奶酪含有丰富的营养物质，成品奶酪中的蛋白质含量比牛乳高了十倍左右[1]，而且奶酪中还含有丰富的矿物质元素、维生素以及胡萝卜素[2]。黑豆蛋白质的氨基酸组成和动物蛋白相似，其赖氨酸丰富并接近人体需要的比例，发酵后的黑豆不仅保留了黑豆原有的营养成分，而且黑豆中的大分子物质被分解成为小分子物质，一些不溶性的大分子物质可以被分解为可溶的小分子化合物，还能使豆乳中的抗营养物质被加以破坏，所以更容易被人体吸收[3]。
将黑豆豆乳代替一定量的牛乳，不仅可以缓解我国部分地方奶源不足的现况，而且可以将动物蛋白与植物蛋白相互补充，提高奶酪的营养价值。有关豆奶牛奶混合奶酪的研究较多，曹小飞等[4]通过响应曲面法对含豆乳的Mozzarella干酪的生产工艺参数进行了优化，万俊等[5]对牛乳豆乳混合Camembert干酪加工工艺进行研究，高允盛等[6]对添加限制性酶解豆乳制作模拟Mozzarella干酪优化工艺进行研究，赵平等[7]研究了添加豆乳对Mozzarella混合干酪微观结构、功能和质构特性的影响，谭淑君等[8]对添加15%黑豆乳牛乳混合奶酪成熟期间理化特性的变化进行了研究。但有关不同含量黑豆豆乳牛乳混合Mozzarella奶酪成熟期间品质变化的研究鲜见报道。因此，本研究将黑豆按照料水比15∶1 000（g∶mL）打成黑豆豆乳，再以2%、4%、6%的黑豆豆乳添加量加入牛乳中制作Mozzarella奶酪（按照Mozzarella奶酪的工艺进行），并对黑豆豆乳牛乳Mozzarella奶酪成熟过程中的水分活度、pH、质构、色泽、蛋白降解等品质指标进行评价，为黑豆豆乳奶酪的开发提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）：本学院实验室保藏；新鲜牛乳（密度1.030 g/mL，干物质含量11.05%，蛋白含量3.03%）：当地牧场；黑豆：当地超市；凝乳酶（酶活35 000 RU/g）：丹尼斯克（中国）有限公司；无水乙醇、亚甲基双丙烯酰、丙烯酰胺、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）、Tris碱、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、溴酚蓝、考马斯亮蓝（R型）、β-巯基乙醇、硫酸铵（ammonium sulfate，APS）（均为分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；甘油（分析纯）：华美生物工程有限公司；甲醇，冰乙酸（均为分析纯）：天津市瑞金特化学品有限公司。
1.2 仪器与设备
HH-S8型电热恒温水浴锅：北京科伟永兴仪器有限公司；SP-XC-ZK01台式真空包装机：晋中佳通机电科技有限公司；LC-406立式冷藏陈列柜：江苏阪神电器股份有限公司；LD5-2B低速离心机：北京雷勃尔医疗器械有限公司；HD-6型智能水分活度测量仪：无锡市华科仪器仪表有限公司；PHSJ-3F型pH计：上海精密科学仪器有限公司；DYY-6C型电泳仪：北京六一生物科技有限公司；CM-5型色差仪：柯尼卡美能达控股有限公司；TMS-Pro质构仪：美国Food Technology Corporation公司；奶酪槽：自制；DJ13B-D08EC九阳豆浆机：山东九阳股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 黑豆豆乳牛乳奶酪加工工艺流程
