中国白酒是世界上最古老的蒸馏酒之一。它通常由玉米、大米、小麦、豌豆、小米和高粱等谷物为原料，通过酒曲发酵，经蒸煮、糖化、蒸馏、贮存、勾兑而成[1]。许多研究表明，适度饮酒有助于身体健康[2-3]，但过量饮酒也会导致多种疾病[4-5]。世界卫生组织报告称，每年有300万人因滥用酒精而死亡[6]。白酒滥饮造成的伤亡和损失，通常被归咎于酒中的乙醇[7]。然而，白酒中除乙醇和水（约占98%～99%），还有小部分溶于酒中的醇类、酯类、酸类以及醛酮类等有机物（约占1%～2%），虽然这些风味化合物的浓度很低，但其种类、组成及比例决定着白酒的口感、风味[8-9]。PENEDA J等[10]指出，在相同的乙醇浓度下，酒精饮料比纯乙醇对人体肝脏组织造成的损害更大，因为乙醇及其同系物之间的相互作用增强了肝脏的氧化特性。此外，格绒泽仁等[11]通过对6款不同的浓香型白酒小鼠灌胃后的行为进行研究后，推断正丙醇和异戊醇是饮用浓香型白酒后导致行为障碍的关键高级醇。
乙醇代谢涉及两个过程：乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）将乙醇氧化成乙醛，然后乙醛脱氢酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）将乙醛氧化成乙酸[12]。由于乙醇、乙醛的积累会损害机体[13]，为增加乙醇脱氢酶或乙醛脱氢酶活性，提高人体乙醇代谢，许多研究人员正在研究某些天然化合物或非酒精饮料[14-16]。同时，白酒风味化合物对乙醇代谢的影响也逐渐引发关注。本研究以浓香型白酒为研究对象，通过气相色谱分析和体外酶学实验，以白酒中风味化合物的香气活力值为基础，探讨了4种不同浓香型白酒中的10种醇、酯类物质对ADH和ALDH活性的影响，为白酒风味化合物对乙醇代谢的影响提供了新的信息和研究模型。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
浓香型白酒（SC1：68%vol、SC2：48%vol、SC3：38%vol）：四川某酒厂；浓香型白酒（JS：40.8%vol）：江苏某酒厂；正丙醇、正戊醇、正丁醇、异戊醇、异丁醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯和己酸乙酯标准品（色谱纯）：天津精细化工研究所；乙醇脱氢酶（ADH）、乙醛脱氢酶（ALDH）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）：美国Sigma-Aldrich公司；乙醇、乙醛（色谱纯）：上海麦克林生化科技有限公司；焦磷酸钠、乙二胺四乙酸、吡唑、氢氧化钠、巯基乙醇（分析纯）：成都市科隆化学品有限公司。
1.2 仪器与设备
7900II型气相色谱仪：浙江福立分析仪器股份有限公司；（30 m×0.32 mm×1 μm）白酒专用色谱柱：四川知本分析科技有限公司；SQPPRACTUM224-1CN电子分析天平：赛多利斯科学仪器有限公司；N4紫外可见光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；PHS-2C笔式pH计：上海康仪仪器有限公司；DK-8D恒温水浴锅：上海跃进医疗器械有限公司；JB-2恒温磁力搅拌器：上海雷磁新泾仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 浓香型白酒的气相色谱分析
内标的制备：以60%vol乙醇溶液为基体溶液，分别配制体积分数2%的叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸内标溶液。
样品的制备：吸取10.00 mL白酒样品到比色管中，分别添加8.00 μL内标（叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸）溶液，充分混匀。
色谱条件：福立7900II型气相色谱仪上配有白酒专用色谱柱（30 m×0.32 mm×1 μm），检测器温度250 ℃，进样口温度250 ℃，柱流量为1.00 mL/min，分流比为1∶50。柱温为程序性升温，升温条件：烘箱温度最初为45 ℃，维持6 min，然后以6 ℃/min升温至65 ℃，维持7 min，再以15 ℃/min升温至200 ℃，维持6 min，最后以15 ℃/min升温至210 ℃，维持10 min。
4种浓香型白酒均按照以上条件及方法进行气相色谱分析，获得4种白酒中风味物质的种类和含量。
1.3.2 数据分析
