幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是唯一能栖息于人胃内的微生物，而Hp感染是诱发消化性溃疡、胃癌等的重要原因之一[1-2]。在中国，Hp感染的患病率很高（约60%），而Hp对抗生素的高耐药率导致抗生素和质子泵抑制剂对其治疗效果不佳[3]。
受传统习俗和文化的影响，在中国，饮酒是一种普遍行为。据2002年全国营养与健康调查结果显示，我国15岁以上居民男性饮酒比例为39.6%，女性为4.5%[4]。文献报道，白酒中富含生物活性成分，如酱香型白酒中已鉴定的生物活性成分有500多种[5]。研究表明，乙醇摄入与Hp感染具有一定的关系，而白酒含有的生物活性成分是否具有抑制Hp感染作用的相关报道很少[6]，川芎嗪又称四甲基吡嗪，在酱香型白酒中广泛分布，主要具有杀菌抗癌、抗炎、改变微循环、制止血栓形成等功效[7-8]。而研究显示酱香型白酒中含有的风味物质中，吡嗪类化合物（pyrazines，PYRs）占有极大的比例[5]。因此，本实验利用反转录-聚合酶链式反应（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）分析PYRs对Hp基因及相关毒力蛋白表达的影响，检测PYRs预处理Hp对胃黏膜上皮细胞（GES-1）活性、细胞凋亡的影响，对吡嗪类物质抗Hp活性及减轻Hp对胃黏膜上皮细胞的损伤活性进行研究，旨在揭示吡嗪类化合物抗幽门螺杆菌活性及机制。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
SydneyStrain 1（SS1）幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）标准菌株：深圳大学医学院病原微生物系惠赠。胃上皮GES-1细胞株：美国ATCC公司；胎牛血清（fetalbovine serum，FBS）：美国Hyclone公司；青-链霉素、RPMI 1640培养基：美国Hy-Clone公司；磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）：广州瑞舒生物科技有限公司；一氧化氮（NO）、前列腺素（prostaglandin，PG）E2、肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）1β、白细胞介素-6（IL-6）、细胞计数试剂盒（cellcountingkit，CCK）-8、酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等试剂盒：四正柏生物科技有限公司；Cag A和VacA抗体：美国Santa Cruz Biotechnology公司；哥伦比亚琼脂、布氏肉汤培养基：英国Oxoid公司。酱香型白酒（Moutai-flavourliquor，MTL）：市售。酱香型白酒中生物活性成分（酱香型白酒中含有的非乙醇类化合物的总称）（BMC）、酱香型白酒中吡嗪类化合物（PYRs）：阿拉丁试剂有限公司[5]。
1.2 仪器与设备
三菱C-31厌氧培养盒：日本三菱集团；DHP系列恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；ACB-4A1型超净化工作台：上海实验仪器厂；SW-CJ-IC型超净工作台：苏州安泰科技有限公司；INC108型CO2培养箱：德国Memmert公司；TECAN infinite M200型多功能酶标仪：瑞士Tecan Trading AG公司；2K15型低温高速离心机：美国Sigma公司；CFX96型PCR仪：美国Bio-Rad公司。
1.3 方法
1.3.1 PYRs细胞毒性检测
胃上皮GES-1细胞接种于96孔板中（5 000 cells/孔），分别加入质量浓度为3.12 mg/mL、0.625 mg/mL、0.125 mg/mL、0.025 mg/mL、0.005 mg/mL、0.001 mg/mL 的BMC、MLT 及PYRs溶液，培养24 h、48 h，CCK-8法检测细胞活力。
1.3.2 体外抑菌实验
将冻存的Hp复苏，接种于哥伦比亚琼脂固体培养基，置于37 ℃微需氧环境（体积分数为5%的O2，体积分数为10%的CO2，体积分数为85%的N2）中培养。72 h后转至布氏肉汤液体培养基，置于37 ℃微需氧环境，在100 r/min的摇床上振荡，扩大培养。取用Hp时，将培养3 d的Hp菌株挑起一部分，用无菌生理盐水洗下后，配成布氏肉汤菌悬液，再用标准比浊管比浊，校正菌液浓度，使其菌液浓度相当于1×108 CFU/mL[9]。
在37 ℃微需氧条件下培养72 h后PYRs对Hp的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）进行检测[10]。