精选黑豆→室温浸泡（20 h）→磨浆（料水比15∶1 000）（g∶mL）→过滤→黑豆豆乳
牛乳→加入黑豆豆乳（2%、4%、6%）→混匀→杀菌（63 ℃，30 min）→冷却（40 ℃）→添加发酵剂（0.5%的混菌，嗜热链球菌∶保加利亚乳杆菌=1∶1）→发酵（40 ℃，30 min）→加凝乳酶（0.3%，40 ℃）→凝乳（40 ℃，30 min）→凝乳切割→排乳清→加盐（1.8%盐）→热烫拉伸成型（在热水中加8%的盐）→成熟（4 ℃）→黑豆豆乳牛乳奶酪
1.3.2 理化指标的测定
（1）水分活度的测定
将奶酪切成小碎块，将样品碎块铺在样品盒的三分之二处，用水分活度仪对奶酪碎块进行测定。
（2）pH的测定[9]
取不同成熟期的黑豆豆乳牛乳奶酪样品2.000 g，在每个样中加入20 mL的蒸馏水进行多次匀浆，测定不同样品不同成熟期的pH值。
（3）质构的测定[10-11]
取一定成熟期的样品，切成20 mm×20 mm×20 mm的小块，用质构仪进行质构检测，对不同成熟时期的四组奶酪样品的弹性、内聚性、咀嚼性、黏附性、硬度等特性进行测定。测定参数：6 mm的圆柱形探头，间隔时间：5 s，穿刺距离：12 mm，检测速度：60 mm/min，起始力：0.4 N，测后速度：200 mm/min。
（4）色差的测定
采用色差仪对奶酪样品进行3次平行测定，取平均值。样品切成1～2 mm厚度的薄片，色差仪以标准白板校准后测其色泽。结果用L*值、a*值、b*值表示，其中L*值为明亮度，在1～100之间且值越大，表示色泽越白；a*值为红绿值，a*值大于零时，表示色泽为红色，并且值越大，红度越深，a*值小于零时，表示色泽为绿色；b*值为黄蓝值，b*值大于零时，表示色泽为黄色，b*值小于零时，表示色泽为蓝色。
（5）蛋白质降解[12-13]
采用十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法测定降解蛋白质分子质量。分别配制5%的浓缩胶和12%的分离胶，Tris-甘氨酸（pH 8.9）电泳缓冲液，5.0 mol/L的尿素样品缓冲液。将奶酪样品用水研磨溶解后，离心后去除上层脂肪和沉淀，将溶液的蛋白含量调整为1.5 mg/mL，加入样品缓冲液、溴酚蓝、β-巯基乙醇混合均匀并加热煮沸，取10 μL混合溶液进样。浓缩胶电压80 V，分离胶电压120 V，电泳完成后将凝胶用考马斯亮蓝G250 染色。
2 结果与分析
2.1 黑豆豆乳牛乳奶酪成熟过程中水分活度的变化
由图1可知，黑豆豆乳牛乳奶酪在刚制作完成时，水分活度较高，是因为在制作奶酪的工艺中，由于排除乳清不够完全，而且在热烫挤压过程中，水分不能排除干净，所以，残留在黑豆牛奶奶酪中的水分还比较多。无论是对照组（不添加黑豆豆乳的牛乳奶酪）还是其他三组加入黑豆豆乳的奶酪，在成熟期间的水分活度整体呈现下降的趋势；而且在0～30 d，水分活度下降较快，而在成熟后期60～90 d水分活度下降较慢。在同一成熟期内，加入黑豆豆乳的量越多，水分活度越高。随着成熟时间的延长，添加黑豆豆乳奶酪的水分活度下降幅度较对照奶酪下降速度要快，成熟90 d后，对照组的水分活度下降0.022，2%组的水分活度下降0.031，4%组的水分活度下降0.032，6%组的水分活度下降0.033，随着豆乳添添加量的增多，水分活度下降也增加，与研究报道的在牛乳中添加豆乳增加了奶酪的水分活度相似[14]，这有可能是因为黑豆蛋白具有良好的保水性，持水能力很强，水分不易排除[15]。