定性分析：叔戊醇作内标用于醇类的分析；乙酸正戊酯作内标用于酯类及醛酮类组分的分析；2-乙基丁酸作内标用于乙酸后流出的高沸点组分及乳酸乙酯的分析。根据各组分与标样的保留时间作为定性的主要因素。
定量分析：采用内标法计算。香气活力值=风味物质的含量/风味物质的阈值。
1.3.3 体外酶学实验
酒样预处理：将10种风味化合物单体分别添加到4种浓香型白酒中，充分振荡摇匀，风味化合物的添加量为1%（V/V），根据国家对血液酒精含量（blood alcohol concentration，BAC）的相关规定，实验前将添加风味化合物的白酒稀释至酒精度为0.1%vol。
乙醇脱氢酶活性的测定：将1.7 mL 0.1 mol/L焦磷酸盐缓冲液（pH 8.8），0.1 mL 1.25 U/mL乙醇脱氢酶和0.1 mL样品在30 ℃条件下混合，并加入1.0 mL 5 mmol/L NAD+启动反应。为了绘制曲线，在15 min内，测定反应体系OD340nm值。每组实验重复3次。将无乙醇时的吸光度值设定为空白。
乙醛脱氢酶活性的测定：30 ℃条件下将1.4 mL 0.1 mol/L焦磷酸缓冲液（pH 9.0）、0.1 mL 0.8 U/mL乙醛脱氢酶、0.1 mL 0.1 mol/L乙醛、0.1 mL 0.01 mol/L吡唑、0.1 mL 3 mol/L氯化钾、0.1 mL 0.5 mol/L乙二胺四乙酸、0.05 mL 1 mol/L 2-巯基乙醇和0.1 mL样品混合，加入1.0 mL 3.6 mmol/L NAD+引发反应。最后，在15 min内，测量反应体系OD340nm值。每组实验重复3次，按照下式计算酶活性抑制率：
式中：OD实验组为浓香型白酒中加入某种风味物质单体后的体系吸光度值；OD对照组为浓香型白酒的体系吸光度值；OD空白组为无乙醇时的体系吸光度值。
2 结果与分析
2.1 不同酒样风味化合物香气活力值分析
不同白酒的独特香味的形成离不开酒中酯类、醇类、酸类以及其他的香味物质的作用，通过香气活力值（odor activityvalue，OAV），可以比较各香味物质的呈香能力，OAV值大则表明该物质对酒的呈香贡献较大，反之则说明该物质对酒的呈香贡献相对较小，从而评估各风味化合物对酒的风味形成的贡献程度[17]。根据气相色谱法对4种浓香型白酒的定性、定量分析，结果如表1所示。
表1 气相色谱分析4种浓香型白酒中风味化合物的含量及种类
Table 1 Contents and kinds of flavor compounds in four varieties of strong-flavor Baijiu by gas chromatography
续表
由表1可知，4种酒样共检测出醇类9种，酯类9种，酸类7种，醛、酮及杂环类5种，其中酒样SC3的风味化合物种类、总酯含量以及高级醇含量都低于其他3种酒样，酒样SC1中总酯含量和高级醇含量最高。
对风味物质的OAV值进行计算，结果如表2所示。
由表2可知，酯类物质的OAV值普遍高于酸类物质的OAV值和醇类物质的OAV值，其中己酸乙酯的含量和OAV值都最高，OAV＞7 000。此外，戊酸乙酯和丁酸乙酯的OAV值也远远高于其他风味物质，在4种酒样中均在800以上；酸类物质中己酸的OAV值较高；醇类物质中OAV值较高的是正丁醇，过量的杂醇油是酒中苦味的主要来源，其中正丁醇极苦[21]。
表2 4种浓香型白酒中风味物质的香气活力值
Table 2 Odor activity value of flavor compounds in four varieties of strong-flavor Baijiu
注：a风味物质序号同表1。b风味物质的香气活性值（OAV）由含量（见表1）与对应气味阈值计算得来。c气味阈值由参考文献得来[18-20]。
由气相色谱分析和OAV值可知，酯类物质在4种浓香型白酒中具有较高含量和OAV值，这表明，酯类化合物对这4种酒的香味形成有重要贡献，是酒中关键的香气成分组成。而己酸可以通过酯化作用形成浓香型白酒的主体香己酸乙酯[22]；其次，醇类物质是酒中的助香物质，具有衬托酯香的作用，但酒中醇类含量过高，不仅会影响口感，还会导致酒后头疼，出现饮后“上头”现象[23]。因此，鉴于以上原因，研究主要以4种浓香型白酒中香气贡献较大的酯类物质和醇类物质为研究对象。
2.2 体外酶学实验分析
酯类和醇类是白酒中必不可少的风味物质，但酒中过量的酯类和醇类不利于人体健康。为了减少醇类物质带来的不利，许多降解酒中醇类的方法被陆续报道出来，如HAN Q等[24]从苹果皮中提取了能降解酒中醇类物质的酶。然而，关于降低酯类物质的报道较少。作为自然酿造及固态蒸馏得到的白酒，这些微量成分的存在及其相对比例对酒固有风味的贡献是不可缺少的。