1.3.3 RT-PCR检测Hp毒力基因表达的变化
溶解BMC、MTL及PYR-19（2,5-二甲基-3-正戊基吡嗪）于PBS至终质量浓度为0.125 mg/mL；将培养的Hp菌液用PBS重悬至1×107 CFU/mL，取含0.1 mL Hp的PBS混悬液加入配制好的BMC、MTL及PYRs溶液中，37 ℃振荡微氧孵育72 h，离心弃上清，用PBS冲洗3次后，使用核糖核酸（ribose nucleic acid，RNA）prep pure Cell/BMCteria Kit（TianGen公司，中国）分离总RNA。互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleicacid，cDNA）的合成按试剂盒（SYBR@Prime ScriptTMRT-PCRKit）操作说明进行。引物如表1所示。
表1 幽门螺杆菌毒力基因（Cag A、Vac A和Bab A）的引物序列
Table 1 Primer sequences of virulence genes (Cag A, Vac A and Bab A) of Helicobacter pylori
1.3.4 Western blotting检测
用PBS作为溶剂溶解BMC、MTL及PYR-19至终浓度为0.125 mg/mL。将培养的Hp菌液用PBS重悬至1×107CFU/mL，取含0.1 mL Hp的PBS混悬液加入配制好的BMC、MTL及PYR-19溶液中，37 ℃振荡微氧孵育72 h，离心弃上清，用PBS冲洗3次后，按细菌蛋白提取试剂盒（Solarbio公司，中国）说明提取细菌总蛋白，Western blotting检测细胞毒素A（Cag A）和空泡毒素A（Vac A）的蛋白表达情况[11]。
1.3.5 细胞活性及凋亡的检测
用PBS作为溶剂溶解BMC、MTL及PYR-19至终浓度为0.125 mg/mL。将培养的Hp菌液用PBS重悬至1×107CFU/mL，取含0.1 mL Hp的PBS混悬液加入配制好的BMC、MTL及PYR-19溶液中，37 ℃振荡摇菌24 h。收集细菌，PBS洗2次，调节细菌终浓度为1×107 CFU/mL。1×105 cells/mL胃上皮GES-1细胞铺于6孔板中培养24h。设置空白对照组（Control）；Hp损伤组（Hp）；加入BMC处理的Hp为BMC组（BMC）；加入MTL处理的Hp为MTL组（MTL）；加入PYR-19处理的Hp为PYR-19组（PYR-19）；使Hp与GES-1细胞比例为100∶1，GES-1细胞与Hp培养24 h后，收集细胞，PBS洗涤。
CCK-8试剂盒法检测GES-1细胞活性；收集包括上清液漂浮在内的全部细胞，1 000 r/min离心5 min，用预冷的PBS洗2次，按Annexin V-FITC/PI试剂盒使用说明流式细胞术检测细胞凋亡情况；ELISA试剂盒检测细胞中NO、PGE2、TNF-α、IL-1β及IL-6含量；Western blotting检测GES-1细胞i-NOS、COX-2的表达变化。
1.3.6 数据处理
所有数据采用GraphPad Prism 8软件进行统计。P＜0.05定为具有显著性差异，结果均以Mean±SEM表示；对样本先进行方差齐性检验，方差齐时，用One-Way ANOVA检验，并进行组间的多重比较；方差不齐时，用非参数秩和检验，先用Kruskal-WallisHtest 比较总的差异，再用Mann-Whitney U 进行两组之间比较。
2 结果与分析
2.1 BMC对GES-1细胞的毒性作用
为避免BMC及PYRs对GES-1细胞的细胞毒性，采用CCK-8法检测了BMC、MTL及PYRs对GES-1细胞活性的影响。实验结果显示，与空白对照组（Control）相比，当BMC、MTL及PYRs质量浓度低于0.125 mg/mL时，细胞活性均无显著性差异（24，48 h，P＞0.05），说明GES-1细胞未受到显著的损伤。
2.2 BMC抑制Hp增殖
由表2可知，BMC、MTL及PYRs具有一定的抑菌活性。其中，BMC、MTL、PYRs的抑菌90%细菌生长的最低浓度（90%minimal inhibitory concentration，MIC90）为592.7 μg/mL、655.9 μg/mL、（182.5～426.1）μg/mL，虽远高于阿莫西林及红霉素，但仍说明BMC、MTL及PYRs具有一定的抗Hp活性。吡嗪类化合物中，PYR-19（2,5-二甲基-3-正戊基吡嗪）抑制Hp增殖活性最强，其MIC90为182.5 μg/mL。
表2 吡嗪类化合物、生物活性成分和酱香型白酒体外抑菌活性