在奶酪成熟过程中水分活度下降，是因为蛋白质以及脂肪发生了分解，在化学键断裂时要与奶酪中的游离水进行结合；而且在奶酪成熟贮藏的过程中，水分也会逐渐蒸发；在奶酪成熟后期水分活度降低较少，是因为随着奶酪的成熟，奶酪的表面析出了一层游离油，从而减少了奶酪内部水分向外扩散，所以奶酪的水分活度变化量减少[16]，从而可以使奶酪保持一定的水分活度。从水分活度变化来看，为保证奶酪贮藏过程中的品质，延长保质期，黑豆豆乳添加量以2%为宜。
图1 各组奶酪成熟过程中水分活度的变化
Fig.1 Change of water activity of cheese during ripening process of each group
以不添加黑豆豆乳的奶酪作为对照。下同。
2.2 黑豆豆乳牛乳奶酪成熟过程中pH值的变化
pH值是指酸碱性，也就是指氢离子的浓度，主要是代表奶酪的酸度。由图2可知，加入黑豆豆乳奶酪与对照奶酪的pH变化趋势基本相同。刚制作好奶酪的pH是在6左右，在成熟30 d期间奶酪的酸度有明显的下降，从pH值6一直下降到5.6左右。pH下降的主要原因是乳酸菌的发酵，使乳糖转化为乳酸引起的。在30～60 d期间，pH开始处于上升阶段，这是因为此时乳糖已经被大量消耗[17]，乳酸菌活性下降且产生一些蛋白酶，蛋白酶将蛋白质分解，使其产生碱性物质氨基酸以及氨[18]，所以到30～60 d的时候，pH又逐渐上升。在60～90 d，各组样品的pH几乎处于稳定状态。当黑豆豆乳加入量为4%和6%时，整个成熟过程中奶酪的pH显著低于对照（P＜0.05），可能与黑豆豆乳促进奶酪中乳酸菌的发酵活性有关。从pH值变化来看，适宜的黑豆豆乳添加量为4%、6%。
图2 各组奶酪成熟过程中pH值的变化
Fig.2 Change of pH value of cheese during ripening process of each group
2.3 黑豆豆乳牛乳奶酪成熟过程中质构的变化
质构指标包括硬度、黏附性、弹性、咀嚼性、内聚性、胶粘性等，奶酪的质构的测定可以判断其品质的好坏，也可通过质构分析来判定人们对奶酪的喜欢程度。添加黑豆豆乳各组奶酪成熟过程中的质构指标变化结果见表1。
由表1可知，各组奶酪的硬度随着成熟时间的延长逐渐降低，奶酪成熟过程中蛋白质的水解作用导致其网状结构被破坏，进而其硬度不断降低[9]。成熟0 d时添加黑豆豆乳奶酪的硬度显著大于对照组（P＜0.05），成熟30 d后，添加豆乳4%、6%组奶酪的硬度显著高于对照组（P＜0.05），可能的原因是随着豆乳添加量的增多，奶酪中蛋白质的含量不断增加，经过热烫拉伸处理后，黑豆中的蛋白与牛奶中的酪蛋白分子链展开，这两种蛋白分子相互作用，形成紧密的网状结构，使奶酪的凝胶结构更致密[19]。
表1 各组奶酪成熟过程中质构指标的变化
Table 1 Change of texture indexes of cheese during ripening process of each group
注：同列不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