本研究以常规的浓香型白酒作为对照，通过体外酶学实验初步测定了浓香型白酒中的代表性酯类和醇类物质对ADH和ALDH活性的影响，结果如图1所示。
由图1可知，向白酒中加入风味化合物后，除乳酸乙酯以外，所有风味化合物均抑制ADH的活性，且它们在不同的白酒中有不同的抑制率。大多数风味化合物的抑制率在20%以下，而SC1中正戊醇（27.64%）、异丁醇（29.32%）和戊酸乙酯（26.72%）的抑制率远高于其他化合物；与对ADH活性的影响不同，除正丙醇外（抑制率＞7%），向白酒中添加醇类和酯类物质可提高ALDH的活性（抑制率＜0%），且不同风味化合物抑制率的差异与白酒的种类无关。在这些化合物中，正丁醇和乙酸乙酯对ALDH活性的抑制率相似，约为-8%～-10%。研究中的大多数风味化合物，尤其是JS中的异丁醇，都提高了ALDH活性。然而，由于底物浓度效应，其活性仍然受到抑制，乙醇的代谢速率依然很低。醇类物质抑制乙醇代谢关键酶的活性，降低乙醇的氧化速率，并且自身的氧化程度低于乙醇[25]，这可以部分解释为什么醇类物质含量不合理是酒后“上头”的原因。
图1 4种浓香型白酒中醇类、酯类对乙醇脱氢酶活性和乙醛脱氢酶活性的影响
Fig.1 Effects of alcohols and esters in four strong-flavor Baijiu on alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase activities
由于SC1中正戊醇、异丁醇和戊酸乙酯的抑制率远高于其他化合物，且SC1中正戊醇和戊酸乙酯的浓度高于其他3个浓香型白酒品种，探究了SC1中不同浓度的正戊醇、异丁醇和戊酸乙酯对ADH活性的影响，如图2a所示，并进行了相关性分析，结果如图2b～图2d所示，它们对ADH活性的抑制具有剂量依赖性的（相关系数R2均＞0.9）。
图2 不同浓度的风味化合物（a）、正戊醇（b）、异丁醇（c）和戊酸乙酯（d）对乙醇脱氢酶抑制率的影响
Fig.2 Effects of different concentrations of flavor compounds (a),1-pentanol (b),isobutanol (c) and ethyl pentanoate (d) on inhibition rate of alcohol dehydrogenase
综上可初步判断，研究中的风味化合物对ADH和ALDH活性的影响可分为三类：（1）绝大部分风味化合物抑制ADH活性，促进ALDH活性；（2）同时抑制ADH和ALDH活性，如正丙醇，它导致乙醇代谢受阻，乙醇大量积累；（3）轻度抑制或促进ADH活性，强烈促进ALDH活性，如乳酸乙酯，它将有利于提高饮后舒适度，以及降低乙醇、乙醛积累造成的患病风险。为了研究这些化合物对ADH活性影响和对ALDH活性影响之间的关系，进行了相关性分析，结果如图3所示。
由图3可知，这些化合物对ADH活性影响和对ALDH活性影响之间的相关性非常弱（相关系数R2＜0.15），这表明抑制（或促进）ADH活性的化合物不同于抑制（或促进）ALDH活性的化合物，尤其是在JS中（相关系数R2=0.054 7）。
图3 4个浓香型白酒中醇、酯类物质对乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶抑制率影响的相关性分析
Fig.3 Correlation analysis of effects of alcohols and esters on the inhibition rates of ethanol dehydrogenase and acetaldehyde dehydrogenase in four varieties of strong-flavor Baijiu
3 结论
本研究结合气相色谱、香气活力值以及体外酶学实验对4种浓香型白酒的风味化合物进行了研究，结果表明，酯类化合物是浓香型白酒中的关键香气成分，对浓香型白酒的风味形成有重要贡献，尤其是己酸乙酯（OAV≥7 284）、戊酸乙酯（OAV≥1 276）、丁酸乙酯（OAV≥845）；其次，多种酯类物质和醇类物质对ADH活性和ALDH活性的影响差异很大，对于ADH活性，除乳酸乙酯外，醇酯类物质通常抑制ADH活性，其中正戊醇、异丁醇和戊酸乙酯的抑制率最高，分别为27.64%、29.32%和26.72%，而对于ALDH活性，除正丙醇外，醇酯类物质会不同程度地促进ALDH活性。以上研究初步阐释了酒类风味物质对乙醇代谢关键酶作用效应，对于白酒酒体的设计与开发工作将有所启发。
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