Table 2 In vitro antibacterial activity of pyrazines,bioactive components and Moutai-flavour liquor
PYR-19的抗Hp活性结果如图1所示。由图1可知，随着PYR-19质量浓度的增大及作用时间的延长，Hp的增殖能力被显著抑制。因此说明PYR-19对Hp的增殖抑制具有时间和剂量依赖性。
图1 吡嗪类化合物-19质量浓度（A）和作用时间（B）对抑制幽门螺杆菌增殖能力的影响
Fig.1 Effect of pyrazines-19 mass concentration (A) and reaction time(B) on inhibiting Helicobacter pylori proliferation
2.3 PYR-19降低Hp损伤GES-1细胞能力
PYR-19对Hp损伤GES-1细胞能力的影响结果如图2所示。由图2可知，与空白对照组相比，Hp组中细胞活力下降16.9%（P＜0.05），说明Hp感染会损伤GES-1细胞，使细胞活力降低；PYR-19、BMC及MTL组中细胞活力比Hp组分别高8.48%（P＜0.05）、6.81%（P＜0.05）、3.85%，说明BMC、MTL及PYR-19处理Hp能够降低其对GES-1细胞的损伤能力。
图2 BMC、MTL、吡嗪类化合物-19对幽门螺杆菌损伤GES-1细胞能力的影响
Fig.2 Effect of BMC,MTL and pyrazines-19 on the ability of Helicobacter pylori to damage GES-1 cells
PYR-19抑制Hp诱导GES-1细胞凋亡能力结果如图3所示。由图3可知，与空白对照组（2.96±0.31）%相比，Hp组中GES-1细胞总凋亡率增加18.4%（P＜0.05），说明Hp感染会损伤GES-1细胞进而导致细胞凋亡增加。而PYR-19、BMC及MTL组中GES-1细胞凋亡率比Hp低11.6%（P＜0.05）、10.4%（P＜0.05）、4.80%（P＜0.05），说明BMC、PYR-19及MTL能够显著降低Hp对GES-1细胞的损伤，使Hp诱导的GES-1细胞凋亡被抑制。
图3 BMC、MTL、吡嗪类化合物-19对幽门螺杆菌诱导GES-1细胞凋亡能力的影响
Fig.3 Effect of BMC,MTL and pyrazines-19 on GES-1 cells apoptosis induced by Helicobacter pylori
2.4 PYR-19抑制Hp对GES-1细胞的炎性损伤能力
研究报道，Hp感染会损伤胃黏膜细胞，诱发炎性细胞因子分泌[12]。而炎性细胞因子（如IL-1β、TNF-α和IL-6）的分泌与病毒、细菌及环境刺激因子暴露有着密切的关系。过量的炎性细胞因子分泌与诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）介导的NO生成与Hp感染诱发的胃肠道上皮细胞损伤具有密切的关系[13]。因此采用ELISA试剂盒检测方法检测培养基中炎性细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）的含量以评价PYR-19抑制Hp对GES-1细胞的损伤能力。
由图4A～图4C可知，与空白对照组相比，Hp显著诱导GES-1细胞IL-6、TNF-α和IL-1β的分泌，使GES-1细胞IL-6、TNF-α和IL-1β分泌增加832%（P＜0.05）、1 730%（P＜0.01）及801%（P＜0.01）；诱发细胞炎症反应，使炎性细胞因子分泌显著增加。BMC预处理后，与Hp组相比，IL-6、TNF-α和IL-1β分泌减少41.4%（P＜0.05），60.7%（P＜0.05），42.5%（P＜0.05）；PYR-19预处理后，与Hp组相比，IL-6、TNF-α和IL-1β分泌减少45.1%（P＜0.05），62.6%（P＜0.05），46.7%（P＜0.05）；说明PYR-19能够抑制Hp对GES-1细胞的炎性损伤能力。类似的，MTL处理对Hp显著诱导GES-1细胞IL-6、TNF-α和IL-1β的分泌也有一定的抑制作用，但抑制能力低于PYR-19及BMC。
图4 BMC、MTL、吡嗪类化合物-19对幽门螺杆菌抑制GES-1细胞炎症细胞因子分泌及蛋白表达的影响
Fig.4 Effect of BMC,MTL and pyrazines-19 on inhibiting inflammatory cytokines secretion and protein expression of GES-1 cells by Helicobacter pylori
A，PYR-19对Hp诱导的IL-6分泌的影响；B，PYR-19对Hp诱导的TNF-α分泌的影响；C，PYR-19对Hp诱导的IL-1β分泌的影响；D，PYR-19对Hp诱导的NO及PGE2分泌的影响；E、F，PYR-19对Hp诱导的iNOS及COX-2表达的影响及量化