弹性是受到挤压形变后恢复原有形态的能力。由表1可知，各组奶酪的弹性都随着成熟时间的延长呈下降的趋势，成熟30 d前，各组奶酪的弹性差异不显著（P＞0.05），而成熟60 d时，添加4%豆乳奶酪的弹性显著高于其他组（P＜0.05），成熟90 d时，各添加豆乳奶酪的弹性显著高于对照组（P＜0.05）。说明添加黑豆豆乳对奶酪成熟前期的弹性影响不大，而在成熟后期对奶酪的弹性有显著影响（P＜0.05），可能是因为随着成熟过程中蛋白质的水解，其胶束结构逐渐减弱，黑豆豆乳牛乳奶酪中蛋白分子的网状结构相比于纯奶酪更加致密，其更容易恢复原有形态；此外，奶酪内部还发生着脂肪的水解，脂肪水解为游离脂肪酸，并且随着成熟时间的延长，游离脂肪酸的含量增加也影响奶酪的弹性。
黏附性反映了蛋白质分子间结合力的大小，值越大，咀嚼时的舒适感就越差。由表1可知，随着成熟的进行，对照组奶酪的黏附性不断下降，而添加黑豆豆乳的则呈现先下降后上升的趋势，同一成熟期内，添加豆乳奶酪的黏附性较对照增大，成熟0 d和60 d时4%组奶酪的黏附性显著高于对照（P＜0.05），成熟90 d时，添加豆乳奶酪的黏附性显著高于对照组（P＜0.05）。添加黑豆豆乳后，黑豆蛋白与酪蛋白的紧密结合使奶酪的黏附性增强，成熟后期由于乳酸菌代谢产生的胞外粘性物质的积累，导致奶酪的黏附性增强。
咀嚼性是固体食品的机械性能参数，与硬度、弹性、凝聚性有关，数值上等于胶粘性与弹性的乘积。各组奶酪在成熟期间咀嚼性整体呈下降趋势，在0 d时，由于刚经过热烫拉伸，其粘附性、弹性、硬度都较大，所以咀嚼性也较大。在0～90 d这个成熟时期内，奶酪内部发生各种生物化学反应，奶酪质地软化，黏附性、弹性、硬度降低，因此咀嚼性也降低。同一成熟期内，添加黑豆豆乳奶酪的咀嚼性高于对照组，成熟0 d时，4%、6%组奶酪的咀嚼性显著高于对照（P＜0.05），而成熟30 d后，添加黑豆豆乳奶酪的咀嚼性显著高于对照（P＜0.05）。
从质构指标变化来看，黑豆豆乳添加量4%为宜。
2.4 黑豆豆乳牛乳奶酪成熟过程中色泽的变化
奶酪的色泽变化可以作为一个指标来判断奶酪的品质，在四个不同的成熟时期（0 d、30 d、60 d、90 d）对奶酪的L*值、a*值、b*值进行测定，研究黑豆豆乳牛乳奶酪在成熟过程中色泽的变化，各组奶酪的色泽变化结果见表2。
表2 各组奶酪成熟过程中色泽的变化
Table 2 Change of color of cheese during ripening process of each group
由表2可知，四组奶酪在不同成熟时期的亮度值均呈现先下降后上升最后再下降的趋势。在0 d时四组奶酪的亮度值达到最大，并且添加黑豆豆乳的奶酪的亮度值均小于对照组（P＜0.05）。成熟60 d、90 d时，6%组奶酪的亮度显著低于对照（P＜0.05）。在成熟过程中，奶酪的红绿值也在不断变化，总体趋势都是先下降再上升，这是因为在成熟初期，即0～30 d，奶酪中的脂肪将呈色物质包埋，导致a*值＜0，色泽偏绿，此后在30～90 d脂肪被不断水解，呈色物质被释放，使得红绿值逐渐升高。成熟0、30 d、90 d时4%和6%组奶酪的红绿值显著高于对照（P＜0.05），成熟60 d时6%奶酪的红绿值显著高于对照（P＜0.05）。各组奶酪的黄蓝值b*值和红绿值a*值的趋势总体相同，即在成熟期间均呈现先下降后升高的趋势，但其b*值均大于零，成熟60 d时，6%奶酪的黄蓝值显著高于对照（P＜0.05），其他成熟时期，各组奶酪的黄蓝值差异不显著（P＜0.05）。成熟初期，由于奶酪内部进行的生化反应，导致b*值降低，此后，随着成熟时间延长，奶酪中的蛋白质和脂肪不断水解，使黄蓝值逐渐上升。
