄酒工艺试验结果及分析
2.2.1 数字模型的建立及分析
结合单因素试验所获结果，进一步优化自酿葡萄酒工艺条件。选取发酵温度（A），发酵时间（B），陈酿时间（C）3个因素作为影响因子，以甲醇含量（Y）为响应值，设计3因素3水平响应面试验，Box-Behnken试验结果见表3。
由Design Expert 8.0.6软件统计计算，对表2的试验结果进行多元回归拟合，得到各因素水平对自酿葡萄酒中甲醇含量影响的二次多项回归模型：Y=283.20+9.25A+0.13B+2.13C-2.50AB-6.00AC-1.75BC+29.22A2+4.98B2+4.22C2。
表2 自酿葡萄酒发酵条件优化Box-Behnken试验设计及结果
Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for fermentation technology optimization of home-brewed wine
由表3 可知，上述建立的回归模型极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P=0.504 3＞0.05）。表明自酿葡萄酒工艺数据模型的选取具有一定的科学性与合理性；模型的决定系数R2为0.967 9，校正决定系数R2Adj为0.926 7，则表明该模型与试验的结果拟合度良好，因此可用此模型对基于甲醇含量控制的自酿葡萄酒工艺参数进行分析和预测。根据表3中F值大小可以判断，3个因素对自酿葡萄酒中甲醇含量的影响大小顺序为发酵温度＞陈酿时间＞发酵时间，其中一次项A达极显著水平（P＜0.01），交互项AC达显著水平（P＜0.05），二次项A2、B2对自酿葡萄酒中甲醇含量的影响也达到显著水平（P＜0.05）。综合所有数据结果表明，该模型能较好地反映出自酿葡萄酒工艺中发酵温度、发酵时间、陈酿时间3者之间的关系，所得的回归方程能较好地预测自酿葡萄酒工艺中甲醇含量在不同条件下的变化规律。
表3 以甲醇含量为响应值回归模型的方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model based on methanol content as response value
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
2.2.2 影响因子间交互作用分析
通过采用Design-Expert.V 8.0.6软件绘制自酿葡萄酒工艺的响应面图与等高线图，可以较直观地反映出各因素及其相互作用对试验结果的影响。响应面图的曲面弯曲程度越大，则表明两因素间的交互作用越显著。
由图7可直观地反映出自酿葡萄酒工艺中的发酵温度、发酵时间、陈酿时间之间的交互作用对其中甲醇含量的影响程度。发酵温度和陈酿时间的交互作用对自酿葡萄酒中甲醇含量的影响显著（P＜0.05），其余因素间交互作用影响不显著（P＞0.05），这与方差分析结果一致。
图7 发酵温度、发酵时间、陈酿时间交互作用对甲醇含量影响的响应面及等高线
Fig.7 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between fermentation temperature,time and aging time on methanol content
2.3 针对自酿葡萄酒工艺的验证
通过软件分析所建立的发酵工艺模型，得到自酿葡萄酒最佳工艺条件为发酵温度24.04 ℃，发酵时间19.16 d，陈酿时间为80.97 d。为便于实际操作及工艺条件的可行性，将最佳工艺参数修正为发酵温度24 ℃，发酵时间19 d，陈酿时间为81 d。在此工艺条件下进行3 组平行试验进行验证，计算得到甲醇含量实际值为281 mg/L，与预测值279 mg/L相近，说明本试验的回归模型方程具有一定的实际指导意义。
2.4 产品质量指标
应用响应面优化后的最佳条件所得自酿葡萄酒，检测得到其各项指标为：酒精度（温度为20 ℃时）为13.5%vol；总糖为58.7 g/L；干浸出物为29.8 g/L；挥发酸（以乙酸计）为0.6 g/L；柠檬酸为0.9 g/L。产品各项指标均符合国家标准GB/T 15037—2006《葡萄酒》要求。
3 结论
本研究在单因素试验的基础上，选取对自酿葡萄酒甲醇含量影响较大的3个因素，对酿造工艺进行响应面优化试验。最终确定自酿葡萄酒工艺的最优参数为选择木质发酵容器发酵，酒曲添加量1.0%，发酵温度24 ℃，发酵时间19 d，陈酿温度20 ℃，陈酿时间81 d，在此工艺条件下制得的葡萄酒呈现紫红色，清亮透明，无显见悬浮物，具有和谐纯正的果香味，口感较纯正、舒畅及完整，回味悠长，具备葡萄酒的良好风格，甲醇含量为281 mg/L。因此，本研究得出的最优控制甲醇含量的葡萄酒酿造工艺具有较好的实际应用价值，对提高自酿葡萄酒质量安全有重要的实际意义。
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