炎症是由多种分子机制介导的复杂过程，其中包括诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）这两个重要分子以及它们所生成的一氧化氮（NO）和前列腺素E2（prostaglandin2，PGE2）的参与[14-15]。由图4D可知，Hp显著诱导了GES-1细胞NO和PGE2分泌。与Control组比，Hp组NO和PGE2分泌别增加983%（P＜0.01）及782%（P＜0.01）。与Hp组相比，BMC组NO和PGE2分泌减少50.2%（P＜0.05）、42.5%（P＜0.05）；PYR-19组NO和PGE2分泌分别减少60.8%（P＜0.05）、64.9%（P＜0.05）；说明BMC、PYR-19预处理可降低Hp对GES-1细胞的炎症损伤能力。类似的（图4E，F），与Hp显著诱导GES-1细胞iNOS、COX-2表达不同，BMC、PRY-19显著抑制了Hp对GES-1细胞诱导iNOS、COX-2表达能力。MTL处理对Hp显著诱导Hp对GES-1细胞诱导iNOS、COX-2表达也有一定的抑制作用，但抑制能力低于PYR-19及BMC。
2.5 PYR-19抑制Hp毒力基因及蛋白的表达
Bab A是Hp外膜蛋白基因，Bab A蛋白可特异性结合宿主细胞受体，赋予Hp持久定植能力[16]；高毒力的Hp菌株多具有细胞毒素相关基因（Cag A），Cag A蛋白可参与转运及宿主炎症反应[17]；空泡细胞毒素A（Vac A）能够破坏宿主细胞内吞作用、抑制免疫细胞导致免疫耐受和慢性感染等[18]。通过检测Hp Bab A、Cag A及Vac A基因转录及蛋白表达以评价BMC预处理对抑制作用。
RT-PCR检测PYR-19预处理对Hp膜蛋白基因Bab A、细胞毒素基因A（Cag A）和空泡毒素基因A（Vac A）基因转录的影响，结果如图5A所示，BMC、MTL及PYR-19预处理能够抑制Hp中Bab A、Cag A及Vac A的转录。其中，PYR-19及BMC预处理对Bab A、Cag A及Vac A基因的抑制作用高于MTL组。相比于Hp未处理组，PYR-19预处理后，Bab A、Cag A及Vac A基因转录下降73.2%（P＜0.01）、48.3%（P＜0.05）、73.8%（P＜0.01）；而BMC组，Bab A、Cag A及Vac A基因表达下降66.7%（P＜0.05）、30.8%（P＜0.05）、65.8%（P＜0.05）。因此推测BMC、PYR-19预处理可通过抑制Hp Bab A、Cag A及Vac A基因的转录，进一步抑制Bab A、Cag A及Vac A编码蛋白表达，从而抑制Hp对宿主细胞的黏附，减少其诱发炎症反应导致的宿主细胞损伤，减少Hp对GSE-1细胞的损伤能力[19-20]。
Western Blotting进一步分析PYR-19预处理对Hp Cag A和Vac A蛋白表达的影响，结果如图5B所示。与RT-PCR结果（图5A）类似，BMC、PYR-19预处理能够显著降低Hp中Cag A和Vac A的表达。说明BMC、PYR-19预处理可通过抑制Hp中相关毒力基因的转录及表达发挥抑制Hp对GES-1细胞的损伤活性。
图5 吡嗪类化合物-19抑制幽门螺杆菌毒力基因转录及毒力蛋白表达
Fig.5 Pyrazines-19 inhibiting virulence gene transcription of virulence protein expression of Helicobacter pylori
3 结论
研究发现Hp感染会损伤GES-1细胞，诱导GES-1细胞凋亡；Hp 感染GES-1 细胞会诱发细胞炎性细胞因子（IL-1β、TNF-α和IL-6）分泌。此外，Hp感染也会诱导GES-1细胞NO、PGE2分泌，过量细胞炎性细胞因子分泌会进一步损伤GES-1细胞，使细胞凋亡增加。PYR-19处理Hp后，GES-1细胞炎性细胞因子及NO、PGE2分泌显著减少，iNOS、COX-2表达减少，说明BMC、PYR-19处理抑制了Hp诱导GES-1细胞炎性损伤的能力。
在Hp感染小鼠的动物模型中，Cag A、Vac A阳性Hp菌株感染的胃黏膜炎症反应更显著，凋亡细胞数更多，提示Cag A、Vac A的表达对Hp损伤宿主细胞具有重要的作用。本实验发现酱香型白酒中的生物活性物质及吡嗪类物质可抑制Hp相关毒力基因Bab A、Vac A和Cag A的转录及Vac A、Cag A蛋白的表达，从而降低Hp诱导GES-1细胞炎性因子分泌，进而减少GES-1细胞凋亡。
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