从色度指标变化来看，随着黑豆豆乳添加量的增加，奶酪的色度加深，不利于消费者接受，因而从色度分析黑豆豆奶添加量以2%、4%适合。
2.5 黑豆豆乳牛乳奶酪成熟过程中蛋白降解的变化
条带1、5、9、13为对照组，2、6、10、14为添加黑豆豆乳2%奶酪，3、7、11、15为添加黑豆豆乳4%奶酪，4、8、12、16为添加黑豆豆乳6%奶酪。
SDS-PAGE法对蛋白质分子质量的测定结果见图3。由图3可知，条带仅有几条，这是因为在制作奶酪的过程中排除了乳清，导致乳清蛋白大部分被排除，奶酪中只剩下酪蛋白、黑豆蛋白以及蛋白质在后续成熟过程中分解的产物。马凤燕[20]研究表明，奶酪在成熟的过程中蛋白质的降解主要是因为在奶酪中残留的凝乳酶以及发酵剂所释放出的蛋白酶的作用下，使蛋白质分解为小分子的肽，又在肽酶的作用下将小分子肽分解为氨基酸。
图3 各组奶酪成熟过程中蛋白质降解的变化
Fig.3 Change of protein degradation of cheese during ripening process of each group
由图3可知，四种奶酪在成熟的过程中蛋白质已经得到分解，是因为在蛋白酶、残留的凝乳酶以及发酵剂的作用下大分子的蛋白质被分解为小分子的肽以及氨基酸[20]。其中第一个条带是α-酪蛋白，α-酪蛋白被分解为αs1-酪蛋白以及αs2-酪蛋白，第二个条带代表β-酪蛋白在成熟的过程中分解的比较缓慢，底部的小条带代表蛋白质被分解为小分子的肽以及氨基酸。奶酪在成熟0 d时，α-酪蛋白以及β-酪蛋白含量较多，小分子肽的含量较少，说明只含有一些大分子质量的蛋白质，蛋白质还没有开始分解；奶酪在成熟30 d时，α-酪蛋白以及β-酪蛋白的含量还是较多，小分子肽的含量开始显现，说明大分子质量的蛋白质开始分解，小分子肽以及氨基酸开始形成；在成熟90 d 时，大分子的蛋白质降解比较多，条带越来越细，小分子肽以及氨基酸分子质量条带越来越明显；与已有相关研究结果相似[13，17]。而加入黑豆豆乳牛乳奶酪中的蛋白质降解都比较相似，但黑豆豆乳牛乳奶酪的条带较深，可能与凝乳过程中黑豆蛋白结合在酪蛋白中有关。
从降解蛋白质的分子质量变化来看，黑豆豆乳增加后不利于奶酪成熟过程中蛋白质的充分降解，为使奶酪成熟后蛋白质得到充分的降解，进而形成良好的质构特性和风味，黑豆豆乳添加量以2%、4%为宜。
3 结论
对黑豆豆乳牛乳奶酪在成熟期间水分活度、pH、质构特性、色泽、蛋白质降解进行分析，各个成熟期内，随着黑豆豆乳添加量的增加，奶酪的水分活度增大、pH降低。添加黑豆豆乳后奶酪的硬度、弹性、黏附性、咀嚼性均高于对照奶酪，添加黑豆豆乳后奶酪的亮度下降，红度和黄度值增加，而加入黑豆豆乳的奶酪在成熟过程中蛋白质降解与对照奶酪相似。综合各个指标，在牛乳中加入4%黑豆豆乳后，黑豆豆乳牛乳奶酪既有独特的风味，同时奶酪具有较好的色度、质构、蛋白降解特性，本研究为黑豆豆乳在奶酪中的应用提供了借鉴，同时为开发黑豆豆乳牛乳混合型奶酪提供了理论参考。
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